Способ дифференциации штаммов vibrio cholerae 0139 серогруппы по алкилсульфатозной активности



Способ дифференциации штаммов vibrio cholerae 0139 серогруппы по алкилсульфатозной активности
Способ дифференциации штаммов vibrio cholerae 0139 серогруппы по алкилсульфатозной активности

 


Владельцы патента RU 2473697:

Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Предлагаемое изобретение относится к области медицинской микробиологии и касается дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы. Описанный способ включает получение синтетической среды для приготовления 100 мл которой готовят навески: 0,5 г хлористого натрия, 2 г агара, 0,002 г индикатора бромтимолового синего, затем компоненты навесок растворяют в 100 мл 0,01 М трис НСl буфере с рН 7,8 и кипятят в течение 30 минут, добавление к полученной среде субстрата в виде 1% водного раствора додецилсульфата натрия (SDS) до конечной концентрации 0,1% его в среде, посев исследуемых культур петлей на полученную синтетическую среду с последующим инкубированием в течение 24-48 часов и проведение учета результатов по наличию на секторах агара мутно-белых зон вокруг посевов размером 2-10 мм, при наличии таких зон штамм относят к токсигенным (ctx+ tcp+), а при отсутствии - к нетоксигенным (ctx- tcp-). Представленный способ является простым и наглядным и может быть использован для определения эпидемической значимости штаммов Vibrio cholerae 0139 серогруппы. 3 табл., 3 пр.

 

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы, используя способность холерных вибрионов подвергать гидролизу поверхностно-активные вещества, в число которых входит анионное поверхностно-активное вещество додецилсульфат натрия (SDS).

Известен способ дифференциации ctx+tcp+и ctx-tcp- холерных вибрионов 0139 серогруппы в ПЦР (см. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство/Под редакцией Г.Г.Онищенко и В.В.Кутырева. Издательство «Медицина», издательство «Шико», 2009. - С.77-79.), заключающийся в амплификации участка генома, ограниченного парой специфических праймеров, путем многократного копирования при помощи фермента - термостабильной ДНК-полимеразы. Недостатком известного способа является использование дорогостоящего оборудования, реактивов, сертифицированной лаборатории и специалистов, что усложняет способ дифференцирования.

Наиболее близким по технической сущности является способ изучения алкилсульфатазной активности холерных вибрионов и некоторых других микроорганизмов (статья Г.М.Грижебовский Т.А.Аболина и др. «Изучение алкилсульфатазной активности холерных вибрионов и некоторых других микроорганизмов» // Холера. Материалы Российской научной конференции. - г.Ростов-на-Дону, 1992 г. стр.127-129), заключающийся в том, что используют в качестве питательной среды плотную агаризованную минеральную основу, содержащую 0.01% однозамещенного фосфорнокислого калия, 0.05% хлористого натрия, 0.1% азотнокислого аммония, следы сернокислого железа, 1% пептона, 2% агара и 0.1% додецилсульфата натрия, рН среды 7.6, затем после 20 мин стерилизации на агаровой пластине просекали лунки диаметром 5-10 мм, в которые вносили суспензии микроорганизмов в концентрации 108-109 м.к./мл, после проводят инкубирование при 37°С в течение 48 часов и учет результатов осуществляют при просмотре чашек в проходящем свете, при наличии алкилсульфатазной активности вокруг лунок просматривались зоны помутнения.

Однако известный способ опробирован на холерных вибрионах 01 серогруппы, имеет многокомпонентную питательную среду и трудоемкость в приготовлении. Кроме того, присутствуют сложности в постановке реакции, а именно требуется формирование лунок диаметром 5-10 мм на агаровой пластине методом просечки, приготовление клеток нужной концентрации. Фенотипическое проявление алкилсульфатазной активности у штаммов V. cholerae 0139 серогруппы не изучено. Эти обстоятельства подтверждают, что к настоящему времени отсутствует простой, наглядный способ дифференциации холерных вибрионов 0139 серогруппы клинического (ctx+ tcp+) и водного происхождения (ctx- tcp-) по алкилсульфатазной активности.

