Клостридиальный токсин netb

Изобретение раскрывает очищенный и/или рекомбинантный антигенный полипептид, обладающий токсинной активностью, выделенный из Clostridium perfringens, с установленной аминокислотной последовательностью. В изобретении раскрыт выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид, вектор экспрессии и клетка-хозяин, экспрессирующая полипептид. Изобретение раскрывает способ получения полипептида, антитело, специфически связывающееся с полипептидом, иммуногенные композиции и вакцины, содержащие данный полипептид или полинуклеотид, обеспечивая специфический иммунный ответ к полипептиду. Раскрыты способ индуцирования иммунного ответа, способ определения, подвергался ли субъект воздействию патогена (варианты), способ скрининга агониста или антагониста, модулирующего активность полипептида, способ вакцинации животных, например, кур, для индуцирования активного иммунитета, а также пассивного иммунитета у потомства самок птиц, которое становится менее чувствительным к клостридиальным заболеваниям. Раскрыто трансгенное растение, содержащее экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид по изобретению, предназначенное для кормления животных. Полипептид используют в составе корма и/или напитка для предупреждения заболевания, вызванного бактериями, экспрессирующими полипептид по изобретению. 22 н. и 18 з.п. ф-лы, 8 ил., 6 табл., 11 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к новому токсину. Настоящее изобретение относится также к иммуногенным композициям, содержащим данный токсин, и способам вакцинации животных, например, кур, таким образом, что они становятся менее чувствительными к клостридиальным заболеваниям.

Предшествующий уровень техники

Род Clostridium состоит из грамположительных, анаэробных, спорообразующих бацилл. Природным местообитанием данных организмов является окружающая среда и кишечник людей и других животных. Несмотря на идентификацию приблизительно 100 видов Clostridium, только небольшое количество было признано в качестве этиологических агентов медицинской или ветеринарной важности. Тем не менее, эти виды ассоциированы с серьезными заболеваниями, включающими ботулизм, столбняк, анаэробный целлюлит, газовую гангрену, бактериемию, псевдомембранозный колит и клостридиальный гастроэнтерит.

Clostridium perfringens является этиологическим агентом для многочисленных клостридиальных заболеваний, обнаруживаемых у экономически ценных домашних животных. Некротический энтерит (NE) является одним из примеров клостридиального кишечного заболевания, вызываемого C. perfringens. Некротический энтерит приводит к развитию некротических повреждений в кишечной стенке, приводя в результате к заболеваемости и смертности домашней птицы. Он является также многофакторным заболеванием со сложными и частично неизвестными эпидемиологией и патогенезом (Kaldhusdal, 1999). Бактерия C. perfringens обычно обнаруживается в желудочно-кишечном тракте домашней птицы (Tschirdewahn et al., 1991), однако, встречаемость некротического энтерита является спорадической (Cowen et al., 1987). Тем не менее, корм, зараженный C. perfringens, считался причастным к вспышкам некротического энтерита у кур (Kaldhusdal, 1999). Исследования также показали, что здоровые куры имеют относительно низкое количество C. perfringens в их желудочно-кишечных трактах, хотя увеличение концентрации этих бактерий может приводить к состоянию некротического энтерита (Craven et al., 1999).

Считается, что клинический некротический энтерит появляется, когда C. perfringens пролиферирует до высоких количеств в тонкой кишке и продуцирует внеклеточные токсины, которые разрушает эту кишку. Считается, что основным участвующим токсином является альфа-токсин, но его точная роль в процессе заболевания еще полностью не выяснена. Альфа-токсин является секретированным цинк-металлоферментом, который обладает как активностью фосфолипазы С, так и активностью сфингомиелиназы и является основным токсином, участвующим в патогенезе газовой гангрены человека (Awad, et al., 1995; Songer, 1997). Все пять типов токсина C. perfringens (A-E) несут и экспрессируют структурный ген альфа-токсина, plc.

До настоящего времени ни один другой токсин не был идентифицирован в качестве идиопатического фактора вирулентности при некротическом энтерите.

Сущность изобретения

Авторы настоящего изобретения идентифицировали новый клостридиальный токсин. Авторы настоящего изобретения назвали данный полипептид NetB.

Таким образом, настоящее изобретение относится к по существу очищенному или рекомбинантному полипептиду, где данный полипептид содержит:

i) аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3,

ii) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40% идентична SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:3, или

iii) биологически активный и/или антигенный фрагмент i) или ii).

В одном варианте осуществления данный полипептид обладает токсинной активностью.

В другом варианте осуществления данный полипептид обладает уменьшенной токсинной активностью в сравнении с полипептидом, кодируемым SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:3.

В предпочтительном варианте осуществления данный полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3.

В одном варианте осуществления данный полипептид может быть очищен из бактерии рода Clostridium. Предпочтительно, данный полипептид может быть очищен из Clostridium perfringens.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, данный полипептид является анатоксином.

Еще в одном варианте осуществления данный полипептид является слитым белком, содержащим по меньшей мере одну другую полипептидную последовательность.

По меньшей мере один другой полипептид может быть, например, полипептидом, который усиливает стабильность полипептида по настоящему изобретению, или полипептидом, который способствует очистке данного слитого белка, или полипептидом, который усиливает иммунологические свойства полипептида по настоящему изобретению.

Еще в одном варианте осуществления полипептид по настоящему изобретению является синтетическим полипептидом.

Настоящее изобретение дополнительно относится к выделенному и/или рекомбинантному полинуклеотиду, содержащему:

i) последовательность нуклеотидов, представленную в SEQ ID NO:1,

ii) последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид по любому из п.п.1-8,

iii) последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 40% идентична SEQ ID NO:1, и/или

iv) последовательность, которая гибридизуется с любой из i)-iii) в строгих условиях, или ее обращенный комплемент.

В одном варианте осуществления выделенный или рекомбинантный полинуклеотид содержит последовательность нуклеотидов, по меньшей мере на 40% идентичную нуклеотидам 226-1194 SEQ ID NO:1.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вектору, содержащему полинуклеотид по настоящему изобретению.

Предпочтительно, полинуклеотид в векторе функционально связан с промотором.

В одном варианте осуществления вектор является вирусным вектором или плазмидным вектором.

Настоящее изобретение дополнительно относится к клетке-хозяина, содержащей полипептид по настоящему изобретению, полинуклеотид по настоящему изобретению и/или вектор по настоящему изобретению.

Клетки-хозяева по настоящему изобретению могут являться любой клеткой, способной продуцировать по меньшей мере один полипептид по настоящему изобретению, и включают клетки животного, растения, бактериальные, грибковые (в том числе дрожжевые) клетки, клетки паразитов и членистоногих.

Предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой бактерию.

В одном варианте осуществления бактерией является E. coli. В более предпочтительном варианте осуществления данной бактерией является E. coli, выбранная из CCEC22, CCEC31 и CCEC59.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу получения полипептида по настоящему изобретению, предусматривающему культивирование клетки-хозяина по настоящему изобретению, или вектора по настоящему изобретению, кодирующего указанный полипептид, в условиях, которые допускают экспрессию полинуклеотида, кодирующего данный полипептид.

Предпочтительно, данный способ дополнительно предусматривает выделение указанного полипептида.

Настоящее изобретение дополнительно относится к по существу очищенному антителу или его фрагменту, которое специфически связывается с полипептидом по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение дополнительно относится к композиции, содержащей полипептид по настоящему изобретению, полинуклеотид по настоящему изобретению, вектор по настоящему изобретению, клетку-хозяина по настоящему изобретению и/или антитело по настоящему изобретению.

В одном варианте осуществления данная композиция является иммуногенной композицией.

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция дополнительно содержит адъювант и/или фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вакцине, содержащей антиген, где данный антиген содержит полипептид по настоящему изобретению.

В одном варианте осуществления данная вакцина содержит адъювант и/или фармацевтически приемлемый носитель.

В одном варианте осуществления данная вакцина дополнительно содержит один или несколько дополнительных антигенов.

Настоящее изобретение дополнительно относится к ДНК-вакцине, содержащей полинуклеотид, кодирующий полипептид по настоящему изобретению, причем после введения субъекту данный полипептид экспрессируется, и возникает иммунная реакция на данный полипептид.

