Способ детектирования парамагнитных комплексов марганца как маркеров атеросклероза



Способ детектирования парамагнитных комплексов марганца как маркеров атеросклероза
Способ детектирования парамагнитных комплексов марганца как маркеров атеросклероза
Способ детектирования парамагнитных комплексов марганца как маркеров атеросклероза

 


Владельцы патента RU 2468368:

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский (Приволжский) Федеральный Университет" (ФГАОУ ВПО КФУ) (RU)
Силкин Николай Иванович (RU)
Челышев Юрий Александрович (RU)
Мамин Георгий Владимирович (RU)
Орлинский Сергей Борисович (RU)
Салахов Мякзюм Халимулович (RU)

Изобретение относится к медицине, в частности к методам диагностики атеросклероза. Способ заключается в получении образца ткани из стенки артерии в результате проведения биопсии или в ходе хирургической операции, лиофилизации образца, регистрации ЭПР-спектра методом высокочастотного электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), измерения времен релаксации парамагнитных комплексов Mn2+ на сертифицированном спектрометре электронного парамагнитного резонанса W-диапазона. При выявлении времени поперечной релаксации ионов Mn2+ меньше 100 не определяют слабую степень кальцификации атеросклеротической бляшки. Осуществление способа позволяет прогнозировать течение атеросклеротического процесса. 2 ил.

 

Изобретение относится к медицине, преимущественная область его использования - диагностика атеросклероза.

Одной из составляющих в развитии атеросклеротического процесса является кальцификация атеросклеротической бляшки. Она рассматривается как индикатор нестабильности этой патологической структуры. Разрывы кальцифицированных бляшек приводят к грозным осложнениям в виде инфарктов и инсультов.

Причины и механизм кальцификации в атеросклеротической бляшке остаются неясными. Этот процесс вначале затрагивает липидную сердцевину атеромы вблизи клеток, вовлеченных в процесс воспаления и инфильтрирующих бляшку [1, 6]. Апоптозные тела и остатки клеток выступают в роли центров нуклеации [5], где в результате воспаления, накопления липопротеинов и фосфолипидов откладывается карбонизированный гидроксиапатит, как правило, с дефицитом кальция, замещенным водородными фосфатными группами. В крови в нормальных условиях присутствуют нанокристаллы гидроксиапатита. При атеросклерозе, обладая высокой адгезионной способностью, они задерживаются на поверхности просвета атеросклеротически измененных артерий, а затем проникают в сердцевину атеросклеротической бляшки.

Методами высокочастотной ЭПР спектроскопии нами ранее показано, что спектроскопические и релаксационные характеристики органоминеральных радикалов в атеросклеротической бляшке коррелируют со степенью ее кальцификации. Поиск маркеров, позволяющих охарактеризовать состояние органоминерального матрикса в атеросклеротической бляшке и предсказать возможность прогрессирования ее кальцификации, является актуальной задачей. Этими маркерами могут быть комплексы переходных металлов, таких как Fe, Mn, Сu. Валентность переходного металла, структуру и локализацию парамагнитного комплекса в органоминеральном матриксе атеросклеротической бляшки представляется возможным определить методом ЭПР.

Учитывая высокую абсорбционную способность гидроксиапатита, можно полагать, что этот биоминерал, сформированный в пределах атеросклеротической бляшки, будет активно поглощать комплексы металлов, которые локализованы в тканевом матриксе стенки сосуда и высвобождаются из присутствующих здесь клеток в ходе их функционирования и особенно в результате гибели. Одним из таких металлов является Мn, который наиболее значим в составе ключевой молекулы в системе антиоксидантной защиты - Мn-супероксиддисмутазы (MnSOD). Этот митохондриальный фермент катализирует реакцию дисмутации супероксидных анионов (O2•-) в перекись водорода (Н2О2) и О2. MnSOD замедляет изъязвление атеросклеротической бляшки, уменьшает опосредованную окисленными липопротенинами низкой плотности (ox-LDL) гибель макрофагов [3, 7], сдерживает дисфункцию эндотелиальных клеток [4] и окисление липопротеинов низкой плотности (LDL) [2]. Известно, что в ходе атерогенеза происходит гибель клеток в атеросклеротической бляшке. При этом ион Мn из MnSOD митохондрий может оказаться в тканевом матриксе. Исследования по прямому обнаружению Мn из MnSOD митохондрий в доступных заявителю источниках информации из исследованного заявителем уровня техники не выявлено. Его присутствие в тканевом матриксе может дать существенную информацию о природе и выраженности атерогенеза.

