Способ очистки раствора тромбина от инфекционных частиц



Способ очистки раствора тромбина от инфекционных частиц
Способ очистки раствора тромбина от инфекционных частиц
Способ очистки раствора тромбина от инфекционных частиц
Способ очистки раствора тромбина от инфекционных частиц
Способ очистки раствора тромбина от инфекционных частиц
Способ очистки раствора тромбина от инфекционных частиц
Способ очистки раствора тромбина от инфекционных частиц
Способ очистки раствора тромбина от инфекционных частиц
Способ очистки раствора тромбина от инфекционных частиц
Способ очистки раствора тромбина от инфекционных частиц
Способ очистки раствора тромбина от инфекционных частиц
Способ очистки раствора тромбина от инфекционных частиц
Способ очистки раствора тромбина от инфекционных частиц
Способ очистки раствора тромбина от инфекционных частиц
Способ очистки раствора тромбина от инфекционных частиц
Способ очистки раствора тромбина от инфекционных частиц

 

C07K1/34 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2468032:

ОМРИКС БИОФАРМАСЬЮТИКАЛС ИНК. (US)

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ очистки раствора тромбина от инфекционных частиц. Добавляют в исходный раствор тромбина макромолекулы. Затем пропускают полученный раствор через нанофильтр, получая раствор тромбина, очищенный от инфекционных частиц. При этом указанная макромолекула не является неионным сурфактантом, отлична от тромбина и может быть выбрана из полимера, содержащего по меньшей мере 3 мономеров сахара, аминокислот, гликолей, спиртов, липидов или фосфолипидов. Также предложен раствор, содержащий тромбин, полученный указанным способом. Изобретение способствует повышению эффективности удаления инфекционных частиц из раствора тромбина. Выход тромбина с использованием предложенного способа достигает 93%. 2 н. и 18 з.п. ф-лы, 2 ил., 13 табл.

 

Область изобретения

Данное изобретение относится к очистке растворов белков. В частности, изобретение относится к очистке растворов белков от инфекционных частиц путем нанофильтрации.

Предшествующий уровень техники

Человеческая кровь является источником широкого круга медицинских продуктов, использующихся в лечении приобретенных и/или наследственных гематологических нарушений и угрожающих жизни заболеваний. Примерами таких продуктов являются иммуноглобулин, фактор VIII, альбумин, α1-антитрипсин, антитромбин III, фактор IX, фактор XI, концентраты факторов протромбиназного комплекса, фибриноген и тромбин.

Поскольку человеческая кровь - исходное сырье для этих продуктов, может содержать инфекционные агенты, которые отвечают за передачу серьезных заболеваний, стерильность продуктов является главным требованием. Предпринимают большие усилия, чтобы инактивировать и/или удалить инфекционные агенты, такие как вирус гепатита, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), возбудитель трансмиссивной губчатой энцефалопатии (ТГЭ), которые могут присутствовать в таких препаратах.

Вирусы с липидными оболочками могут быть эффективно инактивированы воздействием на обрабатываемый материал органическими растворителями и поверхностно-активными веществами, как описано например в ЕР 0131740 и US 4481189. Однако поскольку обработка такими растворителями и детергентами не оказывает существенного влияния на безоболочечные вирусы или на возбудитель ТГЭ, должны применяться другие способы инактивации, такие как пастеризация, гамма- или ультрафиолетовое (<280 нм) излучение или нанофильтрация.

Среди данных способов инактивации нанофильтрация является наиболее мягкой. Существует два технологических процесса нанофильтрации: тупиковый поток и тангенциальный поток.

(1) Тупиковый поток - жидкость направляется на мембрану под давлением, частицы с размерами больше размеров пор мембраны накапливаются на поверхности мембраны, тогда как молекулы меньшего размера проходят через нее.

(2) Тангенциальный поток (нанофильтрация с тангенциальным потоком, тангенциальная нанофильтрация, ТНФ) - жидкость нагнетается по касательной к поверхности мембраны, что образует разность давлений поперек мембраны, позволяющую частицам меньше размера пор проходить через мембрану, тогда как более крупные частицы продолжают стекать вдоль мембраны с тангенциальным потоком. Тангенциальный поток не позволяет задержанным молекулам накапливаться на поверхности мембраны.

DiLeo A.J. с соавт.(1992) Biotechnology 10:182-188 описывает удаление из раствора вирусных частиц малого диаметра (<30 нм), таких как фаг φХ174, с помощью мембраны Viresolve/70™. Чтобы определить, в какой мере адсорбция частиц способствует удалению вирусных частиц, к раствору вирусных частиц добавляли человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) в концентрации 2,5 мг/мл, чтобы за счет конкуренции снизить адсорбцию вирусных частиц на мембране. Было обнаружено, что в присутствии белка ЧСА задержка вирусных частиц возрастает на 0,5-0,7 log. Авторы утверждают, что данные результаты указывают на то, что способность мембраны задерживать частицы прежде всего зависит от просеивающих свойств мембраны и увеличение задержки вирусных частиц, скорее всего, является результатом концентрационной поляризации белка на поверхности мембраны.

