Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления bifidobacterium longum subspecies longum в заквасочных культурах, используемых при призводстве кисломолочных продуктов

Авторы патента:

C12Q1/14 - стрептококки; стафилококки

Владельцы патента RU 2473698:

Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии) (RU)

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к ДНК-технологиям. Предложены синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ для выявления Bifidobacterium longum subspecies longum в заквасочных культурах, используемых при производстве кисломолочных продуктов. Предложенный способ включает проведение ПЦР. В случае выявления фрагмента ДНК размером 447 н.п. делают заключение о наличии в исследуемом биоматериале Bifidobacterium longum subspecies longum. Способ может быть использован в молокоперерабатывающей промышленности для выявления и идентификации штаммов и культур Bifidobacterium longum subspecies longum в заквасочных культурах, используемых при производстве кисломолочных продуктов. 2 н.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к ДНК-технологиям, и может быть использовано в молокоперерабатывающей промышленности для генотипирования штаммов и культур Bifidobacterium longum subspecies longum.

Одним из способов выявления Bifidobacterium, кроме микробиологического, является ПЦР-метод с использованием праймеров lm26 и lm3, позволяющий синтезировать сегмент 16S rRNA размером в 1,35 кb., позволяющий различать бифидобактерии от других бактерий (Р.Kaufman, A.Pfefferkorn, M.Teuber and L.Meile / Identification and Quantification of Bifidobacterium Species Isolated from Food with Genus-Specific 16S rRNA-Targeted Probes by Colony Hybridization and PCR // Appl. and Environ. Microbiol. - Apr. 1997. - Vol.63, No.4. - P.1268-1273

К недостаткам данного способа можно отнести то, что выявляется только род - это Bifidobacterium, невозможна дифференциация на виды и подвиды.

Другим решением данного способа является синтез с помощью ПЦР генов 16S rRNA при использовании праймеров, подобранных на основе последовательностей 16S rRNA пяти видов Bifidobacterium: bifidum, adolescentis, infantis, breve и longum. Можно выявлять не только род, но и вид данных бактерий (Dong X, Cheng G, Jian W. / Simultaneous identification of five Bifidobacterium species isolated from human beings using multiple PCR primers // Syst Appl Microbiol. - 2000. - Oct. - vol.23(3). - P.386-390) с учетом точечных мутаций характерных для рода и видов Bifidobacterium species (T. Matsuki, К. Watanabe, J. Fujimoto, Y. Kado, T. Takada / Quantitative PCR with 16S rRNA-Gene-Targeted Species-Specific Primers for Analysis of Human Intestinal Bifidobacteria // Appl. and Environ. Microbiol. - Jan. 2004. - vol.70. - No. 1. - P.167-173).

К недостаткам данного способа можно отнести то, что выявляется только род и вид Bifidobacterium и невозможна дифференциация на подвиды.

Задачей изобретения является расширение арсенала специфических олигонуклеотидных праймеров и способов выявления Bifidobacterium longum subspecies longum при помощи специфических синтетических олигонуклеотидных праймеров.

Поставленная задача решается тем, что синтезируются синтетические олигонуклеотидные праймеры для выявления Bifidobacterium longum subspecies longum в заквасочных культурах при производстве молочнокислых продуктов, согласно изобретению, праймеры имеют нуклеотидные последовательности:

Bill 1F 5'-gggtgcctatcgtttgcc-3'

Bill 2R 5'-сccagcatggagtcggcgg-3'.

Задача решается тем, что в способе выявления Bifidobacterium longum subspecies longum в заквасочных культурах при производстве молочнокислых продуктов, включающем проведение ПЦР с олигонуклеотидными праймерами, согласно изобретению, праймеры имеют нуклеотидную последовательность

Bill 1F 5'-gggtgcctatcgtttgcc-3'

Bill 2R 5'-сccagcatggagtcggcgg-3',

а в случае выявления фрагмента ДНК размером 447 н.п. делают заключение о наличии в исследуемом биологическом материале Bifidobacterium longum subspecies longum.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Способ получения синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления Bifidobacterium longum subspecies longum в заквасочных культурах при производстве молочнокислых продуктов

Поиск новых специфических праймеров осуществляют на основе выбранного фрагмента ДНК гена BLLJ1840 glycosyi hydrolase, характерного для Bifidobacterium longum subspecies longum, при анализе полных геномов референтных штаммов Bifidobacterium longum subspecies longum: JCM1217, JDM301, DJO10A, BBHN68, NCC2705 и 157F, представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank Search.html). Выбранные фрагменты ДНК тестируют с помощью программы Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).

