Консорциум штаммов, используемый для получения бифидосодержащей продукции
Владельцы патента RU 2467065:
Общество с ограниченной ответственностью "Бифилюкс" (RU)
Консорциум штаммов Bifidobacterium bifidum ВКПМ Ac-1875 и Bifidobacterium longum ВКПМ Ac-1876 активно размножается в питательных средах разного состава с накоплением производственной биомассы в короткие сроки культивировании, сквашивает молоко с образованием сгустка с хорошими вкусовыми и органолептическими свойствами, обладает кислотообразующей активностью, антагонистической активностью в отношении к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Это позволяет использовать консорциум штаммов при приготовлении бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств, обеспечивающих нормализацию микробиоценозов организма человека, в т.ч. желудочно-кишечного и урогенитального трактов, кожных и слизистых покровов, и расширит арсенал средств коррекции микрофлоры человеческого организма. 2 табл., 6 пр.
Изобретение относится к пищевой, биотехнологической и медицинской, косметической промышленности, в частности используется для приготовления кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов.
В связи с неблагоприятными экологическими условиями, стрессами, длительной антибактериальной, лучевой и химиотерапией, дисбиозами, возникающими вследствие перенесенных заболеваний, увеличивается количество людей страдающих нарушениями нормальной микрофлоры организма. Для лечения и профилактики этих нарушений все большее внимание уделяется как препаратам, обладающим пробиотическим действием, так и пищевым продуктам, содержащим представителей нормальной микрофлоры кишечника - бифидобактерии.
Наиболее типичными для организма человека являются пять видов бифидобактерии - B.bifidum, B.longum, B.adolescentis, B.breve, B.infantis. С наибольшей частотой в биоценозе обнаруживаются виды B.bifidum и B.longum (до 75%). Вид B.adolescentis встречается в основном у взрослых людей, виды B.breve и B.infantis - преимущественно у детей грудного возраста.
Известны зарубежные моно- и комплексные препараты-эубиотики и кисломолочные продукты, включающие в свой состав бифидобактерии видов B.bifidum, B.lonqum, B.adolescentis, B.breve (патент №2336886, патент №2411008, Франция; патент №637297, Швейцария; патент №2134179, патент №2421066 ФРГ; патент №05227946, патент №0430642, Япония; патент №4645667, США).
У нас в стране для приготовления бактерийных препаратов и продуктов лечебно-диетического питания применяют отечественные штаммы бифидобактерий видов B.bifidum №1,791,792, ВКПМ S-1257, Ac-1578; B.lonqum B379M, B.adolescentis MC-42, В.breve 79-119, В.infantis 79-43 (авторское свидетельство №343588, патент РФ №2215028, патент РФ №1347221, патент РФ №849779, патент РФ №2108383, патент РФ №2152993, патент РФ №2216589, патент РФ №863639, патент РФ №2078814, патент РФ №2111248).
Качество лечебных продуктов и препаратов во многом обусловлено свойствами штамма-продуцента, его специфической активностью и технологичностью. Использование многоштаммовых композиций позволит суммировать полезные свойства, присущие отдельным штаммам, заселять организм человека теми из них, которые наиболее физиологичны для каждого индивидуума. Это делает возможным разработку комплексных продуктов лечебного питания и бактерийных препаратов, способных обеспечить высокую колонизационную резистентность организма человека, восстанавливать его нарушенную микрофлору и способствовать снижению заболеваемости.
Задачей настоящего изобретения являлось получение консорциума штаммов Bifidobacterium bifidum B-UH, Bifidobacterium longum B-NH, имеющего высокую биологическую активность, стабильное кислотообразование, способного хорошо расти при культивировании в искусственных питательных средах и молоке, устойчивого к условиям внешней среды и обладающего антагонистической активностью по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре.
Консорциум получен путем сочетания двух штаммов, относящихся к видам бифидобактерий, наиболее часто встречающимся в организме человека, Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium longum.
Штамм Bifidobacterium bifidum B-UH выделен от здорового ребенка грудного возраста, депонирован в ВКПМ, ФГУП ГосНИИгенетика, коллекционный номер Ас-1875.
Штамм Bifidobacterium longum B-NH выделен от здорового ребенка грудного возраста, депонирован в ВКПМ, ФГУП ГосНИИгенетика, коллекционный номер Ас-1876.
Заявляемый консорциум штаммов Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium longum может быть использован при производстве кисломолочной продукции, заквасок, ферментированных пищевых продуктов, например: квас, пиво и т.п., неферментированных пищевых продуктов, например: соки, напитки и т.п. Так же консорциум штаммов бифидобактерий может широко использоваться для производства гигиенических и косметических средств, например: кремов, лосьонов, салфеток, мыла, присыпок, тампонов, питательных масок, гелей, женских прокладок, косметического молочка, различных пудр и т.д. Кроме того, консорциум штаммов бифидобактерий может быть применен в производстве бактериальных препаратов, в виде свечей, пероральных и других средств.