DiLeo AJ. с соавт. (1993) Biologicals 21:275-286 описывает дальнейшие эксперименты, проведенные с мембраной Viresolve/70™. Было еще раз показано, что присутствие белков увеличивает степень задержки модельных вирусов в соответствии с концентрационной поляризацией, где заряженный белок вносит дополнительное сопротивление прохождению вирусов через мембрану.

Hoffer L. с соавт. (1995) J. Chromatography 669:187-196 описывает очистку фактора IX из человеческой плазмы и удаление вирусов с применением мембраны Viresolve/70™. Наименьшим из измеренных вирусов был собачий парвовирус (16-18 нм в диаметре), который был удален с эффективностью, выраженной как логарифм снижения концентрации (LRV от англ. log reduction value), равной 5,2. Выход фактора IX в среднем составил 83±9%.

В публикации WO 96/00237 (Winge) описан способ фильтрации вирусных частиц из раствора, содержащего макромолекулы, преимущественно белки, полисахариды и полипептиды, путем увеличения содержания соли в растворе от 0,2 моль до насыщения раствора соответствующей солью. Способ уменьшает продолжительность обработки и степень разведения раствора при фильтрации вирусов и оптимизирует выход при фильтрации вируса. Описанный способ обеспечивает фильтрацию вирусов с помощью так называемой методики «тупиковый поток», которая дает несколько производственных и экономических преимуществ по сравнению с обычно применяющейся методикой тангенциальной фильтрации вирусов.

В публикации US 6,096,872 (Van Holten и соавт.) описан способ нанофильтрации анти-D иммуноглобулина в буферном растворе с высокой ионной силой и таким наполнителем, как полисорбат 80™. Дополнительные этапы включают диафильтрацию для того чтобы сконцентрировать анти-D белок и снизить концентрацию присутствующего наполнителя. В частности, способ включает следующие этапы: а) фракционирование человеческой плазмы в спирте; б) ресуспендирование полученного Преципитата II; в) смешивание ресуспендированного Преципитата II с буферным раствором с высокой ионной силой, содержащим наполнитель; г) проведение нанофильтрации иммуноглобулина.

В публикации US 6,773,600 (Rosenblatt и соавт.) описан способ очистки белкового материала, такого как иммуноглобулин, для удаления примесей, таких как патогенные вирусы, состоящий из следующих этапов:

а) смешивание белкового материала с:

1) буферным раствором с низким рН, низкой проводимостью, предназначенным для снижения рН между 5.0 и 6.0 и для достижения ионной силы менее 30 mS/см;

2) неионным поверхностно-активным веществом;

3) клатратным модификатором и

б) проведение нанофильтрации белкового материала для получения очищенного материала, по существу свободного от вирусных частиц.

Предпочтительно, чтобы клатратный модификатор представлял собой полиол или сахарный спирт, имеющий от 4 до 8 гидроксильных групп.

Сущность изобретения

В одном аспекте изобретения предложен способ очистки раствора белка от инфекционных частиц. Способ включает:

(а) добавление макромолекул к раствору белков и

(б) пропускание раствора через нанофильтр,

получая таким образом раствор белков, по существу очищенный от инфекционных частиц.

В другом аспекте изобретения предложен способ увеличения эффективности удаления инфекционных частиц из раствора белка с помощью нанофильтрации, включающий добавление макромолекул к раствору до и/или во время нанофильтрации.

Термин «инфекционная частица» относится к микроскопической частице, такой как вирус или прион, которая способна заражать клетки биологического организма и размножаться в них. В одном воплощении инфекционные частицы - это вирусные частицы. Инфекционные частицы, подлежащие удалению, имеют размер от 15 до 80 нм. В другом воплощении инфекционные частицы имеют размер больше 80 нм.

Термин «раствор белка» относится к гомогенной смеси, состоящей из одного или более белков, растворенных в другом веществе. В одном воплощении раствор, содержащий белок, берет начало из цельной крови. В другом воплощении раствор представляет собой плазму. Другими возможными источниками белков могут быть животные белки и рекомбинантные белки, произведенные в культуре клеток или трансгенными животными.

Белки, которые могут быть очищены способом по настоящему изобретению, включают все белки, используемые в терапевтических целях, которые могут содержать инфекционные частицы и которые фильтруются через фильтр, удаляющий инфекционные частицы. В одном воплощении белки имеют молекулярный вес менее 180 кДа. В другом воплощении белки имеют молекулярный вес менее 160 кДа. В следующем воплощении белки имеют молекулярный вес менее 150 кДа или менее 140 кДа.