Окончательный выбор праймеров основывается на следующих критериях: высокий уровень сходства специфического фрагмента ДНК Bifidobacterium longum subspecies longum с ДНК различных штаммов этой бактерии. Олигонуклеотиды должны быть комплементарны последовательности ДНК на границах специфического фрагмента с содержанием оснований GC не менее 50% и не образовывать димеры.

Химический синтез праймеров осуществляют амидофосфитным методом на автоматическом синтезаторе ASM-102U.

Концентрацию специфических олигонуклеотидных праймеров в маточном растворе определяют спектрометрическим методом.

Таким образом, указанный способ позволяет получать синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные ДНК фрагмента гена glycosyl hydrolase, характерного только для Bifidobacterium longum subspecies longum.

Пример 2. Способ применения синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления Bifidobacterium longum subspecies longum в заквасочных культурах при производстве молочнокислых продуктов

Способ осуществляется в несколько этапов.

Этап 1. Выделение ДНК Bifidobacterium longum subspecies longum.

Для выделения ДНК берут суспензии штаммов и изолятов Bifidobacterium longum subspecies longum, выращенных на питательном бульоне из гидролизованного молока (БГМ), а также биоматериал от кисломолочных продуктов.

При выделении из бактериальной культуры клетки осаждают в бляшку центрифугированием 1-2 мин при 5000-7000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют. 100 мкл культуры добавляют к 400 мкл подогретого до +80°С 10% СТАВ, перемешивают и инкубируют при +80°С в течение 40 минут. Затем охлаждают до комнатной температуры и добавляют 0,5 объема (250-300 мкл) смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1), плавно перемешивают 2-3 раза в течение 1-2 мин и центрифугируют в течение 10 мин при 13000 об/мин. Водную фазу переносят в другую пробирку и к ней приливают 300 мкл смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1), перемешивают 1 мин и центрифугируют 6 мин при 13000 об/мин. К водной фазе прибавляют 50 мкл (1/10 объема) 3М ацетата натрия рН 4,8 и 1000 мкл этанола, перемешивают и помещают на 1 час при -20°С. Пробу центрифугируют 10 мин при 13000 об/мин, осадок промывают 70% этанолом, высушивают при наклонном положении пробирки при +37°С в течение 25-30 мин и растворяют в 30-50 мкл автоклавированной бидистиллированной воды.

Этап 2. Проведение полимеразной цепной реакции.

Состав реакционной смеси. Для каждой исследуемой пробы ДНК готовят ПЦР-смесь: 650 мМ трис-НСl рН 8,9; 160 мМ (NH)₄SO₄; 30 мМ MgCl; 0,5% Tvin-20; 2,5 мМ dNTP, по 0,25 мкМ каждого праймера; 0,5 е.а. Taq-ДНК полимеразы; 2 мкл пробы ДНК и автоклавированной бидистиллированной воды до 25 мкл.

Температурный режим проведения ПЦР. Программа амплификации состоит из следующих температурных режимов: прогревание реакционной смеси при 95°С в течение 3 мин - 1 цикл, затем денатурация при 94°С 0,2 мин, отжиг при 56°С 0,2 мин, элонгация при 72°С 0,4 мин - 35 циклов и досинтез при 72°С в течение 0,8 мин.

Этап 3. Определение размера продуктов ПЦР.

Электрофорез ампликонов проводят в 0,5х трис-боратном буфере, приготовленном из 5х ТБЕ буфера (0,089 М трис-борат; 0,089 М борная кислота; 0,002 М ЭДТА).

Продукты ПЦР визуализировали путем электрофореза в 1%-ном геле агарозы с бромистым этидием при силе тока 40 мА в течение 25-30 мин. 12,5 мкл ампликона смешивают с 3 мкл буфера для нанесения (0,25% бромфенолового синего, 30% глицерин в бидистиллированной воде) и вносят в лунки геля под электрофорезный буфер. Электрофорез проводят при напряжении 10 в/см длины геля до тех пор, пока краситель пройдет от старта не менее 2,0-2,5 см геля (примерно 35 минут). Результаты электрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор».

В качестве маркера используют ДНК pBLSK, гидролизованную MspI (на фрагменты 710, 489, 404, 328, 242, 190 н.п.).