Техническим результатом заявленного изобретения является консорциум штаммов Bifidobacterium bifidum B-UH, Bifidobacterium longum B-NH, используемый в качестве биологически активного вещества для получения кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов. Консорциум штаммов обладает биологически и технологически значимыми свойствами, такими как кислотообразующая активность, способность наращивать микробную биомассу в различных питательных средах. Консорциум антагонистически активен по отношению к патогенным и условно-патогенной микроорганизмам.
Культурально-морфологические признаки консорциума.
Клетки штаммов консорциума бифидобактерий представляют собой грам+ полиморфные палочки с бифуркацией или утолщением на 1-2-х концах, склонные к образованию скоплений. В полужидких питательных средах растут по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза. Отдельно выросшие колонии в Бифидум-среде имеют удлиненную и шарообразную форму. Логарифмическая фаза роста заканчивается к 12-16 часам культивирования.
Физиолого-биохимические признаки консорциума.
Неподвижные, бесспоровые анаэробы. Оптимальная температура выращивания - (38±1)°C, pH питательных сред - 7.2-7,4. Каталазу не образуют, желатину не разжижают. Сбраживают глюкозу с образованием уксусной и L+ молочной кислоты без образования газа, закисляя среду выращивания до pH 4,2-3,4. Консорциум штаммов активно размножается на средах разного состава, а так же в молоке, сквашивая его к 12-18 часам культивирования. Это позволит широко использовать консорциум штаммов бифидобактерий в различных технологических процессах (Таблица 1).
| Таблица 1. | |||||||
| Накопление микробной массы (КОЕ/мл lg 10) и активность кислотообразования (в градусах Тернера) консорциума штаммов бифидобактерий в динамике развития при культивировании в гидролизатно-молочной питательной среде (ГМ), Бифидум-среде (БФ) и молоке (М). | |||||||
| ПИТАТЕЛЬНАЯ | ВРЕМЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ | ||||||
| СРЕДА | 12 ч | 24 ч | 48 ч | ||||
| КОЕ | °T | КОЕ | °T | КОЕ | °T | ||
| ГМ | 8,6 | 98 | 9,8 | 146 | 7,2 | 194 | |
| БФ | 8,0 | 88 | 8,8 | 118 | 7,0 | 162 | |
| М | 8,4 | 82 | 9,2 | 110 | 7,6 | 156 |
| Таблица 2. | |||||
| Антагонистическая активность штаммов Bifidobacterium bifidum B-UH, Bifidobacterium longum B-NH по отдельности и в составе консорциума | |||||
| Штамм | Зона задержки роста тест-культур мм/M±m | ||||
| Sh.sonnei | Sh.flexneri | E.coli | S.aureus | Pr.vulgaris | |
| В.bifidum B-UH | 22±2,0 | 25±1,8 | 18±1,6 | 20±1,2 | 25±1,4 |
| В.longum B-NH | 28±1,6 | 22±1,4 | 20±2,2 | 16±1,8 | 26±1,2 |
| Консорциум | 34±0,8 | 28±2,2 | 32±1,8 | 32±1,4 | 36±1,6 |
Консорциум штаммов бифидобактерий способен наращивать микробную массу в питательных средах, сквашивать молоко в короткие сроки культивирования, проявлять специфическую активность. Это делает возможным его использование в приготовлении кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов.
Пример №1. Получение и использование консорциума для приготовления кисломолочного продукта
| 1-ый пассаж | Лиофилизированные штаммы Bifidobacterium bifidum B-UH, Bifidobacterium longum B-NH в количестве 0,1 г сухой биомассы (1 доза) вносят по отдельности в среду выращивания и титруют методом десятикратных разведении до 10-7-9. Выращивают при температуре (38±1)°C до появления отдельных колоний в последнем разведении. Или 1 дозу сухой биомассы каждого штамма вносят в 20-30 мл питательной среды. Культивируют до получения биомассы с содержанием клеток микроорганизмов не менее 108/мл. |
| 2-ой пассаж | Выращенную культуру каждого из штаммов объемом не более 10% вносят в среду накопления и культивируют при температуре (38±1)°C до получения биомассы с содержанием микробных тел не менее 108/мл. |
| 3-ий пассаж (продукт) | Полученную биомассу каждого из штаммов смешивают, получая консорциум, и в объеме не более 5% вносят в стерильное молоко и культивируют до образования сгустка. Получают готовый кисломолочный продукт с нежным вкусом густой однородной консистенции с |
| содержанием не менее в 1 мл 10 живых бифидобактерий. |
Пример №2. Получение и использование консорциума для приготовления ферментированных и неферментированного пищевых продуктов
| 1-ый пассаж | Лиофилизированные штаммы Bifidobacterium bifidum B-UH, Bifidobacterium longum B-NH в количестве 0,1 г сухой биомассы (1 доза) вносят по отдельности в среду выращивания и титруют методом десятикратных разведении до 10-7-9. Выращивают при температуре (38±1)°C до появления отдельных колоний в последнем разведении. Или 1 дозу сухой биомассы каждого штамма вносят в 20-30 мл питательной среды. Культивируют до получения биомассы с содержанием клеток микроорганизмов не менее 107/мл. |
| 2-ой пассаж | Выросшую культуру каждого из штаммов объемом не более 10% вносят в среду накопления и культивируют при температуре (38±1)°C до получения биомассы с содержание микробных тел не менее 107/мл. |