Настоящее изобретение дополнительно относится к аттенуированной бактерии, которая продуцирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40% идентична SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:3, где данная бактерия продуцирует уменьшенное количество полипептида в сравнении с бактерией дикого типа и/или обладает уменьшенной токсинной активностью в сравнении с полипептидом в бактерии дикого типа.

В одном варианте осуществления данная аттенуированная бактерия не экспрессирует полипептид.

В другом варианте осуществления данная аттенуированная бактерия дополнительно модифицирована для экспрессии гетерологичного полипептида. Гетерологичный полипептид может являться, например, биологически активным полипептидом или антигеном. Примеры биологически активных полипептидов включают цитокины, факторы роста и ферменты. Данный антиген может являться, например, агентом бактериального, грибного, паразитарного или вирусного заболевания.

Предпочтительно, аттенуированная бактерия принадлежит к роду Clostridium. В наиболее предпочтительном варианте осуществления данной бактерией является Clostridium perfringens.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу аттенуирования вирулентности бактерии, которая экспрессирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 40% идентичную SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:3, предусматривающему мутирование полинуклеотидной последовательности для уменьшения экспрессии и/или токсинной активности данного полипептида, в результате чего аттенуированная бактерия обладает уменьшенной токсинной активностью в сравнении с неаттенуированной бактерией.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу увеличения иммунной реакции у субъекта, предусматривающему введение данному субъекту полипептида по настоящему изобретению, полинуклеотида по настоящему изобретению, вектора по настоящему изобретению, композиции по настоящему изобретению, вакцины по настоящему изобретению, клетки-хозяина по настоящему изобретению и/или бактерии по настоящему изобретению.

В одном варианте осуществления клетка-хозяина или бактерия являются живыми.

В другом варианте осуществления данные полипептид, полинуклеотид, композиция, вектор, клетка-хозяина или бактерия доставляются in ovo.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу определения, подвергался ли субъект воздействию патогена, который экспрессирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40% идентична SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:3, предусматривающему определение присутствия или отсутствия данного полипептида в образце, полученном от данного субъекта, где присутствие данного полипептида является показателем воздействия данного патогена.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу определения, подвергался ли субъект воздействию патогена, который экспрессирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40% идентична SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:3, предусматривающему определение присутствия или отсутствия антител в данном образце, которые специфически связываются с полипептидом по настоящему изобретению, где присутствие антител является показателем воздействия данного патогена.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу определения, подвергался ли субъект воздействию патогена, который экспрессирует полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 40% идентична SEQ ID NO:1, предусматривающему определение присутствия или отсутствия данного полинуклеотида в образце, полученном у данного субъекта, где присутствие данного полинуклеотида полипептида является показателем воздействия данного патогена.

Может быть использован любой подходящий способ определения присутствия или отсутствия полинуклеотида. Например, присутствие или отсутствие полинуклеотида может быть детектировано гибридизацией, например, блоттингом по Саузерну или амплификацией данного полинуклеотида, например, при помощи ПЦР.

В одном варианте осуществления данный патоген относится к роду Clostridium. В предпочтительном варианте осуществления патогеном является Clostridium perfringens.

В одном варианте осуществления способов по настоящему изобретению субъектом является птица.

Предпочтительно, субъектом является домашняя птица. Например, субъектом является курица, индейка, фазан, перепел, утка, страус или другая домашняя птица, обычно разводимая в коммерческих количествах.

В наиболее предпочтительных вариантах осуществления субъектом является курица.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу скрининга на агонист или антагонист, который модулирует активность полипептида по настоящему изобретению, предусматривающему контактирование полипептида по настоящему изобретению с соединением-кандитатом и определение, увеличивает или уменьшает указанное соединение токсинную активность полипептида по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления данное соединение является антагонистом. Предпочтительно, данное соединение является антителом.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу тестирования образца на токсинную активность, предусматривающему:

(a) разделение образца, в котором подозревают присутствие полипептида по любому из п.п.1-8, по меньшей мере на первую и вторую части образца,

(b) контактирование первой части образца с антагонистом полипептида по любому из п.п.1-8, и

(c) определение, обладают ли первая и вторая части образца токсинной активностью,

где отсутствие токсинной активности в первой части образца и присутствие токсинной активности во второй части образца является показателем присутствия полипептида, который по меньшей мере на 40% идентичен SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:3.

В одном варианте осуществления стадия (с) предусматривает независимо инкубирование первой и второй частей образца с клетками животного в условиях и в течение периода времени, достаточных для проявления цитопатического действия, и определение присутствия или отсутствия цитопатического действия на данные клетки.

В предпочтительном варианте осуществления данным антагонистом является антитело.

Настоящее изобретение дополнительно относится к пище (корму) и напитку, содержащим антагонист полипептида по настоящему изобретению.

Предпочтительно, данным антагонистом является антитело по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение дополнительно относится к применению пищи и/или напитка по настоящему изобретению для уменьшения инфицирования и/или колонизации животного бактерией, которая экспрессирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40% идентична SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:3.

Настоящее изобретение дополнительно относится к трансгенному организму, не являющемуся человеком, содержащему экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид по настоящему изобретению. Предпочтительно, данным трансгенным, не являющимся человеком организмом является растение.

Настоящее изобретение также относится к пище и/или напитку, содержащим полипептид по настоящему изобретению.

Предпочтительно, данный полипептид индуцирует иммунную реакцию против бактериального патогена, когда трансгенный организм (не являющийся человеком) вводят перорально субъекту. Бактериальный патоген может являться патогеном рода Clostridium, например, Clostridium perfringens. Предпочтительно, субъектом является птица, например, курица, индейка или утка.

Как будет понятно специалисту в данной области, данный трансгенный, не являющийся человеком организм и/или пища или напиток по настоящему изобретению могут быть использованы для введения полипептида по настоящему изобретению субъекту, таким образом, что у данного субъекта индуцируется иммунная реакция против данного полипептида.

Таким образом, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу индуцирования иммунной реакции против полипептида по настоящему изобретению, предусматривающему пероральное введение субъекту трансгенного, не являющегося человеком организма по настоящему изобретению и/или пищи и/или напитка по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу обеспечения пассивного иммунитета у потомства птиц-самок, предусматривающему введение полипептида по настоящему изобретению, полинуклеотида по настоящему изобретению, вектора по настоящему изобретению, клетки-хозяина по настоящему изобретению, композиции по настоящему изобретению, вакцины по настоящему изобретению, аттенуированной бактерии по настоящему изобретению, трансгенного, не являющегося человеком организма по настоящему изобретению и/или пищи и/или напитка по настоящему изобретению птице-самке перед откладыванием яиц данной птицей-самкой, содержащих потомство, в результате чего это потомство обеспечивается пассивным иммунитетом в отношении бактерии, которая экспрессирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40% идентична SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:3.

Настоящее изобретение дополнительно относится к применению полипептида по настоящему изобретению, полинуклеотида по настоящему изобретению, вектора по настоящему изобретению, композиции по настоящему изобретению, вакцины по настоящему изобретению, клетки-хозяина по настоящему изобретению, бактерии по настоящему изобретению, трансгенного, не являющегося человеком животного по настоящему изобретению и/или пищи и/или напитка по настоящему изобретению в производстве лекарственного средства для индуцирования иммунной реакции у субъекта.

Настоящее изобретение дополнительно относится к применению полипептида по настоящему изобретению, полинуклеотида по настоящему изобретению, вектора по настоящему изобретению, композиции по настоящему изобретению, вакцины по настоящему изобретению, клетки-хозяина по настоящему изобретению, бактерии по настоящему изобретению, трансгенного, не являющегося человеком животного по настоящему изобретению и/или корма и/или напитка по настоящему изобретению в качестве лекарственного средства для индуцирования иммунной реакции у субъекта.

Как будет очевидно, предпочтительные признаки и характеристики одного аспекта по настоящему изобретению применимы ко многим другим аспектам по настоящему изобретению.

Во всем описании слово "содержат" или вариации, такие как "содержит" или "содержащий", будут пониматься как включение указанного элемента, целого числа или стадии или групп элементов, целых чисел или стадий, но не как исключение любого другого элемента, целого числа или стадии или групп элементов, целых чисел или стадий.