Техническая задача предлагаемого изобретения состояла в разработке простого и наглядного способа дифференциации штаммов V. cholerae 0139 серогруппы по алкилсульфатазной активности.

Поставленная задача достигается тем, что в известном способе дифференциации штаммов Vibrio cholerae 0139 серогруппы по алкилсульфатазной активности, включающем нанесение исследуемой культуры на среду субстратом - додецилсульфатом натрия, инкубирование посевов при 37°С и дифференциацию по зонам помутнения, создают синтетическую среду, для приготовления 100 мл которой необходимо: 0,5 г хлористого натрия, 2 г агара, 0,002 г индикатора бромтимолового синего, затем компоненты навесок растворяют в 100 мл 0,01 М трис HCl буфере с рН 7,8 и кипятят в течение 30 минут, после этого к полученной среде добавляют субстрат в виде 1% водного раствора додецилсульфата натрия (SDS) до конечной концентрации 0,01% его в среде, потом проводят посев исследуемых культур петлей на полученную синтетическую среду с последующим инкубированием в течение 24-48 часов, учет результатов проводят по наличию на секторах агара мутно-белых зон вокруг посевов размером (2-10) мм и делают вывод, что исследуемый штамм гидролизует субстрат SDS, проявляя алкилсульфатозную активность, поэтому его дифференцируют как токсигенный (ctx+ tcp+) - эпидемически значимый, а отсутствие таких зон подтверждает, что нет гидролиза и соответственно алкилсульфатозной активности, поэтому штамм является нетоксигенным (ctx- tcp-) - эпидемически незначимым.

Способ осуществляется следующим образом.

Первоначально проводят подготовку исследуемых культур, для этого на чашки агара Мартена с рН 7.8, петлей высевают исследуемые штаммы холерных вибрионов 0139 серогруппы и инкубируют в течение 18 часов при 37°С в термостате.

Затем создают новую синтетическую среду, для приготовления на 100 мл которой необходимо сделать навески: 0.5 г хлористого натрия, 2 г агара, 0,002 г бромтимолового синего в качестве индикатора. Приготовленные навески растворяют в 100 мл 0,01 М трис HCl буфере, имеющего рН 7,8, и кипятят в течение 30 минут до их полного растворения.

Одновременно готовят субстрат, для этого отвешивают навеску 1 г кристаллического додецилсульфат натрия (SDS) и растворяют в 100 мл дистиллированной воды, получая 1% водный раствор, который кипятят один раз на водяной бане. После этого к 90 мл приготовленной среды добавляют 10 мл водного раствора субстрата додецилсульфата натрия до получения конечной концентрации его в среде в количестве 0,1%.

Полученную синтетическую среду разливают в чашки Петри. Посев исследуемой культуры на среду осуществляют петлей «пяточками» и инкубируют при 37°С в течение 24-48 часов.

В результате додецилсульфат натрия, который добавляют в полученную синтетическую среду, подвергается гидролизу штаммами холерных вибрионов 0139 серогруппы, выделенными из клинического материала, и не гидролизуется штаммами холерных вибрионов 0139 серогруппы, выделенными из воды. Деструкцию додуцилсульфата натрия (первичного алкилсульфата) осуществляет фермент - алкилсульфатаза с образованием не растворимого в воде додеканола-1.

Таким образом, алкилсульфатазную активность холерных вибрионов 0139 серогруппы рассматривают как дифференциальный признак для клинических (ctx+ tcp+) и водных штаммов (ctx- tcp-) по алкилсульфатазной активности.

Учет результатов осуществляют через 24-48 часов. Если на секторах агара вокруг посевов четко просматриваются мутно-белые зоны (2-10 мм), то делают вывод о том, что исследуемый штамм токсигенный - эпидемически значимый и проявляет алкилсульфатазную активность, т.е. способен гидролизовать субстрат SDS. Если на секторах агара вокруг посевов исследуемых штаммов зоны не образуются, то исследуемые штаммы холерного вибриона 0139 серогруппы являются нетоксигенными - эпидемически незначимыми, т.е. не проявляет алкилсульфатазную активность и не гидролизует предложенный субстрат.

