Способ серологической диагностики вирусных желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа


 


Владельцы патента RU 2472162:

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко Россельхозакадемии (RU)

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для серологической диагностики вирусных желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа, преимущественно рота-, коронавирусного энтеритов, вирусной диареи крупного рогатого скота. Способ включает взаимодействие антигенов с антителами, с антивидовыми антителами, меченными пероксидазой хрена, добавление субстратной смеси и учет результатов реакции по интенсивности окраски образовавшегося комплекса. В реакции используют планшеты с предварительно сорбированными на них антигенами рота-, коронавирусов, вируса диареи и после внесения испытуемых проб сывороток по 0,10-0,12 мл. Планшеты инкубируют 1,5-2 ч при 36-37°С, отмывают. Далее вносят по 0,10-0,12 мл общий антивидовой иммуноферментный конъюгат, состоящий из меченных ферментом антител против глобулинов сыворотки крови крупного рогатого скота, и проводят учет результатов реакции. Изобретение обеспечивает одновременную диагностику рота-, коронавирусного энтеритов, вирусной диареи крупного рогатого скота. А также чувствительность, специфичность и простоту постановки реакции, и возможность автоматизации процессов исследования. 2 пр.

 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к разработке способа выявления антител против вирусов, вызывающих желудочно-кишечные инфекции крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа.

Ведущую роль в этиологии диареи у молодняка с/х животных играют рота-, коронавирусы, вирус диареи-болезни слизистых, в меньшей степени другие инфекционные агенты. Указанные болезни широко распространены как в Российской Федерации, так и за рубежом и наносят животноводческим хозяйствам ощутимый экономический ущерб, складывающийся из потерь от гибели, особенно, в раннем возрасте, средств, затрачиваемых на лечение больных и недополучении продукции от переболевших животных. Ежегодно половина потерь молодняка приходится на желудочно-кишечные заболевания в раннем возрасте.

В связи с вышеизложенным проблема диагностики и борьбы с данными инфекциями является актуальной. С большой эффективностью решить проблему диагностики позволяет высокочувствительный метод иммуноферментного анализа.

Известен способ исследования сывороток крови на наличие антител к возбудителю вирусной диареи методом ИФА при эпизоотологическом обследовании животноводческих хозяйств [1].

Известен также способ серодиагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней иммуноферментным методом, для чего в лунки полистиролового планшета вносят специфический антиген по 0,1 мл и сорбируют его на поверхности лунок. На следующем этапе в лунки микропанели вносят контрольные и испытуемые сыворотки по 0,1 мл и инкубируют в течение 1,5-2 ч при 37°C. Несвязавшиеся антитела удаляют многократным промыванием, затем добавляют в каждую лунку антивидовой иммуноферментный конъюгат в объеме 0,1 мл в рабочем разведении. В положительных случаях конъюгат связывается с фиксированными на сенсибилизированной поверхности антителами, образуя комплекс антиген-антитело-конъюгат. Избыток конъюгата удаляют промыванием и вносят во все лунки субстратный индикаторный раствор, который меняет окраску по принципу окислительно-восстановительной реакции, пропорционально количеству конъюгированного с антителами фермента. Количество фермента пропорционально количеству антител, связавшихся с фиксированным на поверхности лунок антигеном [2]. (Прототип).

В задачу наших исследований входило - разработать чувствительный, эффективный способ серодиагностики рота-, коронавирусного энтеритов, вирусной диареи крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа и значительно сократить время на постановку диагноза за счет одновременного исследования сыворотки на наличие антител к этим возбудителям. Литературные данные по использованию ИФА-теста для исследования сывороток крови на наличие антител к рота-, коронавирусам крупного рогатого скота отсутствуют.