Далее настоящее изобретение описано с использованием следующих не ограничивающих изобретение примеров и со ссылкой на сопутствующие фигуры.

Краткое описание сопутствующих фигур

Фиг.1. ClustalW-выравнивание NetB и бета-токсина из C. perfringens; "*" означает, что остатки или нуклеотиды в данной колонке идентичны во всех последовательностях в данном выравнивании; ":" означает, что наблюдались консервативные замены; "." означает, что наблюдаются полуконсервативные замены.

Фиг.2. Схематическая диаграмма области хромосомы NE18-ΔnetB. Мутанты netB конструировали аллельным изменением с использованием суицидной плазмиды, содержащей инсерционно инактивированный ген netB приблизительно с 2 т.п.н. гомологичной ДНК на каждой стороне данного гена, и вводили в EHE-NE18.

Фиг.3. Анализ цитотоксичности культурального супернатанта C. perfringens EHE-NE18 на клетках LMH. a. Культуральная среда TPG (неразведенная); b. культуральный супернатант C. perfringens EHE-NE18 (разведение 1:16); c. культуральный супернатант C. perfringens JIR325 (штамм 13 - штамм ненекротического энтерита) (разведение 1:2); d. культуральный супернатант C. perfringens NE18-M1 (мутант plc) (разведение 1:16).

Фиг.4. Анализ цитотоксичности netB-отрицательных производных культурального супернатанта EHE-NE18 на клетках LMH. a. Культуральный супернатант ЕНЕ-NE18 (разведение 1:16); b. культуральный супернатант NE18-делетированный netB1 (разведение 1:2); c. культуральный супернатант NE18-делетированный netBλ+pJIR.1457 (челночная плазмида) (разведение 1:2); d. культуральный супернатант NE18-делетированный netBX+pALK20 (комплементационная плазмида netB) (разведение 1:16); e. культуральная среда TPG (неразведенная); f. Очищенный на колонке рекомбинантный NetB (разведение 1:8).

Фиг.5. Анализ цитотоксичности лактатдегидрогеназы клеток LMH, обработанных NetB. LDH, высвобождаемую в супернатант, измеряли в качестве индикатора цитолиза с набором Cyto-Tox (Promega) и представляли в виде процента цитотоксичности. Каждое разведение анализировали в трех повторах и для каждого разведения рассчитывали SEM.

Фиг.6. ПЦР-скрининг штаммов NE и non-NE C. perfringens на присутствие netB. a. штаммы NE; b. штаммы non-NE.

Фиг.7. Обследование Вестерн-блота на присутствие белка в различных штаммах C. perfringens (NE и non-NE). Вестерн-блот-анализ скрининга штаммов NE и штаммов non-NE на экспрессию NetB. Штаммы C. perfringens выращивали в среде TPG, пока они не достигали OD600 нм 0,6, и культуральные супернатанты разделяли электрофорезом на ДСН-ПААГ. Разделенные белки переносили на мембрану PDVF и зондировали антисывороткой rNetB от кроликов. Скобки показывают штаммы NE и non-NE C. perfringens.

Фиг.8. Вестерн-блот-анализ сывороток из кур, вакцинированных NetB. Дорожка 1: маркер молекулярной массы (предварительно окрашенный Invitrogen SeeBlue^® Plus2 стандарт); Дорожки 2-14: сыворотка из вакцинированных птиц #1-#13.

Ключ к списку последовательностей

SEQ ID NO:1 - нуклеотидная последовательность, кодирующая токсин NetB Clostridium perfringens.

SEQ ID NO:2 - Зрелая аминокислотная последовательность токсина NetB Clostridium perfringens.

SEQ ID NO:3 - Аминокислотная последовательность токсина NetB Clostridium perfringens, содержащая последовательность сигнального пептида.

SEQ ID NO:4 - Аминокислотная последовательность бета-токсина Clostridium perfringens.

SEQ ID No:5-10 - Олигонуклеотидные праймеры.

Подробное описание изобретения

Общие способы и определения

Если конкретно не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном описании, должны пониматься как имеющие значение, обычно понимаемое специалистом в данной области (например, в микробиологии, культуре клеток, молекулярной генетике, иммунологии, иммуногистохимии, химии белков и биохимии).

Если не указано иное, способы получения рекомбинантного белка, культуры клеток, микробиологические и иммунологические способы, используемые в данном изобретении, являются стандартными методиками, хорошо известными специалистам в данной области. Такие способы описаны и объяснены в литературных источниках, как у J.Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J.Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A.Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M.Glover and B.D.Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), и F.M.Ausubel et al., (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, включая все обновленные издания до настоящего времени), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), и J.E.Coligan et al., (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley&Sons (включая все обновленные издания до настоящего времени), которые включены в данное описание посредством ссылки.

Как использовано в данном описании, термин "субъект" относится к животному, например, птице или млекопитающему. В предпочтительном варианте осуществления субъектом является птица, например, курица. В другом варианте осуществления субъектом является человек. Другие предпочтительные варианты осуществления включают животных-любимцев, таких как кошки и собаки, а также относящихся к скоту животных, таких как лошади, крупный рогатый скот, овцы и козы.

Как использовано в данном описании, термин "птичьи" относится к любому виду, подвиду или расе организма таксономического класса Aves (птицы), таким как, но без ограничения, курица, индейка, утка, гусь, перепел, фазаны, попугаи, мелкие птицы (вьюрки, амадины), небольшие хищные птицы, вороны и бескилевые птицы, включающие страуса (африканского), эму и казуара. Данный термин включает различные известные Gallus gallus, или куры (например, белый леггорн, бурый леггорн, полосатый плимутрок, Суссекс, нью-гемпшир, Род-Айленд, австралорп, корниш, минорка, амрокс, California Gray, Italian Partidge-colored), а также расы индеек, фазанов, перепелов, утки, страусов и другой домашней птицы, обычно разводимой в коммерческих количествах.

Как использовано в данном описании, "токсинная активность" относится к способности полипептида или пептида (например, токсина NetB) убивать клетки животных или вызывать цитопатический эффект в клетках животных. В некоторых случаях может быть желательно, чтобы полипептид обладал уменьшенной токсинной активностью в сравнении с токсином NetB. Уменьшение токсинной активности составляет предпочтительно по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 99%. Уменьшение токсинной активности может быть измерено, например, в виде уменьшения цитопатического эффекта.

Как использовано в данном описании, термины "цитопатический эффект" или "CPE" описывают изменения структуры клеток в результате активности клеточного токсина (т.е. патологический эффект). Обычные цитопатические эффекты включают деструкцию клетки, округление клетки, образование синцитиев (т.е. слитых гигантских клеток), образование вакуолей и образование телец включения. CPE происходит из воздействий токсина на клетки, которые отрицательно влияют на способность данных клеток выполнять их функции, необходимые для того, чтобы клетки остались жизнеспособными. В системах культур клеток in vitro CPE является очевидным, когда клетки, как часть конфлюэнтного монослоя, обнаруживают области отсутствия конфлюэнтности после контакта с образцом, который содержит токсин. Цитопатические эффекты легко распознаваемы и различаемы специалистами в данной области.

Как использовано в данном описании, термин "анатоксин" относится к любому по меньшей мере частично инактивированному токсину, но не предназначен для ограничения каким бы то ни было образом конкретных способов инактивации токсина для получения анатоксина. Такие инактивирующие технологии включают: (i) химические способы, которые модифицируют интактный токсин, например, обработку формальдегидом или глутаровым альдегидом; (ii) физические способы, такие как нагревание; (iii) ферментативные способы, которые изменяют токсин, такие как протеазный, при котором токсин расщепляется на фрагменты; (iv) рекомбинантные способы, такие как генная инженерия гена токсина для удаления или изменения ферментативных участков токсина, но сохранения одного или нескольких антигенных эпитопов.

Термин "дикий тип", как использовано в данном описании в отношении бактерий, относится к природным бактериям, которые продуцируют полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 40% идентичную, более предпочтительно по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, которая обладает токсинной активностью.