Эти белки включают:

коагуляционные факторы, например: факторы IX/IXa, фактор VIII, протромбин/тромбин, фактор VII/VIIa, фактор Х/Ха, фактор XI/XIa, фактор XII/XIIa, прекалликреин, высокомолекулярный кининоген, плазминоген, урокиназу, ингибитор протеина С;

противосвертывающие факторы или субъединицы, например протеин С, протеин S, антитромбин III, кофактор гепарина II, альфа2-антиплазмин, протеин Z;

факторы роста, например инсулиноподобный фактор роста 1 (ИФР-1), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ);

нейротропные фактор, например: фактор роста нервной ткани (ФРН), глиальный нейротрофический фактор (ГНФ);

гормоны, например: эритропоэтин, гормон роста

интерфероны и интерлейкины, например: интерферон альфа, бета и гамма, интерлейкин 1, 2, 3 и 7;

рекомбинантные белки, например; рекомбинантные факторы свертывания или противосвертываюшие факторы, рекомбинантный гормон роста,

но не ограничиваются перечисленными.

В одном воплощении белок представляет собой заряженный белок. Заряженный белок относится к гидрофильным молекулам.

Выход белка с использованием способа данного изобретения высокий и может составлять по меньшей мере 59, 65, 71, 72, 80, 81, 84, 85, 87, 93, 94, 96 или 100%. Средний выход белка с использованием способа данного изобретения оказывался в пределах 75-93%.

Термин «по существу очищенный» относится к эффективности удаления инфекционных частиц. В одном воплощении эффективность удаления инфекционных частиц составляет более 4 LRV (логарифм снижения концентрации) или около 5, 6, 7 или 8 LRV.

Определение термина «макромолекула» подразумевает общепринятые полимеры и биополимеры, а также неполимерные молекулы с большой молекулярной массой. Макромолекула, которая может использоваться в способе данного изобретения, должна обладать в одном воплощении - по меньшей мере одним из следующих свойств, в другом воплощении - двумя свойствами, а в следующем воплощении - всеми из перечисленных свойств:

- биосовместимость - нетоксичность;

- отсутствие взаимодействовий с белком, подвергающимся очистке;

- растворимость в воде.

Макромолекула, согласно изобретению, может быть полимером из по меньшей мере 3 мономеров сахаров, аминокислот, гликолей, спиртов, липидов или фосфолипидов. В одном воплощении макромолекула представляет собой полимер из по меньшей мере 6 мономеров. В другом воплощении макромолекула представляет собой полимер из по меньшей мере 9 мономеров. В следующем воплощении макромолекула представляет собой полимер из по меньшей мере 12 мономеров. Примеры макромолекул согласно данному изобретению включают белки (например, альбумин, желатин), полисахариды (например, декстран, хитозан, карраген), полимеры сахарных спиртов (например, полимер маннитола), фосфолипиды, поливинилпирролидон (ПВП), полиэтиленгликоль (ПЭГ), производные целлюлозы, полимеры винила и полигликоли. Макромолекула не содержит полиол или сахарный спирт, имеющий от 4 до 8 гидроксильных групп или неионное поверхностно-активное вещество.

В одном воплощении изобретения макромолекула представляет собой альбумин. В другом воплощении изобретения макромолекула представляет собой декстран. Молекулы декстрана могут иметь различный молекулярный вес, например, в диапазоне 5-80 кДа или около 5, 25 и 80 кДа.

В одном воплощении макромолекулы могут быть добавлены в области концентраций от значений более 0,01 мг/мл и до значений менее или равных 2 мг/мл. В другом воплощении макромолекулы добавляют в области концентраций от значений более 0,15 мкМ и до значений менее или равных 31 мкМ. В следующем воплощении макромолекулы добавляют в концентрации меньшей, чем концентрация раствора белка.

Нанофильтрация относится к процессу разделения под давлением, который может протекать на селективном разделяющем слое, образованном полупроницаемой мембраной. Движущей силой процесса разделения является разность давлений между стороной, с которой входит подаваемый поток (ретентат) и стороной фильтрата (пермеата) на разделяющем слое мембраны.

В одном воплощении изобретения нанофильтр, который может использоваться в способе изобретения, может отсекать частицы размером более 104 Дальтон. В другом воплощении этот предельно допустимый размер может быть более 105 Дальтон. В другом примере отсечка происходит в области 104 Дальтон и 3×105 Дальтон. В одном воплощении нанофильтр представляет собой мембрану Viresolve/70™ или Viresolve/180™.

Раствор пропускают через нанофильтр в соответствии со стандартными методами фильтрации. Например, раствор могут пропускать через нанофильтр либо по методу тангенциальной нанофильтрации, либо по методу тупикового потока. В раствор белка также могут добавлять стабилизаторы, такие как маннитол, и соли.

Другим аспектом изобретения является раствор белка, очищенный от инфекционных частиц по способу изобретения.

Краткое описание чертежей

Для понимания изобретения и того, как оно может быть воплощено в практику, ниже описаны примеры воплощений, которыми возможные воплощения не ограничиваются, со ссылками на приводимые рисунки, где:

Фиг.1 представляет собой схематичную диаграмму, иллюстрирующую сборку мембранной системы Viresolve/70™

Фиг.2 представляет собой график, демонстрирующий эффект концентрации ЧСА (человеческого сывороточного альбумина) на эффективность удаления парвовируса MVM(p) (выраженную в LRV) при фильтрации через Viresolve/70.