Сущность предложенного способа состоит в следующем. В лунки одного планшета с предварительно сорбированными ротавирусным, коронавирусным, диарейным антигенами автоматической пипеткой вносят испытуемую пробу сыворотки крови по 0,10-0,12 мл в лунки с различными антигенами, инкубируют 1,5-2 часа при температуре 37-38°C, планшет отмывают, вносят по 0,10-0,12 мл антивидовой иммуноферментный конъюгат, состоящий из меченных ферментом антител к глобулинам сыворотки крови крупного рогатого скота, инкубируют при тех же условиях, планшет отмывают и после добавления субстратной смеси проводят одновременный учет результатов реакции на рота-, коронавирусный энтерит, вирусную диарею крупного рогатого скота.

Пример 1

На первом этапе реакции во все лунки планшета автоматической пипеткой вносят по 0,1 мл 0,01М фосфатно-буферного раствора. В первые лунки рядов с нанесенными антигенами ротавируса, коронавируса, вируса диареи вносят по 0,1 мл исследуемой сыворотки, пипетируют и по 0,1 мл переносят в следующую лунку и т.д. Для контроля реакции параллельно вносят по 0,1 мл специфических гомологичных сывороток и также титруют их как пробу. Таким же образом вносят и титруют отрицательную сыворотку. Планшет инкубируют в термостате 1,5 часа при 36°C, затем отмывают его от несвязавшихся антител. В отмытые лунки планшета вносят по 0,1 мл антивидовой иммуноферментный конъюгат, состоящий из глобулинов сыворотки крови крупного рогатого скота, меченных пероксидазой хрена. Планшет инкубируют в термостате при 36°C 1,5 часа и вновь трижды отмывают фосфатно-буферным раствором с твином-20. Затем в лунки вносят по 0,1 мл субстратной смеси, состоящей из раствора 5-аминосалициловой кислоты и перекиси водорода. Результат реакции учитывают через 30 минут по изменению окраски образовавшегося реакционного продукта от коричневого до светло-коричневого цвета:

- интенсивное коричневое окрашивание, коричневое окрашивание - положительный результат;

- светло-коричневое окрашивание - сомнительный результат;

- окрашивание отсутствует или находится на уровне отрицательного контроля - отрицательный результат.

При исследовании 97 проб сывороток крови крупного рогатого скота из неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям хозяйств антитела к ротавирусу выявлены у 54 животных, к коронавирусу антитела обнаружены у 47, а к вирусу диареи - у 21 животного, что составило 55,6%, 48,4%, 21,6% соответственно.

Пример 2.

Реакцию проводят аналогично примеру 1, но сыворотку, коньюгат и субстратную смесь вносят в объеме 0,12 мл и планшеты инкубируют при 37°C в течение 2-х часов. Получены аналогичные результаты, что и в примере 1.

Предложенный способ не имеет отечественных аналогов. Позволяет при проведении диагностики рота-, коронавирусного энтеритов, вирусной диареи крупного рогатого скота методом ИФА значительно сократить время на постановку реакции и получить более достоверные результаты при учете реакции, так как исследования на эти инфекции осуществляются одновременно на одном планшете с предварительно сорбированными антигенами рота-, коронавирусов, вируса диареи крупного рогатого скота с использованием общего иммуноферментного конъюгата при одних и тех же условиях. Кроме того, отсутствуют литературные данные об использовании антительной иммуноферментной диагностики при рота-, коронавирусных энтеритах крупного рогатого скота.

Предложенный способ для серологической диагностики рота-, коронавирусного энтеритов, вирусной диареи КРС методом иммуноферментного анализа испытан комиссионно в сентябре 2009 года и апробирован в нескольких ветеринарных лабораториях с положительным результатом (ФГУ Центральная научно-методическая ветлаборатория 2010 г., ГУ Курская областная ветлаборатория 2010 г., Тверская межобластная ветлаборатория 2011 г.)

На основании полученных в ходе проверки результатов комиссия сделала выводы о том, что способ чувствителен и позволяет выявлять указанные специфические антитела в исследуемых сыворотках в значительно более короткие сроки.