Как использовано в данном описании, термины "лечение", "лечить" или "обработка" включают введение терапевтически эффективного количества полипептида, полинуклеотида, вектора, клетки-хозяина, композиции, вакцины и/или аттенуированной бактерии по настоящему изобретению, достаточного для уменьшения или удаления по меньшей мере одного симптома заболевания, обусловленного инфекцией бактерией, экспрессирующей полипептид, обладающий токсинной активностью.

Термин "предупреждение" («профилактика») относится к защите субъекта, который может находиться в контакте с бактериями, от развития по меньшей мере одного симптома, вызванного инфекцией, и/или колонизации данной бактерией, или уменьшения тяжести симптома инфекции и/или колонизации у субъекта, подвергшегося воздействию данной бактерии.

Полипептиды/пептиды

Термины "полипептид" и "белок" используются обычно взаимозаменяемо и относятся к единственной полипептидной цепи, которая может быть или не быть модифицирована добавлением неаминокислотных групп. Следует понимать, что такие полипептидные цепи могут быть ассоциированы с другими полипептидами или белками или другими молекулами, такими как кофакторы. Как использовано в данном описании, термины "белки" и "полипептиды" включают варианты, мутанты, биологически активные фрагменты, модификации, аналоги и/или производные описанных в данном описании полипептидов. Под термином "по существу очищенный полипептид" или "выделенный полипептид" авторы имеют в виду полипептид, который был обычно отделен от липидов, нуклеиновых кислот, других пептидов и других загрязняющих молекул, с которыми он ассоциирован в его нативном состоянии. Предпочтительно, по существу очищенный полипептид по меньшей мере на 60% свободен, более предпочтительно по меньшей мере на 75% свободен и более предпочтительно по меньшей мере на 90% свободен от других компонентов, с которыми он природно ассоциирован.

Термин "рекомбинантный" в контексте полипептида относится к полипептиду, когда он продуцируется клеткой или в бесклеточной системе экспрессии, в измененном количестве или при измененной скорости в сравнении с его нативным состоянием. В одном варианте осуществления данная клетка может являться клеткой, которая природно не продуцирует данного полипептида. Однако данная клетка может являться клеткой, которая содержит не-эндогенный ген, который вызывает измененное, предпочтительно увеличенное, количество полипептида, который должен быть продуцирован. Рекомбинантный полипептид по настоящему изобретению включает полипептиды, которые не были отделены от других компонентов трансгенной (рекомбинантной) клетки, или бесклеточной системы экспрессии, в которой он продуцируется, и полипептиды, продуцируемые в таких клетках или бесклеточных системах, которые затем очищают по меньшей мере от некоторых других компонентов.

Процент (%) идентичности полипептида определяют при помощи GAP-анализа (Needleman and Wunsch, 1970) (программы GCG) с пенальти (штрафом) создания гэпа=5 и пенальти (штрафом) удлинения гэпа=0,3. Запрашиваемая последовательность имеет длину по меньшей мере 15 аминокислот, и данный GAP-анализ выравнивает две последовательности по области по меньшей мере 15 аминокислот. Более предпочтительно, запрашиваемая последовательность имеет длину по меньшей мере 50 аминокислот, и данный GAP-анализ выравнивает две последовательности по области по меньшей мере 50 аминокислот. Более предпочтительно, запрашиваемая последовательность имеет длину по меньшей мере 100 аминокислот, и данный GAP-анализ выравнивает две последовательности по области по меньшей мере 100 аминокислот. Даже еще более предпочтительно, запрашиваемая последовательность имеет длину по меньшей мере 250 аминокислот, и данный GAP-анализ выравнивает две последовательности по области по меньшей мере 250 аминокислот. Более предпочтительно, две последовательности выравнивают по всей их полной длине.

Что касается определяемого полипептида, будет понятно, что цифры % идентичности, более высокие, чем приведенные выше, будут включать предпочтительные варианты осуществления. Таким образом, когда это допустимо, в свете минимальных цифр % идентичности, предпочтительно данный полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40%, более предпочтительно по меньшей мере на 45%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 76%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 91%, более предпочтительно по меньшей мере на 92%, более предпочтительно по меньшей мере на 93%, более предпочтительно по меньшей мере на 94%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 96%, более предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, более предпочтительно по меньшей мере на 99%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,1%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,2%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,3%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,4%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,5%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,6%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,7%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,8% и даже более предпочтительно по меньшей мере на 99,9% идентична релевантной указанной SEQ ID NO.

Мутанты аминокислотных последовательностей полипептидов по настоящему изобретению могут быть получены введением подходящих нуклеотидных изменений в нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению или синтезом in vitro желаемого полипептида. Такие мутанты включают, например, делеции, инсерции или замены остатков в аминокислотной последовательности. Комбинация делеции, инсерции и замены может быть произведена для получения конечной конструкции, при условии, что данный конечный пептидный продукт имеет желаемые характеристики.

Мутантные (измененные) полипептиды могут быть получены с использованием любого подходящего способа, известного в данной области. Например, полинуклеотид по настоящему изобретению может быть подвергнут мутагенезу in vitro. Такие способы мутагенеза in vitro включают субклонирование полинуклеотида в подходящий вектор, трансформацию данного вектора в штамм “мутатор”, такой как E. coli XL-I красный (Stratagene) и размножение трансформированных бактерий в течение подходящего числа генераций. В другом примере, полинуклеотиды по настоящему изобретению подвергают способам перетасовки ДНК, широко описанной Harayama (1998). Такие способы перетасовки ДНК могут включать кодирующие токсины гены, родственные генам по настоящему изобретению, такие как гены из бактерий, отличных от Closrtidium perfringens. Продукты, полученные из мутированной/измененной ДНК, могут быть легко подвергнуты скринингу с использованием описанных в данном описании способов определения, обладают ли они токсинной активностью.

В конструировании мутантов аминокислотной последовательности, местоположение сайта мутации и характер мутации будут зависеть от свойства (свойств), которые подлежат мутированию. Сайты мутации могут быть модифицированы индивидуально или последовательно, например, (1) заменой сначала предпочтительными консервативными аминокислотами и затем более радикальным выбором в зависимости от полученных результатов, (2) делетированием остатка-мишени или (3) инсертированием других остатков, смежных с найденным сайтом.

Делеции аминокислотных последовательностей обычно находятся в диапазоне приблизительно 1-15 остатков, более предпочтительно приблизительно 1-10 и обычно приблизительно 1-5 смежных остатков.

Мутанты замены имеют по меньшей мере один удаленный аминокислотный остаток в молекуле полипептида и другой остаток, инсертированный на его место. Представляющие наибольший интерес сайты для заменяющего мутагенеза включают сайты, идентифицированные как активный сайт (активные сайты). Другими представляющими интерес сайтами являются сайты, в которых конкретные остатки, полученные из разных штаммов или видов, являются идентичными. Эти положения могут быть важными для биологической активности. Сайты, особенно сайты, попадающие в последовательность из по меньшей мере трех других идентично консервативных сайтов, заменяют предпочтительно относительно консервативным образом. Такие консервативные замены показаны в таблице 1 под заголовком “примеры замен”.

Таблица 1 Примеры замен
Первоначальный остаток	Примеры заместителей
Ala (A)	val; leu; ile; gly
Arg(R)	lys
Asn(N)	gln; his
Asp (D)	glu
Cys (C)	ser
Gin (Q)	asn; his
Glu (E)	asp
Gly (G)	pro, ala
His (H)	asn; gln
Ile (I)	leu; val; ala
Leu (L)	ile; val; met; ala; phe
Lys (K)	arg
Met (M)	leu; phe
Phe (F)	leu; val; ala
Pro (P)	gly
Ser (S)	thr
Thr (T)	ser
Trp (W)	tyr
Tyr (Y)	trp; phe
Val (V)	ile; leu; met; phe, ala

В объем настоящего изобретения включены также биологически активные фрагменты полипептидов по настоящему изобретению. Как использовано в данном описании, "биологически активный фрагмент" является частью полипептида по настоящему изобретению, которая сохраняет определенную активность полноразмерного полипептида. Биологически активные фрагменты могут быть любого размера, пока они сохраняют определенную активность. Предпочтительно, биологически активный фрагмент сохраняет по меньшей мере 10% активности полноразмерного белка. Специалистам в данной области известны способы идентификации биологически активного фрагмента полипептида. Например, фрагмент полипептида по настоящему изобретению может быть тестирован в подходящем анализе для определения, обладает ли данный фрагмент токсинной активностью, например, определением, способен ли данный фрагмент индуцировать цитопатический эффект в клетке. В одном варианте осуществления биологически активный фрагмент имеет длину по меньшей мере 100 аминокислот, более предпочтительно имеет длину по меньшей мере 110 аминокислот, более предпочтительно имеет длину по меньшей мере 120 аминокислот, более предпочтительно имеет длину по меньшей мере 130 аминокислот, более предпочтительно имеет длину по меньшей мере 150 аминокислот, более предпочтительно имеет длину по меньшей мере 175 аминокислот, более предпочтительно имеет длину по меньшей мере 175 аминокислот или более предпочтительно имеет длину по меньшей мере 200 или более аминокислот.