Описания заявок, патентов и публикаций, упомянутых выше или ниже, включены сюда во всей их полноте путем ссылок.

Данные примеры являются иллюстративными, но не исчерпывающими.

Подробное описание примерных воплощений

Материалы и методы

Вирусы и клетки

Клетки

А9 (АТСС-CCL1.4), клеточную линию фибробластов мыши, поддерживали в среде. Игла в модификации Дюльбекко (DMEM) с добавлением 2 мМ L-глутамина, 1% раствора пенициллина, стрептомицина и амфотерицина В, 0,1% раствора гентамицина сульфата и 5% эмбриональной сыворотки телят (FCS) (Biological Industnes).

FrhK-4 (Wallace R.E. и соавт. In vitro 8:333-341, 1973), постоянную клеточную линию из почек макаки резус, выращивали в DMEM с 4,5 г/л глюкозы, 110 мг/л пирувата натрия и 1,1 г/л бикарбоната натрия с добавлением 4 мМ глутамина, 1% заменимых аминокислот и 10% FCS.

Вирусы

Парвовирус мыши MVM(p) был любезно предоставлен профессором Яковом Талем (Jacov Tal, университет Бен-Гурион) и культивировался в клетках А9. Продукцию вируса производили, как это было описано ранее (Tattersall Р, Bratton J. (1983)). Клетки А9 инфицировали MVMp с множественностью заражения (MOI), равной 0,1-1. При достижении цитопатического эффекта, например, когда от поверхности отделялось около 30% клеток, клетки и среду собирали и центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин при 4°С. Клеточный осадок затем ресуспендировали в буфере TNE (Трис-HCl 50 мМ рН 7,2, NaCl 150 мМ, ЭДТА 50 мМ) и вновь центрифугировали при 1000 g, как описано выше. Процедуру повторяли 3 раза. В конце последнего этапа центрифугирования клеточный осадок ресуспендировали в буфере TNE (Трис-HCl 50 мМ рН 8,7, ЭДТА 0,5 мМ), а затем подвергали 3 циклам замораживания в жидком азоте и оттаивания при комнатной температуре. Для выделения вируса разрушенные клетки подвергали центрифугированию при 20000 g в течение 10 мин при 4°С. Супернатант, содержащий вирус, разливали по аликвотам и хранили при -70°С. Перед использованием исходный препарат вируса пропускали через фильтр с порами 0.2 мкм (Minisart, Sartonus), а затем через фильтр с порами 0.1 мкм (Durapore, Millipore).

Вирус гепатита А (ВГА) (НМ175) (Cooper P et al, 1978) продуцировали в супернатанте инфицированных клеток FrhK-4. После осветления при 3500 об/мин в течение 15 мин (Sigma 3K2) клетки собирали и ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS), обрабатывали ультразвуком и осветляли при 2500 об/мин в течение 10 мин. Затем супернатант разливали по аликвотам и хранили при менее -70°С. Супернатант после первого центрифугирования концентрировали ультрацентрифугированием при 19000 об/мин в течение 7 часов при 4°С (Beckman R19). Осадок ресуспендировали в PBS, разливали по аликвотам и хранили при -70°С.

Титрование вируса и определение логарифма снижения концентрации LRV

Титр исходного препарата вируса MVM(p) и всех исследуемых образцов определяли с помощью теста на TCID50 (от 50% tissue culture infective dose, доза, инфицирующая 50% тканевой культуры). Разведения вируса/образцов делали в серии 2-кратных разведении в 96-луночном планшете с использованием питательной среды А9 в качестве разбавителя (конечный объем 50 мкл) В каждую лунку добавляли 100 мкл клеток А9 (5×103) и планшеты инкубировали при 37°С в течение 7-10 дней. Образцы, содержащие вирус MVM(p) в высоком титре, предварительно разводили для количественного определения в вышеупомянутом тесте. Каждую лунку тестировали на инфекционность и выражали титр как дозу, инфицирующую 50% тканевой культуры на миллилитр (TCID50/мл) по формуле Spearman-Karber. Титры ВГА в образцах определяли как описано выше, с незначительными изменениями; клетки FrhK-4 использовали в концентрации 1×104 на лунку и инфекционность определяли примерно на 10-12 день после заражения.

В случае если в исследуемом образце не удавалось определить инфекционность, в определение брали либо больший объем образца в минимальном нецитотоксическом разведении, либо подвергали ультрацентрифугированию большое количество образца (Beckman с ротором R19 при 19000 об/мин в течение 15 часов при 4°С) и инфекционность определяли во всем объеме.

LRV рассчитывали по следующей формуле:

LRV = log (титр вируса в первом образце × объем образца) - log (титр вируса во втором образце × объем образца)

Нагрузка вирусами

В образцы, использованные в экспериментах с фильтрацией с помощью Viresolve/70™, вносили MVM(p) или ВГА, чтобы достичь конечную концентрацию выше 1×105 TCID50 единиц/мл. Доля вносимого материала не превышала 10%. Нагруженные вирусом растворы до фильтрации через Viresolve/70™ фильтровали через фильтр с порами 0,2 мкм (Millipak 40, Millipore).