| Получение ферментированного или неферментированного пищевого продукта | Полученную биомассу смешивают, получая консорциум, вносят в пищевое сырье (молоко, соки, пиво, квас и пр.), перемешивают и разливают в емкости. В результате получают продукт с титром клеток микроорганизмов не менее 106 в 1 мл. |
Пример №3. Получение и использование консорциума штаммов бифидобактерий для приготовления биологически активной добавки
| Получение жидкой биологически активной добавки (БАД) | Штаммы микроорганизмов Bifidobacterium bifidum B-UH, Bifidobacterium longum B-NH 1-2- их пассажей (пример 1) смешивают, получая консорциум, вносят в питательную среду объемом не более 5%, выращивают до получения биомассы с содержанием микробных тел в 1 мл не менее 108 и разливают в емкости. В результате получают биологически активную добавку, которая представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 108/мл содержанием штаммов микроорганизмов. |
| Получение сухой биологически активной добавки (БАД) | В жидкую биологически активную добавку вносят защитные среды высушивания (сахароза 80% и желатина 8% в объеме 10-12%, обезжиренное молоко до 20%). Полученную суспензию разливают по 1-5 мл (1-5 доз) в ампулы или пенициллиновые флаконы, замораживают при t (40-45)°C и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученная сухая биологически активная добавка в 1 дозе содержит не менее 107 живых клеток микроорганизмов. |
Пример №4. Получение и использование консорциума штаммов бифидобактерий для приготовления бактерийного препарата
Штаммы Bifidobacterium bifidum B-UH, Bifidobacterium longum B-NH 1-2-их пассажей (пример 1) вносят по отдельности в питательную среду объемом не более 5%, выращивают при температуре (38±1)°C до получения микробной массы с содержанием микроорганизмов не менее 108/мл. Выращенную биомассу смешивают, получая консорциум штаммов, добавляют защитные среды высушивания (сахароза 80% и желатина 8% в объеме 10-12%, обезжиренное молоко до 20%). Полученную суспензию разливают по 1-5 мл (1-5 доз) в ампулы или пенициллиновые флаконы, замораживают при t (40-45)°C и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат (консорциум) в 1 дозе содержит 107 живых клеток микроорганизмов. Согласно НТД на препараты нормальной микрофлоры человека допускается содержание в 1 дозе не менее 10 живых клеток микробных тел.
Пример №5. Получение и использование консорциума штаммов для приготовления гигиенических и косметических средств.
Штаммы Bifidobacterium bifidum B-UH, Bifidobacterium longum B-NH 1-2-их пассажей (пример 1) вносят по отдельности в питательную среду объемом не более 5%, выращивают при температуре (38±1)°C до получения микробной массы с содержанием живых клеток не менее 108/мл.
Получение продукта: выросшую биомассу смешивают, получая консорциум, и вводят в состав крема или мыла в количестве не более 1%.
Пример №6. Получение и использование консорциума штаммов бифидобактерий для приготовления закваски
Лиофилизированные штаммы Bifidobacterium bifidum B-UH, Bifidobacterium longum B-NH в количестве 0,1 г (1 доза) сухой биомассы вносят по отдельности в 20-30 мл питательной среды. Выращивают до получения биомассы с содержанием микроорганизмов не менее 107/мл.
Получение закваски. Выросшую культуру штаммов микроорганизмов смешивают, получая консорциум, и объемом не более 10% вносят в среду накопления. Культивируют при температуре (38±1)°C до получения биомассы (закваски) с содержанием микробных тел не менее 108/мл.
Таким образом, предлагаемый консорциум активно размножается в питательных средах с накоплением производственной биомассы в короткие сроки культивирования, сквашивает молоко с образованием сгустка, обладает специфической активностью.
Полученный консорциум можно рекомендовать для приготовления кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, биологически активных добавок, бактерийных препаратов, гигиенических и косметических средств.
Клиническая эффективность консорциума проводилась в составе жидкой биологически активной добавки - «Нормофлорин Д» на базе Московской медицинской Академии имени И.М.Сеченова. Под наблюдением находились 40 взрослых людей с воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК) - язвенный колит, Болезнь крона, хронический колит. Больные, наряду с базисной терапией, получали «Нормофлорин Д» по 1 столовой ложке перед едой в течение 30 дней. Контрольная группа людей не принимали «Нормофлорин Д». В результате у больных на фоне получения биодобавки «Нормофлорин Д» отмечено значительное снижение отрицательных проявлений диспепсического синдрома (тошнота, отрыжка, снижение аппетита), абдоминального синдрома (вздутие живота, метеоризм, частота и характер стула). Нежелательные явления при приеме «Нормофлорин Д» не наблюдались.
Консорциум штаммов Bifidobacterium bifidum ВКПМ Ac-1875 и Bifidobacterium longum ВКПМ Ac-1876, используемый для получения бифидосодержащей продукции.