Термины "антиген" и "антигенный" хорошо известны в данной области и относятся к части макромолекулы, которая специфически распознается компонентом иммунной системы, например, антителом или рецептором антигена Т-клеток. Термин "антиген" относится к пептиду, полипептиду или другой макромолекуле, в отношении которой у хозяина может быть индуцирована иммунная реакция. Таким образом, настоящее изобретение включает антигенный фрагмент полипептида по настоящему изобретению. Предпочтительно, данный антигенный фрагмент способен увеличивать иммунную реакцию против бактериального патогена Clostridium, включая, но без ограничения, Clostridium perfringens. В одном варианте осуществления данный антиген является эпитопом полипептида по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления антигенный фрагмент имеет длину 6 аминокислот, более предпочтительно имеет длину 7 аминокислот, более предпочтительно имеет длину 8 аминокислот, более предпочтительно имеет длину 9 аминокислот, более предпочтительно имеет длину по меньшей мере 10 аминокислот. Альтернативно, данный антигенный фрагмент имеет длину по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или более аминокислот. В одном варианте осуществления данный антиген при введении субъекту способен индуцировать иммунную реакцию против полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:3.

Кроме того, если желательно, в полипептиды по настоящему изобретению могут быть введены неприродные аминокислоты или химические аналоги аминокислот. Такие аминокислоты включают, но не ограничиваются ими, D-изомеры обычных аминокислот, 2,4-диаминомасляную кислоту, α-аминомасляную кислоту, 4-аминомасляную кислоту, 2-аминомасляную кислоту, 6-аминогексановую кислоту, 2-аминоизомасляную кислоту, 3-аминопропионовую кислоту, орнитин, норлейцин, норвалин, гидроксипролин, саркозин, цитруллин, гомоцитруллин, цистеиновую кислоту, трет-бутилглицин, трет-бутилаланин, фенилглицин, циклогексилаланин, β-аланин, фтораминокислоты, сконструированные аминокислоты, такие как β-метиламинокислоты, С-α-метиламинокислоты, N-α-метиламинокислоты, и аналоги аминокислот в целом.

В объем настоящего изобретения включены также полипептиды по настоящему изобретению, которые дифференциально модифицированы во время синтеза или после синтеза, например, биотинилированием, бензилированием, гликозилированием, ацетилированием, фосфорилированием, амидированием, дериватизацией известными защитными/блокирующими группами, протеолитическим расщеплением, связыванием с молекулой антитела или другого клеточного лиганда и т.д. Такие модификации могут служить для увеличения стабильности и/или биоактивности полипептида по настоящему изобретению.

Полипептиды по настоящему изобретению могут быть получены различными путями, включающими получение и извлечение природных полипептидов, получение и извлечение рекомбинантных полипептидов и химический синтез полипептидов. В одном варианте осуществления выделенный полипептид по настоящему изобретению получают культивированием клетки, способной экспрессировать данный полипептид, в условиях, эффективных для продуцирования данного полипептида, и извлечением данного полипептида. Предпочтительной клеткой для культивирования является клетка-хозяин по настоящему изобретению. Эффективные условия культивирования включают, но не ограничиваются ими, эффективные среды, биореактор, температуру, рН и кислородные условия, которые делают возможным продуцирование полипептида. Эффективной средой называют любую среду, в которой клетку культивируют для получения полипептида по настоящему изобретению. Такая среда обычно содержит водную среду, имеющую ассимилируемые источники углерода, азота и фосфата и подходящие соли, минеральные соединения, металлы и другие нутриенты, такие как витамины. Клетки по настоящему изобретению можно культивировать в общепринятых ферментационных биореакторах, встряхиваемых колбах, тест-пробирках, микротитрационных планшетах и чашках Петри. Культивирование может проводиться при температуре, рН и содержании кислорода, подходящих для рекомбинантной клетки. Такие условия культивирования находятся в пределах компетенции специалиста в данной области.

Антитела

Термин "антитело", как использовано в описании настоящего изобретения, включает поликлональные антитела, моноклональные антитела, биспецифические антитела, димерные антитела (diabodies), тримерные антитела (triabodies), гетероконъюгатные антитела, химерные антитела, включающие в себя как интактные антитела, так и их фрагменты, такие как Fab, F(ab')₂ и Fv, которые способны связывать эпитопную детерминанту, и другие антитело-подобные молекулы.

Фрагменты антител сохраняют некоторую способность селективного связывания с их антигеном или рецептором и определяются в данном случае следующим образом:

(1) Fab, фрагмент, который содержит одновалентный антигенсвязывающий фрагмент молекулы антитела, может быть получен расщеплением полного антитела ферментом папаином с получением интактной легкой цепи и части одной тяжелой цепи;

(2) Fab', фрагмент молекулы антитела, может быть получен обработкой полного антитела пепсином с последующим восстановлением и получением интактной легкой цепи и части тяжелой цепи; два фрагмента Fab' получают на одну молекулу антитела;

(3) F(ab')₂, фрагмент антитела, который может быть получен обработкой полного антитела ферментом пепсином без последующего восстановления; F(ab')₂ является димером двух фрагментов Fab', удерживаемых вместе двумя дисульфидными связями;

(4) Fv, определяемый как генетически сконструированный фрагмент, содержащий вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, экспрессируемые в виде двух цепей; и

(5) одноцепочечное антитело ("SCA"), определяемое как генетически сконструированная молекула, содержащая вариабельную область легкой цепи, вариабельную область тяжелой цепи, связанные подходящим полипептидным линкером в виде генетически слитой одноцепочечной молекулы.

Способы получения таких фрагментов известны в данной области (см., например, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988), включенный в данное описание посредством ссылки).

(6) Антитело с единственным доменом, обычно вариабельным доменом тяжелой цепи, лишенное легкой цепи.

Поликлональные антитела

Антитело по настоящему изобретению может быть поликлональным антителом. Способы получения поликлональных антител известны специалисту в данной области. Поликлональные антитела могут быть индуцированы в млекопитающем или птице, например, одной или несколькими инъекциями клеток, экспрессирующих данный полипептид, и, если желательно, адъюванта. Обычно, клетки и/или адъювант инъецируют млекопитающему или птице множественными подкожными или внутрибрюшинными инъекциями. Примеры адъювантов, которые могут быть использованы, включают полный адъювант Фрейнда и адъювант MPL-TDM (монофосфорил-Липид А, синтетический дикориномиколат трегалозы). Протокол иммунизации может быть выбран специалистом в данной области без чрезмерного экспериментирования.

Моноклональные антитела

Антитела, получаемые способом по настоящему изобретению, могут быть, альтернативно, моноклональными антителами. Моноклональные антитела могут быть получены гибридомными способами, такими как способы, описанные Kohler and Milstein, (1975). В одном гибридомном способе, мышь, хомячка или другого подходящего животного-хозяина обычно иммунизируют клетками, экспрессирующими рассматриваемый полипептид, первого вида, полученными из трансгенного млекопитающего, для индуцирования лимфоцитов, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые будут специфически связываться с данным полипептидом первого вида.