Определение тромбина

Определение активности тромбина проводилось согласно протоколу Европейского Фармакопейного Теста (0903/1997) с небольшими изменениями. Калибровочную кривую (4-10 МЕ/мл) получали при смешивании стандарта тромбина с раствором фибриногена (Enzyme Research Laboratories, Ltd) с содержанием фибриногена 0,1%. Концентрация тромбина в образце рассчитывалась по калибровочной кривой и умножалась на фактор разведения.

Определение концентрации общего белка

Концентрация белка определялась с помощью Биуретового метода (Doumas и соавт, 1981).

Перед добавлением биуретового реагента образцы подвергали преципитации ацетоном. Образцы и стандарт разводили в 2,5 раза ацетоном, инкубировали в течение 5 мин, а затем центрифугировали в течение 5 мин при 20000 g. Осадок ресуспендировали в 0,1 мл солевого раствора, тщательно перемешивая на вортексе, и к каждому образцу прибавляли 0,9 мл реагента на общий белок (Sigma). После инкубации в течение 15 мин при комнатной температуре спектрофотометрически измеряли абсорбцию образцов и стандарта при 540 нм. Концентрацию белка рассчитывали путем сравнения результатов в образцах и стандарте.

Тромбин в обрабатываемом материале

Тромбин обычно производится из плазмы без криопреципитата на предприятии Omrix (Тель Авив, Израиль). Во время производства продукт подвергается обработке детергентным раствором (1% три-n-бутилфосфат / 1% Тритон-Х100) для удаления оболочечных вирусов. Растворитель и детергент затем удаляют хроматографией, а продукт впоследствии извлекают при элюции. Для увеличения стабильности продукта добавляют маннитол в конечной концентрации 2%. Человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) добавляют в конечной концентрации 0,2%. Затем продукт фильтруется через Viresolve/70™ при комнатной температуре со скоростью тока ретентата 1400-1600 мл/мин и пермеата 65-70 мл/мин.

Образцы хранились замороженными вплоть до фильтрации. Перед фильтрацией образцы размораживали при 37°С.

Исходные материалы и буферы для фильтрации

Для определения эффекта макромолекул на нанофильтрацию были приготовлены различные исходные материалы и соответствующим образом подобраны буферы для фильтрации (см. табл.1).

Тангенциальная нанофильрация (ТНФ) с применением модуля Viresolve/70™

Модуль Viresolve/70™ производственного размера имеет номинальную площадь мембраны 0,1 м2. В данном исследовании использовали уменьшенные модули с мембранами размером 1/3 или 1/6 от площади производственной мембраны и условия были изменены соответственно Тангенциальная нанофильтрация проводилась согласно рекомендациям производителя В процессе фильтрации через Viresolve/70™ использовали 2 перистальтических насоса: один (ретентат) использовали для циркуляции продукта по модулю, а другой (пермеат) использовали для вытяжки фильтрата и его сбора (Фиг.1) При уменьшении размеров 1/6 насосы настраивали для достижения желаемой скорости тока 250±10 мл/мин для насоса, прокачивающего ретентат, и 11-12 мл/мин для насоса, прокачивающего пермеат. При уменьшении 1/3, скорости тока увеличивали вдвое. Перед фильтрованием продукта модуль промывали очищенной водой, а затем буфером для фильтрации. Состав буфера для фильтрации выбирали в соответствии с исходным материалом (см. Табл.1).

Для модуля, уменьшенного 1/6, для фильтрации использовали 1-1.5 литра исходного материала, а для модуля, уменьшенного 1/3, использовали 2-3 литра. Перед фильтрацией через Viresolve/70™ образцы фильтровали через фильтр с порами 0,2 мкм (Millipak 40, Millipore). Процесс фильтрации проводили при комнатной температуре, применяя вышеупомянутые скорости тока. По окончании фильтрации исходного материала модуль Viresolve/70™ промывали 3 раза соответствующим буфером для фильтрации, после чего следовала процедура очистки, включающая промывку фильтрата и ретентата очищенной водой. Собранные в ходе технологического процесса образцы использовали для определения титра MVM(p) или ВГА и концентрации белка и тромбина (Табл.2).

Результаты

Для оценки эффекта добавления макромолекул на удаление мелких безоболочечных вирусов и выход продукта при фильтрации через Viresolve/70™ была проведена серия экспериментов с тангенциальной нанофильтрацией. В качестве модели исследовали очистку тромбина с использованием модуля Viresolve/70™. Первая часть эксперимента была предназначена для оптимизации условий работы системы Viresolve/70™ (1/3 ft2 или 0,03 м2) с применением протокола производителя по изменению скорости тока. Эксперимент проводили следующим образом: в день исследования раствор тромбина размораживали при 37°С, а затем фильтровали через полиэфирсульфоновый фильтр с размером пор 0.2 мкм и площадью 500 см2 (CH5925PPZK, PALL). Подающий контейнер затем наполняли 300 мл профильтрованного раствора тромбина. Скорость потока насоса, прокачивающего ретентат, устанавливали на 500 мл/мин, и продукт рециркулировали через мембрану в течение 30 мин. Затем насос, прокачивающий пермеат, настраивали для получения скорости тока 3,5, 5, 10, 15, 20, 25 и 30 мл/мин и работали на каждой скорости тока таким образом, что пермеат возвращался в канал ретентата за 30 мин (полная рециркуляция). Образцы ретентата (R) и пермеата (Р) собирали при каждой скорости тока и хранили при -70°С.

