Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления lactococcus lastis subspecies cremoris в заквасочных культурах, используемых в сыроделии и производстве кисломолочных продуктов
Владельцы патента RU 2469097:
Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии) (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к ДНК-технологиям. Предложены синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ для выявления Lactococcus lactis subspecies cremoris в заквасочных культурах, используемых в сыроделии и производстве кисломолочных продуктов. Предложенный способ включает проведение ПЦР. В случае выявления фрагмента ДНК размером 334 н.п. делают заключение о наличии в исследуемом биоматериале Lactococcus lactis subspecies cremoris. Способ может быть использован в молокоперерабатывающей промышленности для выявления и идентификации штаммов и культур Lactococcus lactis subspecies cremoris в заквасочных культурах, используемых в сыроделии и производстве кисломолочных продуктов. 2 н.п. ф-лы, 1 табл., 3 пр.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к ДНК-технологиям, и может быть использовано в молокоперерабатывающей промышленности для генотипирования штаммов и культур Lactococcus lactis subspecies cremoris.
Одним из способов дифференциации штаммов и культур Lactococcus lactis на подвиды, кроме микробиологического, является способ, основанный на использовании RFLP (restriction fragment length polymorphisms), анализ синтезированного гена 16S rRNA с помощью специфических праймеров для Lactococcus lactis и эндонуклеазы. Специфичность полученных паттернов для subspecies cremoris и subspecies lactis подтверждалась гибридизацией в не радиактивном варианте (Köhler G, Ludwig W, Schleifer K.H. / Differentiation of lactococci by rRNA gene restriction analysis // FEMS Microbiol Lett. - 1991. - vol.68 (3). - С.307-312); Ward L.J., Brown J.C., Davey G.P. / Two methods for the genetic differentiation of Lactococcus lactis ssp. lactis and cremoris based on differences in the 16S rRNA gene sequence // FEMS Microbiol Lett. - 1998. - vol.166 (1). - С.15-20).
К недостаткам данного способа можно отнести необходимость при проведении идентификации одной культуры проведение ПЦР, рестрикции эндонуклеазами, гибридизации с ДНК-зондом, электрофорезов и сравнение с референтными культурами, что обуславливает длительность процесса тестирования и высокую стоимость.
Другим решением данного изобретения является использование молекулярных методов, направленных на синтез с помощью ПЦР генов 16S rRNA и оперона гистидина. Сопоставление результатов позволяло идентифицировать как Lactococcus lactis subspecies cremoris, так и subspecies cremoris. Более четкие результаты по дифференциации подвидов Lactococcus lactis получали, если в дополнение учитывали результаты электрофореза продуктов гидролиза аргинина, выделенного из бактерий, выращенных при 40°С в присутствии 4% NaCl (Ouzari H., Hassen A., Najjari A., Ettoumi В., Daffonchio D., Zagorec M., Boudabous A. and Mora D. // A novel phenotype based on esterase electrophoretic polymorphism for the differentiation of Lactococcus lactis subsp. lactis and cremoris // Letters in Applied Microbiology. - 2006. - vol.43. - issue 4. - С.351-359).
К недостаткам данного способа можно отнести необходимость при идентификации одной культуры проведение нескольких ПЦР, электрофореза продуктов гидролиза аргинина в сравнении с референтными культурами, что обуславливает длительность процесса тестирования и высокую стоимость.
Задачей изобретения является расширение арсенала специфических олигонуклеотидных праймеров и способов выявления Lactococcus lactis subspecies cremoris при помощи специфических синтетических олигонуклеотидных праймеров.
Поставленная задача решается тем, что синтезируются синтетические олигонуклеотидные праймеры для выявления Lactococcus lactis subspecies cremoris в заквасочных культурах при производстве молочнокислых продуктов, согласно изобретению праймеры имеют нуклеотидные последовательности:
12F 5'-CGT CTT GAC CAA GAG GCG-3' и
12R 5'-CC ACA TAA GCC ACA AGT TCG-3'
Задача решается тем, что в способе выявления Lactococcus lactis subspecies cremoris в заквасочных культурах при производстве молочнокислых продуктов, включающем проведение ПЦР с олигонуклеотидными праймерами, согласно изобретению праймеры имеют нуклеотидную последовательность
12F 5'-CGT CTT GAC CAA GAG GCG-3' и
12R 5'-CC ACA TAA GCC ACA AGT TCG-3',
а в случае выявления фрагмента ДНК размером 334 н.п. делают заключение о наличии в исследуемом биологическом материале Lactococcus lactis subspecies cremoris.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Способ получения синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления Lactococcus lactis subspecies cremoris в заквасочных культурах при производстве молочнокислых продуктов
Поиск новых специфических праймеров осуществляют на основе выбранного фрагмента ДНК гена транспозона tra712, характерного только для Lactococcus lactis subsp. cremoris, при анализе полных геномов референтных штаммов Lactococcus lactis subspecies cremoris: MG1363, представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov / GenBank Search.html). Выбранные фрагменты ДНК тестируют с помощью программы Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).