Результат ПЦР считают положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента ДНК в 447 нуклеотидных пар.

Пример 3. Определение специфичности ПЦР.

Результаты исследований по определению специфичности реакции с праймерами Bill 1F и Bill 2R представлены в таблице 1, которые показывают, что положительные анализы продуктов ПЦР получают только тогда, когда в качестве матрицы используют ДНК фрагмента гена BLLJ1840 glycosyl hydrolase, характерного только для Bifidobacterium longum subspecies longum. Анализы были отрицательными, когда использовали ДНК других бактерий.

Таблица 1
№ п/п	Наименование культуры	ПЦР с праймерами Bill 1F и Bill 2R
1	Staphylococcus albus	Отрицательно
2	Staphylococcus aureus	Отрицательно
3	Streptococcus epidermitis	Отрицательно
4	Streptococcus pyogenes	Отрицательно
5	Escherihia coli	Отрицательно
6	Proteus vulgaris	Отрицательно
7	Streptococcus termophilus 28-2. Коллекция ВНИИМС, Углич	Отрицательно
8	Lactococcus lactis subsp.lactis C9182. Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул	Отрицательно
9	Lactococcus lactis subsp.cremoris 3M-5. Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул	Отрицательно
10	Bifidobacter. longum subsp.longum 3-1. Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул	Положительно
11	Bifidobacter. longum subsp.longum S-3. Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул	Положительно
12	Bifidobacter. longum subsp.longum KS-3. Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул	Положительно
13	Bifidobacter. longum subsp.longum T4. Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул	Положительно
14	Bifidobacter. longum subsp.longum ST. Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул	Положительно
15	Bifidobacter. longum subsp.longum KST. Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул	Положительно
16	Bifidobact. Long. subsp.longum MC-2H. Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул	Положительно
17	Bifidobac. Long. subsp.longum MC42M. Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул	Положительно
18	Дистиллированная вода	Отрицательно

Для подтверждения специфичности тестируемого фрагмента гена BLLJ1840 glycosyl hydrolase, характерного только для Bifidobacterium longum subspecies longums, наработали фрагмент на матрице ДНК штамма Bifidobacterium longum subspecies longum ST (Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул) и провели секвенирование.

Анализ нуклеотидных последовательностей синтезируемых фрагментов провели методами выравнивания с другими опубликованными последовательностями полных геномов референтных штаммов Bifidobacterium longum subspecies longum: JCM1217, JDM301, DJO10A, BBHN68, NCC2705 и 157F, представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ GenBank Search.html). Установили, что рассматриваемая нуклеотидная последовательность штамма Bifidobacterium longum subspecies longum ST (коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул) совпадала с нуклеотидной последовательностью вышеназванных референтных штаммов Bifidobacterium longum subspecies longum JCM1217, JDM301, DJO10A, BBHN68, NCC2705 и 157F.

Таким образом, разработанные синтетические олигонуклеотидные праймеры для выявления ДНК гена BLLJ1840 glycosyl hydrolase, характерного только для Bifidobacterium longum subspecies longum, обладают высокой специфичностью и позволяют эффективно проводить идентификацию штаммов и культур Bifidobacterium longum subspecies longum, используемых в заквасочных культурах молокоперерабатывающей промышленности.

1. Синтетические олигонуклеотидные праймеры для выявления Bifidobacterium longum subspecies longum в заквасочных культурах, используемых при производстве кисломолочных продуктов, имеют нуклеотидные последовательности:
Bill 1F 5'-ggg tgc cta tcg ttt gcc-3'
Bill 2R 5'-с cca gca tgg agt cgg cgg-3'.

2. Способ выявления Bifidobacterium longum subspecies longum в заквасочных культурах, используемых при производстве кисломолочных продуктов, включающий проведение ПЦР с олигонуклеотидными праймерами, праймеры имеют нуклеотидную последовательность
Bill 1F 5'-ggg tgc cta tcg ttt gcc-3'18
Bill 2R 5'-с cca gca tgg agt cgg cgg-3'19,
а в случае выявления фрагмента ДНК размером 447 н.п. делают заключение о наличии в исследуемом биологическом материале Bifidobacterium longum subspecies longum.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к ДНК-технологиям. .

Способ определения адгезии staphylococcus spp. к гемопротеинам // 2393229

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в медицинской бактериологии для количественной оценки адгезивных свойств стафилококков, выделенных от человека и объектов окружающей среды при его бактериологической идентификации, для характеристики его вирулентных свойств in vitro по уровню адгезии к биополимерным молекулам.