Затем мембрану очищали согласно инструкциям Millipore.

Замороженные образцы оттаивали и замеряли в них концентрацию белка и активность тромбина.

Эксперимент повторяли дважды, первый раз после очищения мембраны, а второй раз с использованием новой мембраны. Каждый раз цикл повторяли с новым флаконом тромбина.

Оптимальную скорость тока выбирали по наиболее высоким значениям выхода белка и активности тромбина.

Тест на целостность проводили на модуле Viresolve 70 согласно инструкциям производителя.

Полученные результаты показали (см. Табл.3 и 4), что наилучшая скорость тока была в пределах 20-25 мл/мин. При таких скоростях тока средние выход тромбина и выход белка были приблизительно 93 и 75% соответственно.

После определения оптимальной скорости тока стало возможно оценить фильтрацию тромбина в условиях производства в уменьшенном масштабе. Для этих экспериментов подающий контейнер заполняли 3000 мл раствора тромбина и отбирали пробы (Т0).

Рециркуляционный насос был настроен на скорость тока 500 мл/мин и продукт рециркулировали в течение 30 мин. Объем всей партии пропускали при оптимальной скорости тока, определенной в экспериментах с изменением скорости тока, до тех пор, пока не достигали финального объема. Собирали образцы из подающего контейнера (C1) и пермеата (P1). Раствор диафильтровали соответствующим буфером в объеме 3-кратно превышающем финальный объем для получения как можно большей массы белка без существенного разведения продукта, а затем собирали следующий образец пермеата (Р2).

Измеряли концентрацию белка и активность тромбина в образцах до и после диафильтрации для определения выхода продукта при диафильтрации и без нее. Модуль Viresolve 70 хранили при 4°С и для оценки отсутствия повреждений мембраны проводили тест на целостность согласно инструкциям производителя.

Полученные результаты (Таблицы 5 и 6) показали, что средний выход тромбина составил 96%, а средний выход белка составил около 77%. В дополнение, этап диафильтрации (W) приводил к дополнительному увеличению активности тромбина на 3-5%.

После того, как были установлены условия для тангенциальной фильтрации тромбина с применением Viresolve 70™, стало возможно оценить эффективность системы для удаления вирусов.

В первом эксперименте, описанном ниже, использовали оптимальное изменение скорости тока. Номинальная площадь мембраны используемых модулей составляла 1/3 ft (0,03 м2) или 1/6 ft (0,015 м2). Вследствие объем продукта, подлежащего фильтрации и скорости тока, были изменены соответственно.

Во всех проведенных экспериментах в образцы обрабатываемого тромбина, подлежащие фильтрации, были внесены MVM(p) или ВГА для достижения конечной концентрации более 1×105 TCID50 единиц/мл (подробности см. в разделе Методы). Нагруженные вирусом растворы фильтровали через фильтр с порами 0,2 мкм и первые образцы до фильтрации (L1 и L2) отбирали для титрования вируса. Оставшийся материал, нагруженный вирусом, фильтровали через предварительно уравновешенную мембрану Viresolve 70™ с соответствующим буфером. Процесс фильтрации продолжали до тех пор, пока объем ретентата не достигал 100-250 мл. Весь фильтрат собирали и отбирали образец для титрования вируса (F). Процесс фильтрации продолжали с повторным промыванием фильтра соответствующим буфером для фильтрации. Фильтрат с этапа промывки либо отбирали отдельно и для титрования вируса отбирали дополнительный образец (W), либо вместе с предыдущим фильтратом (титры вируса в этих образцах рассчитывали соответственно). На данном этапе собирали ретентат всего технологического процесса и отбирали образец (R) для титрования вируса. После фильтрации все модули промывали и тестировали на отсутствие повреждений в тесте на целостность, предложенном производителем модуля (Millipore).

Полученные результаты (приведены в Таблице 7) показали, что при условиях, оптимальных по выходу тромбина и белка, удаление парвовирусов с использованием данной системы высокоэффективно. Кроме того, полученные результаты неожиданно оказались лучше, чем описанные в предыдущих исследованиях (Hoffer et al 1995, DiLeo et al 1992, DiLeo et al 1993, Jemberg et al 1996, Adamson 1998).

Для подтверждения этих результатов и уточнения механизма получения лучших показателей снижения концентрации был проведен ряд экспериментов.