Заявителем проведен анализ источников литературы. Работы по анализу содержания марганца в органоминеральном матриксе атеросклеротической бляшки отсутствуют. Из исследованного уровня техники на дату подачи заявки заявителем не выялены технические результаты, направленные на реализацию поставленной цели в заявленном техническом решении.

Аналогами заявленного технического решения могут быть данные по анализу:

- содержания переходных металлов (Fe, Сu, Мn, Zn) в минерализованном матриксе кости;

- эффектов введения марганца в синтетический гидроксианатит для улучшения его интеграции в костную ткань в условиях имплантации;

- содержания переходных металлов (Fe и Сu) в атеросклеротически измененной стенке артерий методом ЭПР.

Наиболее близким прототипом заявленного технического решения с точки зрения заявленных целей (диагностика атеросклероза), конкретных задач (определение содержания переходных металлов) и применяемых методов (ЭПР) могут служить работы группы авторов из Института исследования сердца в г.Сиднее (Австралия) [8, 9].

Исследованиями этой группы авторов, проведенными с использованием метода ЭПР, было показано накопление меди и железа во внутренней оболочке артерии при атеросклерозе. Наибольшее внимание в этих работах было уделено железу. Накопление железа во внутренней оболочке артерии (но не в самой атеросклеротической бляшке, расположенной в составе этой оболочки) положительно коррелировало с уровнем холестерина и патологическим окислением биомолекул и не коррелировало с уровнем кальция. Полученные результаты позволили заявителю сформулировать представление об ухудшении прогноза течения атеросклероза при накоплении железа.

Анализ материалов прототипа, выполненный заявителем, выявил следующее:

- в указанных работах не было исследовано содержание марганца, одного из наиболее важных переходных металлов в антиоксидантной защите ткани, непосредственно в атеросклеротической бляшке;

- в кальцифицированной атеросклеротической бляшке не изучено присутствие парамагнитных комплексов марганца в органоминеральном матриксе и непосредственно в связи с главным его минеральным компонентом - гидроксиапатитом;

- не установлена отрицательная корреляция между степенью кальцификации атеросклеротической бляшки и присутствием в ней парамагнитных комплексов марганца, что важно для прогноза развития атеросклеротического процесса.

Целью заявленного способа является устранение вышеперечисленных недостатков прототипа, что позволит обеспечить достижение новых технических результатов, а именно:

- улучшить диагностику атеросклеротического поражения стенки артерии на основе регистрации парамагнитных центров Мn2+ в органоминеральном матриксе атеросклеротической бляшки методом высокочастотного ЭПР;

- повысить информативность диагностики атеросклеротического поражения стенки сосуда, связанного с процессом кальцификации, что открывает новые возможности для уточнения диагноза, в том числе и стадии заболевания.

Способ диагностики атеросклероза методом высокочастотной ЭПР-биопсии, заключающийся в получении образца ткани из стенки артерии в результате проведения биопсии или в ходе хирургической операции, лиофилизации образца биологической ткани, регистрирации спектра ЭПР и измерения времен релаксации парамагнитных комплексов Мn2+ на сертифицированном ЭПР спектрометре W-диапазона, позволяет оценить степень кальцификации атеросклеротической бляшки и прогнозировать течение атеросклеротического процесса.

Заявленный способ характеризуется следующей последовательностью этапов:

а) получение образца ткани из стенки артерии в результате проведения биопсии или в ходе хирургической операции с соблюдением процедурных и этических норм;

б) лиофилизация образца биологической ткани;

в) помещение образца в стандартную кварцевую ампулу спектрометра ЭПР;

г) регистрация спектра ЭПР парамагнитных центров Mn2+ и измерение времен релаксации этих центров на сертифицированном ЭПР спектрометре W-диапазона.

Достигнутый результат по заявленному решению состоит в улучшении диагностики атеросклеротического поражения стенки артерии на основе регистрации парамагнитных центров Мn2+ в тканевом матриксе атеросклеротической бляшки методом ЭПР.