Среда для дифференциальной диагностики энтеробактерий // 2376386

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для ускоренной индикации и дифференциации энтеробактерий. .

Селективная культуральная среда для выделения и выявления видов рода streptococcus // 2342435

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для идентификации видов Streptococcus по появлению трех разных оттенков выявляемых микроорганизмов и появлению испускания флуоресценции в дополнение к изменениям окраски среды.

Способ определения патогенных стафилококков по плазмокоагулирующей активности // 2332461

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической лабораторной диагностике инфекционных заболеваний. .

Способ видовой дифференциальной диагностики стафилококков // 2331073

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии и эпидемиологии. .

Способ видовой дифференциальной диагностики стрептококков группы в и группы d // 2327161

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии и эпидемиологии, и может быть использовано при бактериологической диагностике. .

Способ оценки результатов хирургической санации очага воспаления больных хроническим остеомиелитом // 2304781

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторным исследованиям при травматологической патологии. .

Способ индикации госпитальных штаммов стафилококков // 2292398

Изобретение относится к иммунологии. .

Способ диагностики субклинической формы мастита микробной этиологии у коров // 2264171

Изобретение относится к ветеринарии. .

Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления lactobacillus acidophilus в заквасочных культурах, используемых при производстве кисломолочных продуктов // 2481402

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к ДНК-технологиям

Способ определения адгезии staphylococcus spp. к фибронектину и фибриногену // 2490329

Изобретение относится к области микробиологии

Способ определения адгезии золотистого стафилококка // 2510024

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для определения адгезии золотистого стафилококка. Для этого исследуют чистую культуру золотистого стафилококка в концентрации 1 млрд/мл. Определяют среднее количество микробов, адгезированных на одном эритроците при подсчете не менее 25 эритроцитов. При этом в качестве субстрата адгезии используют эритроциты барана в концентрации 100 млн/мл, которые предварительно отмывают 50-ти % формалина. Изобретение обеспечивает качественную и количественную экспресс-диагностику определения степени выраженности адгезивных свойств стафилококков.

Способ ускоренного выращивания золотистого стафилококка для диагностики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи // 2511031

Изобретение относится к области биохимии и клинической микробиологии. Проводят выращивание золотистого стафилококка Staphylococcus aureus на питательной среде, содержащей желточно-солевой агар. На стадии подготовки к анализу в питательную среду вводят стимуляторы роста Staphylococcus aureus в виде водных растворов в концентрациях 10-4-10-6 вес.%. В качестве стимуляторов роста используют следующие соединения: трис(2-гидроксиэтил)аммоний 4-хлорфенил-сульфанилацетат или трис(2-гидроксиэтил)аммоний 2-хлорфенилоксиацетат или трис(2-гидроксиэтил)аммоний 2-метил-4-хлорфенилоксиацетат или трис(2-гидроксиэтил)аммоний 1-бензилиндол-3-ил-сульфонилацетат. Изобретение позволяет ускорить выращивание золотистого стафилококка для диагностики инфекций, сокращая время выращивания с 48 до 6-9 часов по сравнению с контролем на стандартной питательной среде (ЖСА). 2 табл., 7 пр.

Способ определения антилизоцимной активности стафилококков // 2567642

Изобретение относится к области клинической микробиологии. Исследуемую культуру стафилококков выращивают в условиях постоянного встряхивания, в качестве контроля используют смесь бульона и культуры без лизоцима, проводят двукратное измерение оптической плотности опытных и контрольных лунок через 2 и 4 часа инкубации и об уровне антилизоцимной активности судят по степени выраженности признака у определенного штамма стафилококков, которую рассчитывают по формуле: где K - коэффициент антилизоцимной активности стафилококков; VК - объем бульонной культуры исследуемого штамма; VЛ - объем раствора лизоцима исходной концентрации; CЛ - концентрация лизоцима; MО4 - среднее значение оптической плотности опытных лунок с бульонной культурой исследуемого штамма с лизоцимом через 4 часа инкубации, ед. оптической плотности; MО2 - среднее значение оптической плотности опытных лунок с бульонной культурой исследуемого штамма с лизоцимом через 2 часа инкубации, ед. оптической плотности; MК4 - среднее значение оптической плотности контрольных лунок с бульонной культурой исследуемого штамма без лизоцима через 4 часа инкубации, ед. оптической плотности; MК2 - среднее значение оптической плотности контрольных лунок с бульонной культурой исследуемого штамма без лизоцима через 2 часа инкубации, ед. оптической плотности. При значении K<0,49 определяют низкую степень выраженности АЛА, K в пределах 0,5-2,49 - определяют среднюю степень выраженности АЛА, K>2,5 - определяют высокую степень выраженности АЛА стафилококков. Использование данного способа позволяет повысить точность определения АЛА. 3 пр.