Первая серия экспериментов была разработана для оценки влияния концентрации альбумина на удаление вируса. Использовали 4 концентрации альбумина: 2 мг/мл, 1 мг/мл, 0,2 мг/мл и 0,01 мг/мл с добавлением 20 мг/мл маннитола. Эти растворы нагружали либо ВГА, либо MVM(p), в соответствии с условиями и процедурами, описанным ранее. Однако в эксперименте с MVM скорость тока поддерживали на уровне, зафиксированном в начале фильтрации (наихудшие условия; увеличение давления в ходе фильтрации). Напротив, для ВГА скорость тока фиксировали в начале фильтрации, а затем фильтрацию проводили без повышения давления. Полученные результаты показали, что показатели снижения концентрации, полученные ранее для MVM(p) на уровне около 6,0 log снижения (LRV) были воспроизводимы (см Табл.8 и Фиг.2). Примечательно, что добавление альбумина сыворотки человека в концентрациях 0,2-2 мг/мл оказывало сопоставимый эффект на показатели удаления MVM(p). Однако добавление альбумина сыворотки человека в концентрации в 20 раз ниже (0,01 мг/мл) или недобавление ЧСА в исходное сырье приводило к значительно меньшему удалению MVM(p) (логарифм снижения концентрации приблизительно 5,0 или 4,7, соответственно), что указывало на роль таких молекул, как альбумин в улучшении показателя снижения концентрации вируса. Следует отметить, что молярность тромбина в различных растворах альбумина составляла 5,4 мкМ. Данные результаты позволяют предположить, что для того, чтобы улучшить удаление MVM(p), достаточно использовать ЧСА в более низкой молярной концентрации, чем молярная концентрация тромбина.

Значения показателя снижения концентрации для ВГА были, как правило, выше (>7,0 LRV), т.к частицы вируса гепатита А (27-32 нм) крупнее по сравнению с MVM(p) (18-26 нм). Как показано для MVM, альбумин сыворотки человека в концентрациях 0,2-2 мг/мл имел схожий эффект на коэффициент удаления ВГА. Кроме того, повышение давления для поддержания начальной скорости тока в циклах, которые включали MVM, не снижало удаление вирусных частиц.

Для дальнейшего изучения вовлечения альбумина в процесс удаления вируса был проведен следующий ряд экспериментов. Изучали эффект следующих растворов на удаление вирусных частиц: раствора тромбина, содержащего 0.2 мг/мл альбумина и 20 мг/мл маннитола, раствора маннитола и среды DMEM. Условия в ходе технологического процесса и процедуры нагрузки вирусами были описаны выше.

Полученные результаты (см. Табл.10) показали, что дальнейшее снижение показателей удаления вируса было получено, когда в исходный материал не добавляли ни альбумин, ни тромбин (2,84 LRV), а наименьшие значения показателя снижения концентрации были получены при использовании среды DMEM (Biological Industries) (1,72 LRV).

Для оценки эффекта добавления других макромолекул на удаление вируса и возможного влияния размера молекул на удаление вируса, использовали растворы декстрана с различным размером молекул и одинаковой молярностью. Данные молекулы добавляли в обрабатываемый образец, как описано выше. Процедуру нагрузки вирусами и фильтрации проводили в соответствии с условиями, приведенными выше.

Полученные результаты (Табл.11) показали, что в первом эксперименте с использованием 80 кДа декстрана в конечной концентрации 0.23 мг/мл логарифм снижения титра MVM(p) составил 6,2. Аналогичный эффект на показатели удаления вируса был обнаружен и при использовании молекул декстрана меньшего размера (5 кДа, 25 кДа) в таком же молярном отношении, и титр MVM(p) после фильтрации снижался также на 6,1-6,2 log.

Чтобы определить, будет ли увеличение скорости тока влиять на показатели удаления вируса, скорость тока пермеата увеличили до 25 мл/мин и поддерживали в ходе всего процесса фильтрации. Результаты показали, что увеличение скорости тока имело только пограничный эффект на показатели удаления MVM(p) (Табл.12), снижение концентрации регистрировалось на уровне 5,7 log.

В дополнение, когда измеряли средние скорости тока разных циклов фильтрации (см. Табл.13), было обнаружено, что скорость тока резко снижалась в растворах, содержащих макромолекулы (например, альбумин или декстран) вдобавок к тромбину. Наименьшая скорость тока - 5,4 мл/мин, составляющая около 46% от начальной скорости тока, достигалась при добавлении к раствору тромбина раствора человеческого альбумина в конечной концентрации 2,0 мг/мл. При конечной концентрации альбумина 0,2 мг/мл или при использовании эквимолярных концентраций декстрана с различными размерами молекул достигалась скорость тока от 63 до 74% от начальной. Такие различия в средних скоростях тока не влияли на показатели удаления вирусных частиц, как описано в предыдущих экспериментах. Однако когда в раствор тромбина не вносили макромолекулы или когда использовали только буферные растворы (например, DMEM, буфер + маннитол), средняя скорость тока была близка к начальной скорости тока.