Обычно, используют либо лимфоциты периферической крови ("PBL"), если желательны клетки, происходящие от человека, либо клетки селезенки или клетки лимфатических узлов, если желательны источники млекопитающих, не являющихся человеком. Затем лимфоциты сливают с иммортализованной клеточной линией с использованием подходящего агента слияния, такого как полиэтиленгликоль, с образованием гибридомной клетки (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103). Иммортализованные клеточные линии обычно являются трансформированными клетками млекопитающих, в частности, миеломными клетками, происходящими от грызуна, коров или человека. Обычно используют линии клеток миеломы крысы или мыши. Гибридомные клетки могут культивироваться в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, которые ингибируют рост или выживание неслитых, иммортализованных клеток. Например, если материнские клетки лишены фермента гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (HGPRT или HPRT), культуральная среда для гибридом будет обычно включать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (“среда HAT”), вещества, которые предотвращают рост HGPRT-недостаточных клеток.

Предпочтительные иммортализованные клеточные линии являются линиями, которые эффективно сливаются, поддерживают стабильную экспрессию антитела высокого уровня продуцирующими выбранное антитело клетками и являются чувствительными к такой среде, как среда НАТ. Более предпочтительными иммортализованными клеточными линиями являются мышиные миеломные линии, которые могут быть получены, например, из Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif и American Type Culture Collection, Manassas, Va. Миеломные клеточные линии человека и гетеромиеломные клеточные линии мышь-человек также были описаны для получения моноклональных антител человека (Kozbor, 1985; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987, pp. 51-63).

Затем культуральная среда, в которой культивируют гибридомные клетки, может быть проанализирована на присутствие моноклональных антител, направленных против полипептида первого вида. Предпочтительно, специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых гибридомными клетками, определяют иммунопреципитацией или анализом связывания in vitro, таким как радиоиммуноанализ (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Такие способы и анализы известны в данной области. Аффинность связывания моноклонального антитела может быть, например, определена анализом Скетчарда Munson and Pollard, (1980).

После идентификации желаемых гибридомных клеток, клоны могут быть субклонированы методами лимитирующих разведений и выращены стандартными способами. Подходящие культуральные среды для данной цели включают, например, модифицированную по способу Дульбекко среду Игла и среду RPMI-1640. Альтернативно, гибридомные клетки могут выращиваться in vivo в виде асцита в млекопитающем.

Моноклональные антитела, секретируемые данными субклонами, могут быть выделены или очищены из культуральной среды или асцитной жидкости общепринятыми методами очистки иммуноглобулинов, такими как, например, хроматография на белок А-Сефарозе, гидроксилапатитная хроматография, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.

Моноклональные антитела могут быть также получены способами рекомбинантных ДНК, такими как способы, описанные в патенте США 4816567. ДНК, кодирующая моноклональные антитела по настоящему изобретению, может быть легко выделена и секвенирована с использованием общепринятых методик (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны связываться специфически с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи мышиных антител). Гибридомные клетки по настоящему изобретению служат в качестве предпочтительного источника такой ДНК. После выделения, ДНК может быть помещена в экспрессирующие векторы, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки COS обезьян, клетки яичника Китайского хомячка (СНО) или миеломные клетки, которые, в противном случае, не продуцируют белок иммуноглобулина, для получения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. ДНК может быть также модифицирована, например, заменой кодирующей последовательностью константных доменов тяжелой и легкой цепи человека вместо гомологичных мышиных последовательностей (патент США 4816567) или ковалентным присоединением к кодирующей последовательности иммуноглобулина всей или части кодирующей последовательности полипептида, не являющегося иммуноглобулином. Такой полипептид, не являющийся иммуноглобулином, может заменять константные домены антитела по настоящему изобретению или может заменять вариабельные домены антигенсвязывающего сайта антитела по настоящему изобретению для создания химерного двухвалентного антитела.

Такие антитела могут быть одновалентными антителами. Способы получения одновалентных антител хорошо известны в данной области. Например, один способ включает рекомбинантную экспрессию легкой цепи иммуноглобулина и модифицированной тяжелой цепи. Данная тяжелая цепь укорочена обычно в любой точке в Fc-области для предотвращения сшивания тяжелой цепи. Альтернативно, релевантные остатки цистеина заменяют другим аминокислотным остатком или делетируют для предотвращения сшивания.

Способы in vitro также пригодны для получения одновалентных антител. Расщепление антител для получения их фрагментов, в частности, Fab-фрагментов, может выполняться с использованием рутинных способов, известных в данной области.

Данные антитела могут быть также получены в виде аффинно зрелых антител с использованием известных способов селекции (отбора) и/или мутагенеза, как известно в данной области. Предпочтительные аффинно зрелые антитела обладают аффинностью, которая в пять раз, более предпочтительно в 10 раз, даже более предпочтительно в 20 или 30 раз выше, чем исходное антитело, из которого было получено зрелое антитело.

Биспецифические антитела

Биспецифические антитела являются моноклональными антителами, которые имеют специфичности связывания в отношении по меньшей мере двух различных антигенов. Например, одна из специфичностей связывания может быть в отношении полипептида по настоящему изобретению, другая специфичность связывания может быть в отношении любого другого антигена и предпочтительно в отношении белка или рецептора или субъединицы рецептора клеточной поверхности.

Способы получения биспецифических антител известны в данной области. Традиционно, рекомбинантное получение биспецифических антител основано на коэкспрессии двух пар тяжелая цепь/легкая цепь иммуноглобулина, где две тяжелые цепи имеют разные специфичности (Milstein and Cuello, 1983). Вследствие случайной реаранжировки тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, гибридомы (квадромы) продуцируют потенциальную смесь из десяти различных молекул антитела, из которых только одна имеет правильную биспецифическую структуру. Очистку правильной молекулы обычно выполняют стадиями аффинной хроматографии. Подобные методики описаны в WO 93/08829 и в Traunecker (1991).

Биспецифические антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или фрагментов антител (например, биспецифических F(ab')₂-антител). Способы генерирования биспецифических антител из фрагментов антител описаны в литературе. Например, биспецифические антитела могут быть получены с использованием химического связывания. Также описаны различные способы получения и выделения биспецифических фрагментов антител непосредственно из культуры рекомбинантных клеток.

Hollinger et al. (1993) предложили альтернативный механизм для получения биспецифических фрагментов антител. Фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) линкером, который является слишком коротким, чтобы позволить спаривание между двумя доменами на одной и той же цепи. Таким образом, домены V_H и V_L одного фрагмента вынуждены спариваться с комплементарными доменами V_L и V_H другого фрагмента путем образования двух антиген-связывающих сайтов. Другая стратегия получения биспецифических фрагментов антител с использованием одноцепочечных Fv-димеров (scFv) также сообщалась Gruber et al. (1994).

Рассматриваются также антитела с более чем двумя валентностями. Например, могут быть получены триспецифические антитела (Tutt et al. (1991)).

Гетероконъюгатные антитела

Гетероконъюгатные антитела также входят в объем настоящего изобретения. Гетероконъюгатные антитела состоят из двух ковалентно соединенных антител. Такие антитела были предложены, например, для нацеливания клеток иммунной системы на нежелательные клетки (патент США 4676980) и для лечения ВИЧ-инфекции (WO 91/00360; WO 92/200373; ЕР 03089). Предполагается, что такие антитела могут быть получены in vitro с использованием известных способов химического синтеза белков, включающих способы с участием сшивающих агентов. Например, иммунотоксины могут быть сконструированы с использованием реакции дисульфидного обмена или образования тиоэфирной связи. Примеры подходящих реагентов для данной цели включают иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат и реагенты, описанные, например, в патенте США 4676980.

Полинуклеотиды

Под "выделенным полинуклеотидом" авторы имеют в виду полинуклеотид, который, как правило, был выделен из полинуклеотидных последовательностей, с которыми он ассоциирован или связан в его нативном состоянии. Предпочтительно, выделенный полинуклеотид по меньшей мере на 60% свободен, более предпочтительно по меньшей мере на 75% свободен и более предпочтительно по меньшей мере на 90% свободен от других компонентов, с которыми он природно ассоциирован. Кроме того, термин "полинуклеотид" используется в данном описании взаимозаменяемо с терминами "молекула нуклеиновой кислоты", "ген" и "мРНК".