Культуральная среда для скрининга или обогащения метициллин-резистентных s. aureus // 2567807

Группа изобретений относится к культуральной среде и способу для скрининга метициллин-резистентных Staphylococcus aureus (MRSA) в культуральной среде. Культуральная среда содержит комбинацию цефалоспоринов, выбранную из группы, состоящей из цефотетана (СТТ) и цефтриаксона (CRO); цефотетана (СТТ) и цефподоксима (CPD); цефсулодина (CFS) и цефтриаксона (CRO); цефсулодина (CFS) и цефепима (FEP); и цефотетана (СТТ) и цефтиофура (XLN). При этом каждый цефалоспорин присутствует в концентрации от 1 мг/л до 10 мг/л. Способ для скрининга MRSA включает инокуляцию указанной культуральной среды подлежащими тестированию бактериями, культивирование указанных бактерий в культуральной среде в условиях, которые обеспечивают возможность роста стафилококков, и идентификацию присутствия или отсутствия MRSA. Группа изобретений обеспечивает высокую чувствительность и специфичность при скрининге MRSA, а также быстрое выявление MRSA в пределах 18-24 ч. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 10 табл., 3 пр.

Способ получения питательной среды для выявления возбудителя некробактериоза животных // 2631795

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Способ получения питательной среды для выявления возбудителя некробактериоза животных предусматривает получение фильтрата культур стафиококка путем выращивания культур стафилокока на мясопептонном агаре с последующим культивированием в термостате при 37оС в течение 8-10 дней. Проводят инактивацию культуры стафилококка на водяной бане при температуре 90-95оС в течение 30 мин. Центрифугируют в течение 20 мин с последующим отделением надосадочной жидкости и дополнительной фильтрацией через фильтр Зейтца. Изобретение позволяет сократить сроки культивирования посевного материала и повысить чувствительность бактериологического исследования. 25 ил., 4 табл., 5 пр.

Способ получения питательной среды для транспортировки патологического материала, содержащего возбудитель некробактериоза животных // 2640251

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии. Способ получения питательной среды для транспортировки патологического материала, содержащего возбудитель некробактериоза животных, предусматривает получение фильтрата золотистого стафилококка путем высева суточной культуры золотистого стафилококка в мясопептонном бульоне с добавлением 10% хлорида натрия и культивирования в термостате при температуре 37°С в течение 8-10 дней с последующим инактивированием в водяной бане в течение 30 мин при температуре 90-95°С. Отделяют надосадочную жидкость центрифугированием при 1000 об/мин в течение 20 мин и фильтруют через фильтр Зейтца. Изобретение позволяет увеличить срок сохранения жизнеспособности возбудителя неробактериоза и повысить эффективность первичной диагностики и лечебно- профилактических мероприятий. 13 ил., 6 табл., 5 пр..

Способ получения трехмерных структур, используемых для детекции, выделения или подсчета микроорганизмов // 2644683

Изобретение относится к области микробиологии. Предложен способ получения трехмерных структур, используемых для детекции, выделения или подсчета микроорганизмов. Способ предусматривает растворение или суспендирование одного или более питательных веществ для стимуляции роста микроорганизмов в первом растворителе в количествах от 1 до 50 г/л и один или несколько специфических хромогенных или флуорогенных маркеров ферментативной активности для одного или нескольких микроорганизмов, растворенных в первом растворителе, для детекции специфических ферментативных активностей микроорганизмов. Осуществляют абсорбцию питательной композиции и одного или нескольких специфических хромогенных или флуорогенных маркеров ферментативной активности в одной или нескольких трехмерных структурах глин или природных керамических материалов с удельной поверхностью, равной 2×103-6×108 м2/м3, сформированных множеством нано-, микро- и макрополостей. Удаляют растворители. Изобретение обеспечивает детекцию, выделение или подсчет микроорганизмов, которые могут находиться в низкой концентрации в образце, в частности ниже чем 1 КОЕ/единицу образца. 23 з.п. ф-лы, 12 табл., 19 пр.