1. Способ очистки раствора тромбина от инфекционных частиц, при котором
(а) в упомянутый раствор добавляют макромолекулы; и
(б) пропускают указанный раствор через нанофильтр, получая таким образом раствор тромбина, по существу, очищенный от инфекционных частиц, причем указанная макромолекула не является неионным сурфактантом и отлична от тромбина.

2. Способ по п.1, где указанные инфекционные частицы являются вирусными частицами.

3. Способ по п.1, где указанный раствор происходит из цельной крови или плазмы.

4. Способ по п.1, где выход очищенного тромбина после этапа (б) находится в пределах 59-100% или в пределах 75-93%.

5. Способ по п.1, где логарифм снижения концентрации (LRV) указанных частиц после этапа (б) составляет около 4-8.

6. Способ по п.1, где указанные частицы имеют размер от 15 до 80 нм или более 80 нм.

7. Способ по п.1, где указанная макромолекула выбрана из группы, состоящей из полимера, состоящего из по меньшей мере 3 мономеров сахара; аминокислот; гликолей; спиртов; липидов; и фосфолипидов.

8. Способ по п.1, где указанная макромолекула выбрана из группы, состоящей из белка; полисахаридов; сахарных спиртов; фосфолипидов; поливинилпирролидона; полиэтиленгликоля; производных целлюлозы; полимеров винила; и гликолей.

9. Способ по п.1, где указанная макромолекула представляет собой декстран.

10. Способ по п.1, где указанная макромолекула представляет собой декстран с молекулярным весом в диапазоне 5-80 кДа.

11. Способ по п.1, где указанная макромолекула представляет собой альбумин.

12. Способ по п.1, где указанную макромолекулу добавляют в диапазоне концентраций от значений более 0,01 мг/мл до значений менее или равных 2 мг/мл.

13. Способ по п.1, где указанную макромолекулу добавляют в диапазоне концентраций от значений более 0,15 мкМ до значений менее или равных 31 мкМ.

14. Способ по п.1. где указанную макромолекулу добавляют в концентрации ниже, чем концентрация указанного раствора тромбина.

15. Способ по п.1, где указанный нанофильтр имеет границу пропускания по размеру частиц, лежащую выше 104 Да.

16. Способ по п.1, где указанный нанофильтр имеет границу пропускания по размеру частиц, лежащую примерно в интервале 104-3×105 Да.

17. Способ по п.1, где указанный нанофильтр представляет собой мембрану Viresolve/70™ или мембрану Viresolve/180™.

18. Способ по п.1, где указанный раствор пропускают через нанофильтр по методу нанофильтрации с тангенциальным потоком.

19. Способ по п.1, где указанный раствор пропускают через нанофильтр по методу нанофильтрации с тупиковым потоком.

20. Раствор, содержащий тромбин, полученный согласно способу по п.1.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению новых пептидов, и может быть использовано в лечении и профилактике цитокинзависимых нарушений.

Изобретение относится к генной инженерии и может использоваться для лечения вирусных инфекций. .
Изобретение относится к препаративной биохимии, фармакологии, медицине. .

Изобретение относится к медицине . .

Соединение, предназначенное для стимуляции пути передачи сигнала через il-15rбета/гамма, с целью индуцировать и/или стимулировать активацию и/или пролиферацию il-15rбета/гамма-положительных клеток, таких как nk-и/или t-клетки, нуклеиновая кислота, кодирующая соединение, вектор экспрессии, клетка-хозяин, адъювант для иммунотерапевтической композиции, фармацевтическая композиция и лекарственное средство для лечения состояния или заболевания, при котором желательно повышение активности il-15, способ in vitro индукции и/или стимуляции пролиферации и/или активации il-15rбета/гамма-положительных клеток и способ получения in vitro активированных nk-и/или t-клеток // 2454463
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению стимуляторов пути передачи сигнала через IL-15Rбета/гамма, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к областям молекулярной биологии, вирусологии, иммунологии и медицины. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к модификациям молекулы IL-7, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к новым вариантам пептидов ИЛ-21, где аминокислоты делегированы и/или заменены в области, состоящей из аминокислот 83-96, а также их применению для изготовления лекарственного средства для лечения рака.

Изобретение относится к области молекулярной фармакологии, в частности к пептиду, являющемуся частью последовательности интерлейкина-15 (IL-15), который может ингибировать биологическую активность указанной молекулы.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению модифицированного антагониста рецептора мутеина IL-4 (IL-4RA), и может быть использовано для лечения заболеваний дыхательных путей, таких как астма, эмфизема или хронический бронхит.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генной инженерии, и может быть использовано в медикобиологической промышленности для получения активных препаратов интерлейкина-29 (IL-29).

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к пептиду, который обладает ростостимулирующей активностью фактора роста гепатоцитов HGF. .

Изобретение относится к области молекулярной биологии, конкретно к белкам, регулирующим клеточную дифференцировку путем ингибирования белков надсемейства TGF-beta. .

Изобретение относится к области медицины и касается иммунотерапии против ангиогенеза. .
Наверх