Заявителем впервые:

- методом ЭПР определено присутствие в матриксе атеросклеротической бляшки парамагнитных центров Мn2+;

- методом электронного спинового эха установлено, что выраженность кальцификации выше в тех образцах атеросклеротической бляшки, в которых было зарегистрировано меньшее локальное содержание Мn2+. Эта отрицательная корреляции подтверждена методом атомной масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой при измерении содержания Мn в матриксе атеросклеротической бляшки.

Заявителем впервые сформулировано представление о том, что нанокристаллы гидроксиапатита, поступая из кровотока, накапливаются в тканевом матриксе формирующейся атеросклеротической бляшки во внутренней оболочке артерии, где активируют выработку супероксида О2- и благодаря высокой адгезии и ионообменным свойствам абсорбируют ионы Мn2+.

По мнению заявителя, выявление в органоминеральном матриксе атеросклеротической бляшки парамагнитных центров Мn2+ позволяет уточнить степень его кальцификации и прогнозировать тяжесть течения патологического процесса.

Заявленное техническое решение поясняется Фиг.1, Фиг.2.

На Фиг.1 представлены спектры высокочастотного ЭПР в образцах из всех слоев лиофилизированной стенки сосуда с атеросклеротической бляшкой (Высокочастотная ЭПР-спектроскопия образцов из всех слоев лиофилизированной стенки артерии с атеросклеротической бляшкой). Сверху вниз: внутренняя оболочка без минеральных отложений; интима с минеральными отложениями; средняя оболочка сосуда (без минеральных отложений); наружная оболочка (без минеральных отложений). Во всех исследованных образцах наблюдается спектр ЭПР ионов Мn2+, состоящий из шести линий сверхтонкой структуры. Константа сверхтонкого взаимодействия А (т.е. взаимодействия магнитных моментов электронной оболочки и ядра иона Мn2+) одинакова для всех спектров ЭПР и равняется 9.28 мТ. В магнитном поле, соответствующем g-фактору (фактор спектроскопического расщепления Ланде) 2.06, наблюдается дополнительный сигнал, интерпретируемый как ЭПР Сu-содержащей биомолекулы.

Фиг.2 (Распад поперечной намагниченности ионов Мn2+ в атеросклеротических бляшках с различной степенью кальцификации) иллюстрирует распад поперечной намагниченности ионов Мn2+ в атеросклеротических бляшках с различной степенью кальцификации: ● - сильная степень кальцификации; ■ - средняя степень кальцификации. В образцах со слабой степенью кальцификации сопоставление сигналов ЭПР стационарного и импульсного режимов позволяет определить, что время поперечной релаксации ионов Мn2+ меньше 100 не, что свидетельствует о высокой локальной концентрации этих ионов.

Заявленное техническое решение представлено следующими примерами конкретного выполнения.

Заявителем изучен 21 образец из стенки аорты больных атеросклерозом мужчин в возрасте 40-60 лет. Материал получен в ходе патологоанатомических исследований, проведенных в соответствии с требованиями комитета по этике Межрегионального клинико-диагностического центра (г.Казань). Часть материала изучена при помощи стандартных гистологических методов. Образцы были классифицированы по степени кальцификации. Образцы промывали физиологическим раствором и лиофилизировали (Р=5·10-5 мбар, Т=-50°С). Полученные образцы изучали методами электронной сканирующей микроскопии (Philips XL30ESEM), рентгеноспектрального электронно-зондового (микрозондового) (приставка EDAX) и рентгеноструктурного анализов.

Спектры ЭПР регистрировали на спектрометре W-диапазона (93.5 ГГц) Elexsys 680 (Bruker), с применением стационарного и импульсного режимов. Применяли стандартные двух- и трехимпульсные последовательности для измерения времен релаксации и спектров ЭПР по амплитуде первичного электронного спинового эха.

Спектры двойного электронно-ядерного резонанса (ДЭЯР) измеряли с использованием импульсной последовательности Мимса. Исследования проводили в диапозоне температур (20-300)К.