Термин "рекомбинантный" в контексте полинуклеотида относится к полинуклеотиду, когда он присутствует в клетке или бесклеточной системе экспрессии, в измененном количестве в сравнении с его нативным состоянием. В одном варианте осуществления данная клетка может быть клеткой, которая природно не содержит полинуклеотид. Однако данная клетка может быть клеткой, которая содержит не-эндогенный полинуклеотид, приводящий к измененному, предпочтительно увеличенному, количеству получения кодируемого полипептида. Рекомбинантный полинуклеотид по настоящему изобретению включает полинуклеотиды, которые не были отделены от других компонентов трансгенной (рекомбинантной) клетки или бесклеточной системы экспрессии, в которой он присутствует, и полинуклеотиды, продуцируемые в таких клетках или бесклеточных системах, которые затем очищают по меньшей мере от некоторых других компонентов.

"Полинуклеотид" относится к олигонуклеотиду, полинуклеотиду или любому их фрагменту. Он может быть ДНК или РНК геномного или синтетического происхождения, двухцепочечной или одноцепочечной, и соединенной с углеводом, липидами, белком или другими веществами для выполнения конкретной определенной в данном описании активности.

% идентичности полинуклеотида определяют при помощи GAP-анализа (Needleman and Wunsch, 1970) (программы GCG) с пенальти (штрафом) создания гэпа=5 и пенальти (штрафом) удлинения гэпа=0,3. Запрашиваемая последовательность имеет длину по меньшей мере 45 нуклеотидов, и данный GAP-анализ выравнивает две последовательности по области по меньшей мере 45 нуклеотидов. Предпочтительно, запрашиваемая последовательность имеет длину по меньшей мере 150 нуклеотидов, и данный GAP-анализ выравнивает две последовательности по области по меньшей мере 150 нуклеотидов. Даже еще более предпочтительно, запрашиваемая последовательность имеет длину по меньшей мере 300 нуклеотидов, и данный GAP-анализ выравнивает две последовательности по области по меньшей мере 300 нуклеотидов. Более предпочтительно, две последовательности выравнивают по всей их полной длине.

Что касается определяемых полинуклеотидов, будет понятно, что цифры % идентичности более высокие, чем приведенные выше, будут включать предпочтительные варианты осуществления. Таким образом, когда это допустимо, в свете минимальных цифр % идентичности, предпочтительно данный полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 40%, более предпочтительно по меньшей мере на 45%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 55%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 76%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 91%, более предпочтительно по меньшей мере на 92%, более предпочтительно по меньшей мере на 93%, более предпочтительно по меньшей мере на 94%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 96%, более предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, более предпочтительно по меньшей мере на 99%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,1%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,2%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,3%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,4%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,5%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,6%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,7%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,8% и даже более предпочтительно по меньшей мере на 99,9% идентична релевантной указанной SEQ ID NO.

Полинуклеотиды по настоящему изобретению могут иметь, в сравнении с природными молекулами, одну или несколько мутаций, которые являются делециями, инсерциями или заменами нуклеотидных остатков. Мутанты могут быть либо природными (т.е. выделенными из природного источника), либо синтетическими (например, полученными выполнением сайт-направленного мутагенеза или перетасовкой ДНК на описанной выше нуклеиновой кислоте). Таким образом, очевидно, что полинуклеотиды по настоящему изобретению могут быть либо природными, либо рекомбинантными.

Полинуклеотиды по настоящему изобретению включают полинуклеотиды, которые гибридизуются в строгих условиях с полинуклеотидом, содержащим последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 40% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 90% идентична, SEQ ID NO:1. Термин "строгие условия гибридизации" и т.п. относится в данном контексте к параметрам, которые известны в данной области, включающим вариацию температуры гибридизации в зависимости от длины олигонуклеотида. Параметры гибридизации нуклеиновых кислот могут быть найдены в ссылках, которые объединяют такие способы, Sambrook, et al. (supra), и Ausubel, et al. (supra). Например, строгие условия гибридизации, в данном контексте, могут относиться к гибридизации при 65°С в буфере для гибридизации (3,5×SSC, 0,02% Фиколл, 0,02% поливинилпирролидон, 0,02% бычий сывороточный альбумин, 2,5 мМ NaH₂PO₄ (pH 7), 0,5% ДСН, 2 мМ EDTA).

Векторы и клетки-хозяева

Один вариант осуществления настоящего изобретения включает рекомбинантный вектор, который содержит по меньшей мере одну выделенную молекулу полинуклеотида по настоящему изобретению, инсертированную в любой вектор, способный доставлять молекулу полинуклеотида в клетку-хозяина. Такой вектор содержит гетерологичные полинуклеотидные последовательности, т.е. полинуклеотидные последовательности, которые не обнаруживаются природно смежно с полинуклеотидными молекулами по настоящему изобретению и которые предпочтительно получены из вида, отличного от вида, из которого получена данная полинуклеотидная молекула (из которого получены полинуклеотидные молекулы). Данный вектор может представлять собой либо РНК, либо ДНК, либо быть прокариотическим, либо эукариотическим, и обычно является транспозоном (таким как транспозон, описанный в US 5792294), вирусом или плазмидой.

Термин "функционально связанные”, как использовано в данном описании, относится к функциональной взаимосвязи между двумя или более сегментами нуклеиновой кислоты (например, ДНК). Обычно, он относится к функциональной связи регуляторного элемента транскрипции с транскрибируемой последовательностью. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, такой как определенный в данном описании полинуклеотид, если он стимулирует или модулирует транскрипцию кодирующей последовательности в подходящей клетке. Обычно, промоторные регуляторные элементы транскрипции, которые функционально связаны с транскрибируемой последовательностью, являются физически смежными с данной транскрибируемой последовательностью, т.е. они являются цис-действующими. Однако некоторые регуляторные элементы транскрипции, такие как энхансеры, не должны быть обязательно смежными или расположенными в тесной близости с кодирующими последовательностями, транскрипцию которых они усиливают.

Как использовано в данном описании, экспрессирующим вектором является ДНК- или РНК-вектор, который способен трансформировать клетку-хозяина и выполнять экспрессию указанной полинуклеотидной молекулы. Предпочтительно, экспрессирующий вектор способен также реплицироваться в клетке-хозяине. Экспрессирующие векторы могут быть либо прокариотическими, либо эукариотическими и обычно являются вирусами или плазмидами. Экспрессирующие векторы по настоящему изобретению включают любые векторы, которые функционируют (т.е. управляют экспрессией гена) в рекомбинантных клетках по настоящему изобретению, включающих бактериальные, грибковые клетки, клетки эндопаразитов, артропод, животного и растения.

В частности, экспрессирующие векторы по настоящему изобретению содержат регуляторные последовательности, такие как регуляторные последовательности транскрипции, регуляторные последовательности трансляции, сайты инициации репликации и другие регуляторные последовательности, которые совместимы с рекомбинантной клеткой и которые регулируют экспрессию полинуклеотидных молекул по настоящему изобретению. В частности, рекомбинантные молекулы по настоящему изобретению включают регуляторные последовательности транскрипции. Регуляторные последовательности транскрипции являются последовательностями, которые регулируют инициацию, элонгацию и терминацию транскрипции. Особенно важными регуляторными последовательностями транскрипции являются последовательности, которые регулируют инициацию транскрипции, такие как промоторные, энхансерные, операторные и репрессорные последовательности. Подходящие регуляторные последовательности транскрипции включают любую регуляторную последовательность транскрипции, которая может функционировать по меньшей мере в одной из рекомбинантных клеток по настоящему изобретению. Различные подобные регуляторные последовательности транскрипции известны специалистам в данной области.