Окончательный выбор праймеров основывается на следующих критериях: высокий уровень сходства специфического фрагмента ДНК Lactococcus lactis subspecies cremoris с ДНК различных штаммов этой бактерии. Олигонуклеотиды должны быть комплементарны последовательности ДНК на границах специфического фрагмента с содержанием оснований GC не менее 50% и не образовывать димеры.
Химический синтез праймеров осуществляют амидофосфитным методом на автоматическом синтезаторе ASM-102U.
Концентрацию специфических олигонуклеотидных праймеров в маточном растворе определяют спектрометрическим методом.
Таким образом, указанный способ позволяет получать синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные ДНК фрагмента гена транспозазы (tra712), характерного только для Lactococcus lactis subspecies cremoris.
Пример 2. Способ применения синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления Lactococcus lactis subspecies cremoris в заквасочных культурах при производстве молочнокислых продуктов
Способ осуществляется в несколько этапов.
Этап 1. Выделение ДНК Lactococcus lactis subspecies cremoris
Для выделения ДНК берут суспензии штаммов и изолятов Lactococcus lactis subspecies cremoris, выращенных на питательном бульоне из гидролизованного молока (БГМ), а также биоматериал от кисломолочных продуктов.
При выделении из бактериальной культуры клетки осаждают в бляшку центрифугированием 1-2 мин при 5000-7000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют. 100 мкл культуры добавляют к 400 мкл подогретого до +80°С 10% СТАВ, перемешивают и инкубируют при +80°С в течение 40 минут. Затем охлаждают до комнатной температуры и добавляют 0,5 объема (250-300 мкл) смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1), плавно перемешивают 2-3 раза в течение 1-2 мин и центрифугируют в течение 10 мин при 13000 об/мин. Водную фазу переносят в другую пробирку и к ней приливают 300 мкл смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1), перемешивают 1 мин и центрифугируют 6 мин при 13000 об/мин. К водной фазе прибавляют 50 мкл (1/10 объема) 3М ацетата натрия рН 4,8 и 1000 мкл этанола, перемешивают и помещают на 1 час при -20°С. Пробу центрифугируют 10 мин при 13000 об/мин, осадок промывают 70% этанолом, высушивают при наклонном положении пробирки при +37°С в течение 25-30 мин и растворяют в 30-50 мкл автоклавированной бидистиллированной воды.
Этап 2. Проведение полимеразной цепной реакции
Состав реакционной смеси: Для каждой исследуемой пробы ДНК готовят ПЦР-смесь: 650 мМ трис-HCl рН 8,9; 160 мМ (NH)4SO4; 30 мМ MgCl; 0,5% Tvin-20; 2,5 мМ dNTP, no 0,25 мкМ каждого праймера; 0,5 е.а. Taq-ДНК полимеразы; 2 мкл пробы ДНК и автоклавированной бидистиллированной воды до 25 мкл.
Температурный режим проведения ПЦР: Программа амплификации состоит из следующих температурных режимов: прогревание реакционной смеси при 95°С в течение 3 мин - 1 цикл, затем денатурация при 94°С 0,2 мин, отжиг при 56°С 0,2 мин, элонгация при 72°С 0,4 мин - 35 циклов и досинтез при 72°С в течение 0,8 мин.
Этап 3. Определение размера продуктов ПЦР
Электрофорез ампликонов проводят в 0,5х трис-боратном буфере, приготовленном из 5х ТБЕ буфера (0,089 М трис-борат; 0,089 М борная кислота; 0,002 М ЭДТА).