Предложенный способ найдет применение при обследовании крупного рогатого скота в неблагополучных по желудочно-кишечным инфекциям хозяйствах с целью диагностики рота-, коронавирусных энтеритов, вирусной диареи КРС. Высокая чувствительность, специфичность, простота постановки реакции и возможность автоматизации процессов исследования позволяют в короткие сроки проводить массовые обследования животных с целью определения распространения этих инфекций. Сокращение времени на диагностику весьма существенно для неблагополучных по этим инфекциям хозяйствам, поскольку ускоренная постановка диагноза позволяет приступить к своевременному лечению и проведению профилактических мероприятий и, тем самым, оздоровить и сохранить поголовье скота.

Данную тест-систему можно использовать при оценке иммунного статуса поголовья, для контроля антигенной активности соответствующих компонентов моно- и поливалентных вакцин.

Источники информации

1. Ветеринария, 4, 2004, с.20

2. Ветеринария, 5, 2005, с.17-20.

Способ серологической диагностики вирусных желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа, преимущественно рота-, коронавирусного энтеритов, вирусной диареи крупного рогатого скота, включающий взаимодействие антигенов с антителами, с антивидовыми антителами, меченными пероксидазой хрена, добавление субстратной смеси и учет результатов реакции по интенсивности окраски образовавшегося комплекса, отличающийся тем, что в реакции используют планшеты с предварительно сорбированными на них антигенами рота-, коронавирусов, вируса диареи и после внесения испытуемых проб сывороток по 0,10-0,12 мл планшеты инкубируют 1,5-2 ч при 36-37°С, отмывают, далее вносят по 0,10-0,12 мл общего антивидового иммуноферментного конъюгата, состоящего из меченных ферментом антител против глобулинов сыворотки крови крупного рогатого скота и проводят учет результатов реакции.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии и аллергологии, и может быть использовано для прогнозирования развития атопических заболеваний у новорожденных.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения количества и (или) функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения количества и (или) функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Изобретение относится к способу определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Изобретение относится к новому комплексному антигену вируса кори для использования в качестве компонента иммуноферментной диагностической тест-системы и может быть использовано в медицинской вирусологии и микробиологии.

Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии, а именно к офтальмоонкологии, и предназначено для одновременной верификации увеальной меланомы и прогнозирования вероятности развития ее метастазов.

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к способам для обнаружения специфических антител к вирусам птиц при проведении диагностических исследований, а именно к парвовирусу гусей.
Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения содержания иммуноглобулинов А1 и А2 в препаратах, сыворотке крови и других биологических жидкостях.
Изобретение относится к области медицины, а именно к хирургии, и может быть использовано для прогнозирования тяжести течения послеоперационного периода у больных калькулезным холециститом