Пример 1

В качестве исследуемых штаммов используют культуры V. cholerae 0139 «Бенгал» Р-16064, Р-16077 (ctx+tcp+) и Р-17918, Р-17673 (ctx-tcp-). В качестве положительного контроля - штаммы V. cholerae eltor №5879 ctx+tcp+), V.cholerae classica 569 В (ctx+tcp+). Отрицательным контролем служил штамм V.cholerae eltor №14312 (ctx-tcp-). В качестве субстрата используют додецилсульфат натрия в концентрации 1-2%. Учет результатов осуществляют через 24-48 часов культивирования (см. таблица1).

Из таблицы 1 видно, что при концентрации в среде 1-2% додецилсульфата натрия выявить алкилсульфатазную активность микроорганизмов и провести дифференциацию токсигенных от нетоксигенных вариантов невозможно, т.к. концентрация субстрата в среде превышает оптимальную для проявления искомой активности и ингибирует рост некоторых культур, а также делает невозможным проявление алкилсульфатазной активности. Об этом свидетельствует плохой рост культур и отсутствие вокруг посевов непрозрачных мутно-белых зон, а соответственно отсутствие гидролиза SDS.

Пример 2

В качестве исследуемых штаммов используют культуры V. cholerae 0139 «Бенгал» Р-16064, Р-16077 (ctx+tcp+) и Р-17918, Р-17673 (ctx-tcp-). В качестве положительного контроля использовали штаммы V. cholerae eltor №5879 (ctx+tcp+), V.cholerae classica 569 В (ctx+tcp+). Как отрицательный контроль: штамм V.cholerae eltor №14312 (ctx-tcp-). В качестве субстрата используют додецилсульфат натрия в концентрации 0.1%. Учет результатов через 24-48 часов культивирования (см. таблица 2).

Из таблицы 2 видно, что при концентрации в среде 0.1% SDS наблюдают дифференциацию токсигенных (ctx+tcp+) и нетоксигенных (ctx-tcp-) вариантов холерных вибрионов 0139 серогруппы по алкилсульфатазной активности. При этом токсигенные штаммы вокруг посева образуют непрозрачные мутно-белые зоны за счет деструкции додецилсульфата натрия с образованием нерастворимого в воде додеканола-1. Следует отметить, что после 24 часов инкубации у некоторых культур на фоне непрозрачных мутно-белых зон появляются образования в виде «годичных колец» с просветлениями, что связано с поэтапным гидролизом субстрата. Нетоксигенные штаммы не обладают способностью гидролизовать SDS и не образуют вокруг посевов в предложенные сроки наблюдения непрозрачных мутно-белых зон. Таким образом, по способности гидролизовать 0.1% SDS холерными вибрионами на синтетической среде можно сделать предварительное заключение о токсигенности штаммов, что определяет их эпидзначимость, следовательно, дифференциация токсигенных ctx+tcp+ штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы возможна на этапе культивирования штаммов в течение 24-48 часов.

Пример 3

В качестве исследуемых штаммов используют культуры V.cholerae 0139 «Бенгал» Р-16064, №16077 (ctx+tcp+) и Р-17918, Р-17673 (ctx-tcp-). В качестве положительного контроля использовали штаммы V. cholerae eltor №5879 (ctx+tcp+), V.cholerae classica 569 В (ctx+tcp+). Как отрицательный контроль: штамм V.cholerae eltor №14312 (ctx-tcp-). В качестве субстрата используют додецилсульфат натрия в концентрации 0.1% (см. таблица 3). Учет результатов реакции производили через 6, 24, 48 и 72 часов культивирования на среде.