Продукты ПЦР визуализировали путем электрофореза в 1%-ном геле агарозы с бромистым этидием при силе тока 40 мА в течение 25-30 мин. 12,5 мкл ампликона смешивают с 3 мкл буфера для нанесения (0,25% бромфенолового синего, 30% глицерин в бидистиллированной воде) и вносят в лунки геля под электрофорезный буфер. Электрофорез проводят при напряжении 10 В/см длины геля до тех пор, пока краситель пройдет от старта не менее 2,0-2,5 см геля (примерно 35 минут). Результаты электрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор».
В качестве маркера используют ДНК pBLSK, гидролизованную MspI (на фрагменты 710, 489, 404, 328, 242, 190 н.п.).
Результат ПЦР считают положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента ДНК в 334 нуклеотидные пары.
Пример 3. Определение специфичности ПЦР
Результаты исследований по определению специфичности реакции с праймерами 12F и 12R представлены в таблице, которые показывают, что положительные анализы продуктов ПЦР получают только тогда, когда в качестве матрицы используют ДНК фрагмента гена транспозона tra712, характерного только для Lactococcus lactis subspecies cremoris. Анализы были отрицательными, когда использовали ДНК других бактерий.
| № п/п | Наименование культуры | ПЦР с праймерами 12F и 12R |
| 1 | Staphylococcus aureus | Отрицательно |
| 2 | Staphylococcus albus | Отрицательно |
| 3 | Streptococcus epidermitis | Отрицательно |
| 4 | Streptococcus pyogenes | Отрицательно |
| 5 | Escherihia coli | Отрицательно |
| 6 | Proteus vulgaris | Отрицательно |
| 7 | Streptococcus termophilus 124 Коллекция ВНИИМС, Углич | Отрицательно |
| 8 | Streptococcus termophilus 28-2 Коллекция ВНИИМС, Углич | Отрицательно |
| 9 | Lactococcus lactis subsp. lactis 174 Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул | Отрицательно |
| 10 | Lactococcus lactis subsp. lactis C9182 Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул | Отрицательно |
| 11 | Lactococcus lactis subsp. lactis 1614 Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул | Отрицательно |
| 12 | Lactococcus lactis subsp. cremoris 3M-5 Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул | Положительно |
| 13 | Lactococcus lactis subsp. cremoris E8 Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул | Положительно |
| 14 | Lactococcus lactis subsp. cremoris 86-38 Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул | Положительно |
| 15 | Lactococcus lactis subsp. cremoris 31-4 Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул | Положительно |
| 16 | Дистиллированная вода | Отрицательно |
Для подтверждения специфичности тестируемого фрагмента гена транспозона tra712, характерного только для Lactococcus lactis subspecies cremoris, наработали фрагмент на матрице ДНК штамма Lactococcus lactis subsp. cremoris 3M-5 (Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул) и провели секвенирование.
Анализ нуклеотидных последовательностей синтезируемых фрагментов провели методами выравнивания с другими опубликованными последовательностями полных геномов референтных штаммов Lactococcus lactis subsp. cremoris: MG1363, представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov / GenBank Search.html). Установили, что рассматриваемая нуклеотидная последовательность штамма Lactococcus lactis subsp. cremoris 3M-5 (коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул) совпадала с нуклеотидной последовательностью вышеназванных референтных штаммов Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363.
Таким образом, разработанные синтетические олигонуклеотидные праймеры для выявления ДНК гена транспозона tra712, характерного только для Lactococcus lactis subspecies cremoris, обладают высокой специфичностью и позволяют эффективно проводить идентификацию штаммов и культур Lactococcus lactis subspecies cremoris, используемых в заквасочных культурах молокоперерабатывающей промышленности.
1. Синтетические олигонуклеотидные праймеры для выявления Lactococcus lactis subspecies cremoris в заквасочных культурах, используемых в сыроделии и производстве кисломолочных продуктов, согласно изобретению, имеют нуклеотидные последовательности:
12F 5'-CGT CTT GAC CAA GAG GCG-3' и
12R 5'-СС АСА ТАА GCC АСА AGT TCG-3'.
2. Способ выявления Lactococcus lactis subspecies cremoris в заквасочных культурах, используемых в сыроделии и производстве кисломолочных продуктов, включающий проведение ПЦР с олигонуклеотидными праймерами, которые имеют нуклеотидную последовательность
12F 5'-CGT CTT GAC САА GAG GCG-3' и
12R 5'-СС АСА ТАА GCC АСА AGT TCG-3',
а в случае выявления фрагмента ДНК размером 334 н.п. делают заключение о наличии в исследуемом биологическом материале Lactococcus lactis subspecies cremoris.