Изобретение относится к ветеринарии. Способ диагностики лептоспироза сельскохозяйственных животных, включающий определение наличия антител к антигенам семи серогрупп L.hebdomadis, L.pomona, L.tarassovi, L.grippotyphosa, L.canicola, L.sejroe и L.icterohaemorrhagiae в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что в качестве антигена применяют смешанные в равных количествах антигенные белки из лептоспир трех серогрупп - L.tarassovi, L.grippotyphosa и L.hebdomadis. Изобретение значительно упрощает и максимально сокращает диагностику лептоспироза, позволяет осуществлять оперативный контроль за эпизоотическим состоянием животных по лептоспирозу. Способ обладает высокой специфичностью, чувствительностью и стандартностью, а также обеспечивает создание безопасных условий труда для персонала диагностических лабораторий. 4 табл., 4 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для дооперационного прогноза осложненного течения раннего посттрансплантационного периода. Для этого перед трансплантацией печени в плазме крови измеряют концентрацию в нг/мл инсулиноподобного фактора роста-1 (ИФР-1) и соматотропного гормона (СТГ). Далее вычисляют индекс прогнозирования течения посттрансплантационного периода (К) по формуле: К=lg (ИФР-1/СТГ). При величине К, меньшей минус 1,7, прогнозируют осложненное течение раннего посттрансплантационного периода. Использование способа позволяет осуществить объективное прогнозирование у детей с врожденными заболеваниями гепатобилиарной системы течения раннего посттрансплантационного периода, проявляющегося дисфункцией трансплантата. 6 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии и экологии, в частности к тест-системам для определения содержания микополисахаридов и их производных, имеющих в своем составе участки, аналогичные синтетическому линейному нона-β-(1→3)-D-глюкозиду в окружающей среде, в том числе в пыли помещений, и может быть использовано для оценки пирогенности объектов окружающей среды при проведении экологического мониторинга жилых и производственных помещений с целью количественного определения пирогенной нагрузки пыли окружающей среды при помощи ингибиторного иммуноферментного анализа на твердой фазе. Тест-система включает в себя планшет с иммобилизованным на внутренней поверхности лунок конъюгатом синтетического линейного нона-β-(1→3)-D-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином, калибраторы, содержащие растворы синтетического линейного нона-β-(1→3)-D-глюкозида; лиофилизованную специфическую поликлональную кроличью антисыворотку; конъюгат антивидовых антител против IgG(H+L) кролика с пероксидазой из хрена; 25-кратный концентрат 0,1М фосфатно-солевого буферного раствора с 0,05% Tween-20 (ФСБ-Т) рН 7,2-7,4; раствор для разведения поликлональной антисыворотки; раствор для разведения конъюгата антивидовых антител против IgG(H+L) кролика с пероксидазой из хрена; хромоген; стоп-реагент. Изобретение является удобным и эффективным для исследований в области экологии. 2 табл., 6 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики высокодифференцированного рака у больных с узловыми формами заболеваний щитовидной железы. Для этого проводят тонкоигольную аспирационную биопсию узловых образований щитовидной железы под контролем ультразвукового исследования. При этом пункционную иглу с содержащимся в ней аспиратам промывают двукратно 1 мл изотонического раствора натрия хлорида, затем центрифугируют, отбирают супернатант и методом иммуноферментного анализа определяют тиреоглобулин. Причем если содержание тиреоглобулина меньше 272,5 нг/мл - предполагают отсутствие высокодифференцированного рака щитовидной железы, в интервале 272,5-355,5 нг/мл - риск высокодифференцированного рака щитовидной железы, выше 355,5 нг/мл предполагают высокодифференцированный рак щитовидной железы. Изобретение обеспечивает дооперационную дифференциальную диагностику высокодифференцированного рака у больных с узловыми формами заболеваний щитовидной железы, а также обеспечивает возможность дальнейшего выбора адекватного метода лечения. 