Из данных таблицы 3 видно, что при культивировании в течение 6 часов штаммы V.cholerae 0139 «Бенгал» Р-16064, №16077 и Р-17918, Р-17673 не гидролизуют SDS (нет образования непрозрачных мутновато-белых зон). Нельзя определить эпидзначимость исследуемых штаммов и провести дифференциацию по изучаемому признаку.

При культивировании штаммов в течение 24 часов токсигенные штаммы V. cholerae 0139 серогруппы (Р-16064, №16077) вокруг посева образуют непрозрачные мутно-белые зоны за счет деструкции додуцилсульфата натрия с образованием не растворимого в воде додеканола-1.

Таким образом, нетоксигенные штаммы V. cholerae 0139 (Р-17918, Р-17673) не обладают способностью гидролизовать SDS и не образуют вокруг посевов непрозрачные мутно-белые зоны. Из этих данных можно заключить, что дифференциация токсигенных (ctx+tcp+) и нетоксигенных (ctx-tcp-) штаммов холерных вибрионов возможна на этапе культивирования штаммов на питательной среде с SDS в течение 24 часов, однако при культивировании штаммов в течение 48 часов наблюдается более активный гидролиз SDS (с образованием непрозрачных мутно-белых зон) вокруг роста токсигенных штаммов. У некоторых культур на фоне непрозрачных мутновато-белых зон появляются образования в виде «годичных колец» с просветлениями, что связано с поэтапным гидролизом субстрата, в то же время гидролиз SDS у нетоксигенных штаммов 0139 серогруппы не происходит (нет образования непрозрачных мутновато-белых зон) вокруг роста штаммов. Через 72 часа с момента культивирования все контрольные токсигенные штаммы V.cholerae 01№5879 (ctx+tcp+), V.cholerae classica 569 В (ctx+tcp+) и V.cholerae 0139 «Бенгал» Р-16064, №16077 (ctx+tcp+) проявляют алкилсульфатазную активность. Гидролиз SDS штаммами Р-17918, Р-17673 не происходит (нет образования непрозрачных мутно-белых зон). Дифференциацию на этом этапе осуществлять можно, однако с учетом активного гидролиза SDS непрозрачные мутно-белые зоны в результате активного гидролиза резко увеличиваются в диаметре, что в ряде случаев может затруднять учет результатов.

Использование предлагаемого изобретения позволяет за счет новой синтетической среды с добавлением додецилсульфата натрия в качестве стандартного субстрата в оптимальной концентрации 0.1% /100 мл среды осуществлять простым, наглядным способом дифференциацию по алкилсульфатазной активности токсигенных (ctx+tcp+) и нетоксигенных(ctx-tcp-) штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы.

Кроме того, приготовление синтетической среды экономически выгодно, так как не требует специального оборудования и дорогостоящих реактивов, продолжительность хранения составляет до 1 года при 4°С без добавления SDS.

Таблица 1
Биовариант № штамма Характеристика по ПЦР Характеристика проявления алкилсульфатазной активности Определение эпидзначимости штамма
Серовариант ctx tcp
P-16064 ctx+tcp+ Гидролиз SDS (образование непрозрачных мутно-белых зон) вокруг роста штаммов) отсутствует. Проявляется ингибирование роста некоторых культур.
V.cholerae 0139 «Бенгал» №16077
P-17918 ctx-tcp-
P-17673
V.cholerae eltor 5879 ctx+tcp+ Гидролиз SDS(образование непрозрачных мутно-белых зон) вокруг роста штаммов) отсутствует. Проявляется ингибирование роста некоторых культур. Алкилсульфатазная активность не выявлена, все штамммы сработали одинаково, дифференциация невозможна, эпидзначимость не установлена
P-14312 ctx-tcp-
V.cholerae classica 569 В ctx+tcp+ Гидролиз SDS (образование непрозрачных мутно-белых зон) вокруг роста штаммов) отсутствует. Проявляется ингибирование роста некоторых культур.