Образцы аорты человека были препарированы с выделением характерных областей, таких как интима без минеральных отложений; интима с минеральными отложениями; средняя оболочка сосуда (без минеральных отложений), наружная оболочка (без минеральных отложений). На Фиг.1 представлены спектры высокочастотного ЭПР в полученных образцах. Во всех исследованных образцах наблюдается спектр ЭПР ионов Мn2+ состоящий из шести линий сверхтонкой структуры. Константа сверхтонкого взаимодействия А (т.е. взаимодействия магнитных моментов электронной оболочки и ядра иона Мn2+) одинакова для всех спектров ЭПР и равняется 9.28 мТ. В магнитном поле, соответствующем g-фактору (фактор спектроскопического расщепления Ланде) 2.06, наблюдается дополнительный сигнал, интерпретируемый как ЭПР Cu-содержащей биомолекулы.

В дальнейшем для исследований отбиралась только область интимы с минеральными отложениями, где и присутствуют атеросклеротические бляшки. Для определения кальцификации тканевого матрикса с помощью электронной сканирующей микроскопии были получены микрофотографии рельефа поверхности разреза внутренней оболочки аорты больных атеросклерозом. Выявлены изменения в структуре ткани, связанные с увеличением доли минеральной компоненты в атеросклеротической бляшке в виде сферических глобул гидроксиапатита.

Для определения степени кальцификации тканевого матрикса было определено отношение Са/Р во всех образцах методом микрозондового анализа. Это отношение характеризует степень кальцификации органоминеральных агрегатов.

Были выбраны образцы атеросклеротических бляшек, отличающиеся по степени кальцификации - «сильная» Са/Р=1.66, «средняя» Са/Р=0.64 и «слабая» Са/Р=0.18. В этих образцах методом высокочастотного ЭПР были измерены релаксационные характеристики парамагнитных центров Мn2+. Время продольной релаксации не выявило каких-либо значительных изменений в зависимости от степени кальцификации. Распад поперечной намагниченности ионов Мn2+ в атеросклеротических бляшках существенно отличается для образцов с различной степенью кальцификации (Фиг.2). В образцах со слабой степенью кальцификации сопоставление сигналов ЭПР стационарного и импульсного режимов позволяет определить, что время поперечной релаксации ионов Мn2+ меньше 100 нс, что соответсвует результам измерения времени поперечной релаксации в эталонных образцах препарата MnSOD.

Таким образом, методами высокочастотной ЭПР-биопсии, ДЭЯР и электронного спинового эха заявителем впервые обнаружено присутствие Mn2+ в атеросклеротической бляшке и установлена отрицательная корреляция между степенью кальцификации атеросклеротической бляшки и содержанием в ней Мn2+.

Использование заявленного способа диагностики атеросклероза методом ЭПР-спектроскопии в W-диапазоне путем обнаружения присутствия Мn2+ в атеросклеротической бляшке обеспечивает возможность установления корреляция между степенью кальцификации атеросклеротической бляшки и содержанием в ней Mn2+, что позволяет:

1) поставить точный диагноз атеросклероза,

2) определить стадию развития заболевания,

3) прогнозировать характер его дальнейшего развития,

4) выбрать оптимальную терапевтическую стратегию.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как из уровня техники не выявлены признаки, приведенные в заявленном техническом решении.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», т.к. заявленное техническое решение не является очевидным для специалиста в данной области техники.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», т.к. заявителем достигнуты поставленные цели в результате проведения исследований на клиническом материале.

Способ определения степени кальцификации атеросклеротической бляшки путем регистрации парамагнитных комплексов марганца методом высокочастотного электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), заключающийся в получении образца ткани из стенки артерии в результате проведения биопсии или в ходе хирургической операции, лиофилизации образца, регистрации ЭПР-спектра, измерения времен релаксации парамагнитных комплексов Mn2+ на сертифицированном спектрометре электронного парамагнитного резонанса W-диапазона - выявление времени поперечной релаксации ионов Mn2+ меньше 100 нс определяет слабую степень кальцификации атеросклеротической бляшки.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины, а именно к спортивной медицине, и может быть использовано для определения стероидного профиля при допинговом контроле спортсменов.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано при патоморфологической диагностике остеопороза по костным биоптатам. .