3 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для прогнозирования формирования окклюзионной постгеморрагической гидроцефалии у недоношенных детей с экстремально низкой массой тела при рождении. Недоношенному ребенку на основании иммуноферментного исследования сыворотки пуповинной и периферической крови определяют концентрацию нейронспецифической енолазы (NSE), концентрацию мозгового нейротрофического фактора (BDNF), концентрацию васкулоэндотелиального фактора (VEGF) в пуповинной крови и концентрацию васкулоэндотелиального фактора (VEGF) в периферической крови на 7-е сутки жизни, вычисляют прогностический индекс (PI) по формуле: PI=-0,007×X1+0,006×X2-0,05×Х3+0,0004×Х4-3,9, где X1 - содержание VEGF в пуповинной крови при рождении (нг/мл); Х2 - содержание VEGF в периферической крови на 7 сутки жизни (нг/мл); Х3 - содержание NSE в пуповинной крови (мкг/л); Х4 - содержание BDNF в пуповинной крови (нг/мл); Const=-3,9. При PI более 0 делают заключение об отсутствии риска формирования окклюзионной постгеморрагической гидроцефалии, а при PI менее 0 прогнозируют высокий риск развития данной патологии. Изобретение позволяет повысить эффективность прогноза формирования окклюзионной постгеморрагической гидроцефалии у недоношенных детей с экстремально низкой массой тела при рождении до 73%. 2 пр.
Предлагаемое изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения иммуноферментной тест-системы для определения эпитопов оболочечного белка вируса Пуумала протективной направленности в вакцинных препаратах против геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Охарактеризованный способ включает получение мышиных моноклональных антител, обладающих нейтрализующей активностью по отношению к вирусу Пуумала. Сорбцию таких антител на поверхность иммунопанели. Выделение IgG из сывороток крови реконвалесцентов ГЛПС с высокими титрами специфических антител к вирусу Пуумала. Приготовление конъюгата специфических IgG с пероксидазой хрена. Представленное изобретение позволяет с одинаковой чувствительностью выявлять оболочечный белок как живого, так и инактивированного вируса Пуумала, посредством чего контролировать содержание в вакцинном препарате указанного вируса, являющегося возбудителем геморрагической лихорадки с почечным синдромом. 2 табл., 1 пр.
Изобретение относится к медицине. Способ характеризуется тем, что в сыворотке крови пациента определяют концентрации пепсиногенов I и II, вычисляют отношение концентрации пепсиногена I к концентрации пепсиногена II. При величине данного отношения, равной или ниже нижней границы нормы, определяют концентрацию интерферона-γ (IFNγ) в супернатанте пробы крови данного пациента после ее инкубации с раково-эмбриональным антигеном (РЭА) и без него, вычисляют индекс влияния (ИВ) РЭА на продукцию IFNγ (ИВ РЭА IFNγ) клетками крови по формуле: ИВ РЭА IFNγ=А/Б, где А - концентрация IFNγ в супернатанте пробы крови после ее инкубации с РЭА, Б - концентрация IFNγ в супернатанте пробы крови без ее инкубации с РЭА, и при величине ИВ РЭА IFNγ, равной или ниже 1,2, делают вывод о наличии у пациента дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка 2-й или 3-й степени, а при величине ИВ РЭА IFNγ, превышающей 1,2, делают вывод об отсутствии дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка у данного пациента или о наличии у него дисплазии 1-й степени. При использовании для иммуноферментного анализа наборов реагентов «Пепсиноген 1 - ИФА - БЕСТ» и «Пепсиноген 2 - ИФА - БЕСТ» производства ЗАО «Вектор-Бест» нижнюю границы нормы отношения концентрации пепсиногена I к концентрации пепсиногена II принимают равной трем. Способ позволяет выявить дисплазию (клеточный атипизм) эпителия слизистой оболочки желудка 2-й или 3-й степени у пациентов, у которых еще не была обнаружена атрофия слизистой оболочки желудка, т.е. предлагаемый способ дает возможность формировать группы риска пациентов по развитию у них опухолевой патологии желудка и проводить ее профилактику. Способ высокочувствителен, высокоспецифичен, низкоинвазивен. 1 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики первичного и вторичного иммунного ответа на вирус краснухи. Разделение типов иммунного ответа на первичный и вторичный осуществляют на основании рассчитанных с помощью ROC-анализа пороговых критериев для IgG1 и IgG3 субклассов по результатам определения количества специфических антител. Определяют субклассы IgG1 и IgG3 с помощью ИФА-анализа. При получении пороговых значений для IgG1<62,76% и для IgG3>18,63% от общего количества противокраснушных IgG-антител диагностируют первичный иммунный ответ. При получении пороговых значений для IgG1>62,76%, и для IgG3<18,63% от общего количества противокраснушных IgG-антител диагностируют вторичный иммунный ответ. Использование данного способа позволяет провести дифференциальную диагностику первичного и вторичного иммунного ответа на вирусы краснухи, позволяющего независимо от способа получения этого иммунитета (вакцинация или инфекция) четко различать первый или повторный контакт организма с вирусом краснухи, что способствует выявлению среди лиц с неизвестным прививочным анамнезом группу первичных больных краснухой. 3 табл., 1 пр.
Наверх