Способ дифференциации штаммов Vibrio cholerae 0139 серогруппы по алкилсульфатазной активности на токсигенные (ctx+ tcp+) и нетоксигенные (ctx- tcp-), включающий нанесение исследуемой культуры на среду с субстратом - додецилсульфатом натрия, инкубирование посевов при 37°С и дифференциацию по зонам помутнения, отличающийся тем, что создают синтетическую среду, для приготовления 100 мл которой готовят навески: 0,5 г хлористого натрия, 2 г агара, 0,002 г индикатора бромтимолового синего, затем компоненты навесок растворяют 100 мл 0,01 М трис НСl буфере с рН 7,8 и кипятят в течение 30 мин, после этого к полученной среде добавляют субстрат в виде 1%-ного водного раствора додецилсульфата натрия (SDS) до конечной концентрации 0,1% его в среде, потом проводят посев исследуемых культур петлей на полученную синтетическую среду с последующим инкубированием в течение 24-48 ч, учет результатов проводят по наличию на секторах агара мутно-белых зон вокруг посевов размером 2-10 мм и делают вывод, что исследуемый штамм гидролизует субстрат SDS, проявляя алкилсульфатазную активность, и является токсигенным (ctx+ tcp+), а отсутствие таких зон подтверждает, что нет гидролиза и соответственно алкилсульфатазной активности, и штамм является нетоксигенным (ctx- tcp-).



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии, и предназначено для повышения эффективности микробиологической диагностики стафилококковых инфекций.

Изобретение относится к медицине, а именно к области фтизиатрии и бактериологии, и может быть использовано для определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза.
Изобретение относится к области медицины. .
Изобретение относится к области медицины и медицинской микробиологии и может быть использовано для изучения выживаемости пробиотических микроорганизмов в модельных средах, содержащих ферментные препараты, аналогичные таковым в желудке и кишечнике человека.

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, разделу микологии, и может быть использовано для усовершенствования диагностики, прогнозирования клинического течения микроспории, продолжительности заболевания и лечения.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам выделения чистой культуры микроорганизмов из патологического биоматериала, и может быть использовано в ветеринарной медицине и животноводстве.

Изобретение относится к медицинским методам диагностики хламидиоза, гарднереллеза, трихоманиаза, уреаплазмоза, микоплазмоза по составу равновесной газовой фазы над цервикальной слизью и может быть использовано для определения наличия их возбудителей в пробе цервикальной слизи.
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в исследовательской работе НИИ и практической работе бактериологических лабораторий клинических учреждений для изучения механизма эпителиально-бактериальных взаимодействий и их роли в формировании нормальных микробиоценозов тела человека.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и биотехнологии и может быть использовано при определении эффективных мер лечения хронических инфекционных заболеваний человека в условиях моделирования в доклинических экспериментах.
Изобретение относится к области медицинской микробиологии и, в частности, к детекции антибиотикоустойчивых штаммов возбудителя чумы. .

Изобретение относится к областям микробиологии и иммунологии. .

Изобретение относится к области микробиологии и касается штамма Bifidobacterium longum, композиции его содержащей и применения такого штамма. .
Изобретение относится к биотехнологии. .
Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к клинической микробиологии. .
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к пробиотическим препаратам, используемым в медицине и ветеринарии для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека и животных, вызванных патогенными и условно патогенными микроорганизмами, а также дисбактериозов, обусловленных этиологически разнородными факторами (инфекциями, антибиотике- и химиотерапией, ионизирующими излучениями, острыми и хроническими интоксикациями и др.) и технологии их получения.

Изобретение относится к применению Lactobacillus casei для потенцирования гуморального ответа, индуцированного вакцинацией от гриппа, у больных пожилого возраста, и таким образом повышения защиты от гриппа после вакцинации.

Изобретение относится к медицине, а именно к области фтизиатрии и бактериологии, и может быть использовано для определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству пробиотических бактериальных препаратов, и может быть использовано для лечения и профилактики туберкулеза у людей и животных.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается олигонуклеотидных праймеров для генотипирования В.mallei
Наверх