Изобретение относится к области медицины и описывает способ количественной оценки усвоенного лекарственного средства в организме, включающий сопутствующее потребление визуализирующего вещества, и проведение исследований через определенное время, где в качестве визуализирующего вещества используют флюоресцирующую пищевую добавку, смешанную с основным лекарственным средством в постоянной весовой пропорции F:X= :(1- ), где F - доза флюоресцирующей добавки мг/кг веса в сутки, Х - доза лекарственного средства мг/кг веса в сутки, выписанная врачом, - весовая доля флюоресцирующей добавки, а исследование проводят с помощью спектрофотометрического метода до приема смеси и после ее приема через 12-72 часа, при этом выбранные участки эпителия пациента освещают лазером с длиной волны 532 нм, непрерывной мощностью 5÷10 мВт, регистрируют интенсивности флюоресценции в диапазоне длин волн 650-690 нм - J0( ) и J1( ) соответственно, а количество лекарственного средства определяют по формуле: где CJ(S) - функционал зависимости интеграла сигнала флюоресценции используемой визуализирующей добавки в ее характеристическом диапазоне длин волн, находимый по калибровочному графику для хлорофилла в качестве флюоресцирующей пищевой добавки, где значение SJ рассчитывается по формуле: ,где - длина волны в нанометрах, a J0( ) и J1( ) - значения мощности флюоресценции (в одинаковых условных оптических единицах), измеренные соответственно до начала исследования и в контрольное время t (час).

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии. .
Изобретение относится к медицине и описывает способ прогнозирования степени тяжести перинатального гипоксического поражения центральной нервной системы у новорожденных путем изучения биохимического анализа плазмы крови, где в плазме пуповинной крови определяют уровень пероксинитрита и при его значениях 133,6-258 нмоль/л прогнозируют среднюю степень тяжести поражения ЦНС, а при 259 нмоль/л и выше - тяжелую степень.
Изобретение относится к медицине, может быть использовано в кардиологии и терапии и описывает способ оценки эффективности лечения липидемии путем исследования сыворотки крови до и после лечения, где дополнительно перед исследованием проводят трехкратное замораживание и оттаивание сыворотки крови по 20 минут и 10 минут соответственно, а затем определяют аполипопротеин В, липопротеин (а), их соотношение, общий холестерол и при увеличении отношения аполипопротеина В к липопротеину (а) на 50% и более и снижении общего холестерола на 30% и более по сравнению с исходным уровнем оценивают лечение липидемии как эффективное.
Изобретение относится к медицине, а именно к психиатрии, и может быть использовано для дифференцированного прогноза течения пограничных психических расстройств. .

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано в клинической практике для прогнозирования развития бактериального осложнения стафилококковой этиологии после гриппа.
Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии и пульмонологии
Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии и пульмонологии

Изобретение относится к области медицины, а точнее к клинической химии и, в частности к способам определения состава крови, и может быть использовано при допинговом контроле спортсменов

Изобретение относится к области биологии и медицины
Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностическим методам, и касается способа диагностики процесса созревания клеток эритроидного ряда при беременности, осложненной обострением герпес-вирусной инфекции, в третьем триместре гестации

Изобретение относится к медицине и описывает способ диагностики синдрома эндогенной интоксикации, включающий забор крови, определение молекул средней массы (МСМ) в сыворотке крови путем прямой спектрометрии депротеинизированного супернатанта, полученного после осаждения белков раствором трихлоруксусной кислоты, при длинах волн ( ) 280 нм и 254 нм, где дополнительно определяют МСМ при 238 нм, рассчитывают индекс средних молекул как сумму частного от деления значения МСМ при 280 нм к аналогичному значению при 254 нм и частного от деления значения МСМ при 238 нм к аналогичному значению при 280 нм и при значении индекса средних молекул более 4,5 диагностируют эндогенную интоксикацию
Изобретение относится к судебной медицине и может быть использовано для определения причины смерти

Изобретение относится к биологии, экологии, токсикологической и санитарной химии, а именно к способу определения н-бутилового эфира 2-[4-(5-трифторметилпиридил-2-окси)фенокси]пропионовой кислоты в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидемстанций, химико-токсикологических, ветеринарных и экологических лабораторий
Изобретение относится к медицине, а именно к неонатологии, и может быть использовано для прогнозирования манифестации внутриутробной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа, у новорожденных детей, рожденных от матерей с персистирующей герпесвирусной инфекцией во время беременности
Изобретение относится к медицине, в частности к неврологии, и может быть использовано для прогнозирования исхода у пациентов с травматическими внутричерепными гематомами в течение первых 10 суток нейрореанимационного периода
Наверх