Рекомбинантные молекулы по настоящему изобретению могут также (а) содержать секреторные сигналы (т.е. последовательности нуклеиновых кислот сигнального сегмента) для возможности секреции экспрессируемого полипептида по настоящему изобретению из клетки, которая продуцирует данный полипептид, и/или (b) содержать слитые последовательности, которые приводят к экспрессии молекул нуклеиновых кислот по настоящему изобретению в виде слитых белков. Примеры подходящих сигнальных сегментов включают любой сигнальный сегмент, способный управлять секрецией полипептида по настоящему изобретению. Рекомбинантные молекулы могут также включать промежуточные и/или не транслируемые последовательности, окружающие последовательности нуклеиновых кислот и/или находящиеся в последовательностях нуклеиновых кислот молекул нуклеиновых кислот по настоящему изобретению.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения включает клетку-хозяина, содержащую одну или несколько рекомбинантных молекул по настоящему изобретению. Трансформация полинуклеотидной молекулы в клетку может выполняться любым способом, при помощи которого полинуклеотидная молекула может быть инсертирована в данную клетку. Способы трансформации включают, но не ограничиваются ими, трансфекцию, электропорацию, микроинъекцию, липофекцию, адсорбцию и слияние протопластов. Рекомбинантная клетка может оставаться одноклеточной или может вырастать в ткань, орган или многоклеточный организм. Трансформированные полинуклеотидные молекулы по настоящему изобретению могут оставаться внехромосомными или могут интегрироваться в один или несколько сайтов в хромосоме трансформированной (т.е. рекомбинантной) клетки таким образом, что сохраняется их способность экспрессироваться.

Подходящие для трансформации клетки-хозяева включают любую клетку, которая может быть трансформирована полинуклеотидом по настоящему изобретению. Клетки-хозяева по настоящему изобретению либо могут быть эндогенно (т.е. природно) способны продуцировать полипептиды по настоящему изобретению, либо могут быть способны продуцировать такие полипептиды после трансформации по меньшей мере одной полинуклеотидной молекулой по настоящему изобретению. Клетки-хозяева по настоящему изобретению могут быть любой клеткой, способной продуцировать по меньшей мере один белок по настоящему изобретению, и включают клетки животного, растения, бактериальные, грибковые (в том числе дрожжевые) клетки, клетки паразитов и артропод. Предпочтительно, клетка-хозяин является бактериальной клеткой. В одном предпочтительном варианте осуществления клеткой-хозяином является штамм E. coli, имеющий антиген серотипа Н, Н10. Примеры подходящих штаммов E. coli включают CCEC22, CCEC31 и CCEC59, как описано в WO 2007/025333.

Технологии рекомбинантных ДНК могут быть использованы для улучшения экспрессии трансформированной полинуклеотидной молекулы путем манипулирования, например, копийностью данной полинуклеотидной молекулы в клетке-хозяине, эффективностью, с которой транскрибируются полинуклеотидные молекулы, эффективностью, с которой транслируются полученные транскрипты, и эффективностью посттрансляционных модификаций. Рекомбинантные способы, используемые для увеличения экспрессии полинуклеотидных молекул по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются ими, функционально связанные полинуклеотидные молекулы с плазмидами высокой копийности, интеграцию полинуклеотидной молекулы в одну или несколько хромосом клеток-хозяев, добавление последовательностей стабильности векторов к плазмидам, замены или модификации сигналов регуляции транскрипции (например, промоторов, операторов, энхансеров), замены или модификации сигналов регуляции трансляции (например, сайтов связывания рибосом, последовательностей Шайна-Далгарно), модификацию полинуклеотидных молекул по настоящему изобретению, чтобы соответствовать частоте использования кодонов клетки-хозяина и делеции последовательностей, которые дестабилизируют транскрипты.

Детектирование полинуклеотидов

Может быть использован любой подходящий способ, который дает возможность детектировать полинуклеотид по настоящему изобретению, включая способы, которые дают возможность количественно оценивать уровень экспрессии данного полинуклеотида в ткани и/или клетке. Например, присутствие или уровни транскрибируемого гена могут быть определены Нозерн-блоттингом и/или амплификацией данного полинуклеотида, такой как ПЦР. Может быть сделано сравнение посредством ссылки на стандартный контроль. Например, уровни транскрибируемого гена могут быть определены Нозерн-блоттингом и/или ОТ-ПЦР. С появлением количественной (реального времени) ПЦР, количественный анализ экспрессии гена может достигаться использованием подходящих праймеров для представляющего интерес гена. Нуклеиновая кислота может быть помечена и гибридизована на матрице генов, и в этом случае концентрация гена будет прямо пропорциональна интенсивности радиоактивного или флуоресцентного сигнала, генерируемого в данной матрице.

"Полимеразная цепная реакция" ("ПЦР") является реакцией, в которой образуются копии репликатов полинуклеотида-мишени с использованием "пары праймеров" или "набора праймеров", состоящих из "верхнего" и "нижнего" праймера и катализатора полимеризации, такого как ДНК-полимераза, и обычно термостабильного полимеразного фермента. ПЦР-способы известны в данной области и описаны, например, в "PCR" (Ed. M.J. McPherson and S.G Moller (2000) BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford). ПЦР может выполняться на кДНК, полученной обратным транскрибированием мРНК, выделенной из биологических образцов. Однако более легким путем обычно является ПЦР, выполняемая на геномной ДНК.

Праймер является обычно олигонуклеотидом, обычно из приблизительно 20 нуклеотидов, с минимальным количеством приблизительно 15 нуклеотидов, который способен гибридизовать последовательность специфическим образом с последовательностью-мишенью и удлиняться во время ПЦР. Ампликоны или ПЦР-продукты или ПЦР-фрагменты или продукты амплификации являются продуктами удлинения, которые содержат праймер и новые синтезированные копии последовательностей-мишеней. Мультиплексные системы ПЦР содержат множественные наборы праймеров, которые приводят к одновременному получению более чем одного ампликона. Праймеры могут точно соответствовать последовательности-мишени или они могут содержать внутренние ошибочно спаривающиеся основания, что может приводить к индукции рестрикционного фермента или каталитических сайтов распознавания/расщепления нуклеиновой кислоты в конкретных последовательностях-мишенях. Праймеры могут также содержать дополнительные последовательности и/или модифицированные или меченые нуклеотиды для облегчения захвата или детектирования ампликонов. Повторяемые циклы денатурации нагреванием данной ДНК, отжига праймеров с их комплементарными последовательностями и удлинение отожженных праймеров полимеразой приводит к экспоненциальной амплификации последовательности-мишени. Термины мишень, последовательность-мишень или матрица относятся к последовательностям нуклеиновых кислот, которые амплифицируют.

Специалисту в данной области будет понятно, что имеются многочисленные альтернативные способы амплификации полинуклеотида по настоящему изобретению. Примеры других способов амплификации включают полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), лигазную цепную реакцию ("LCR"), а также включают способы изотермальной амплификации, такие как амплификация с вытеснением цепи (SDA), опосредованная петлей изотермальная амплификация ДНК (LAMP).

Альтернативно, полинуклеотиды по настоящему изобретению могут быть детектированы в образце с использованием подходящих способов амплификации, например, гибридизации Саузерн-блота с подходящим образом мечеными зондами. "Зонд" представляет собой одноцепочечную молекулу ДНК или РНК определенной последовательности, которая может спаривать основания со второй молекулой ДНК или РНК, которая содержит комплементарную последовательность (мишень). Стабильность полученной гибридной молекулы зависит от степени спаривания оснований, которая имеет место, и находится под влиянием таких параметров, как степень комплементарности между данным зондом и молекулой-мишенью, и степенью строгости условий гибридизации. Зонды, специфические для описанных в данном описании полинуклеотидов или их частей, могут варьироваться по их длине в виде любого целого числа по меньшей мере от 8 нуклеотидов до более 500 нуклеотидов, включая любую величину между ними, в зависимости от цели, для которой используется данный зонд, и от условий, при которых используется данный зонд. Например, зонд может иметь длину по меньшей мере 8, 10, 15, 20 или 25 нуклеотидов или может иметь длину по меньшей мере 30, 40, 50 или 60 нуклеотидов, или может иметь длину более 100, 200, 500 или 1000 нуклеотидов. Зонды, специфические в отношении описанных в данном описании полинуклеотидов, обычно по меньшей мере на 40%, 50%, 55% или 60%, или по меньшей мере 65%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95%, или даже на 96%, 97%, 98% или 99% идентичны последовательностям нуклеиновых кислот, описанным а данном описании, с использованием программы выравнивания (Myers and Miller, 1989).

Термин "гибридизация", как использовано в данном описании, относится к ассоциации двух молекул друг с другом через образование водородных связей. Факторы, которые влияют на это связывание, включают тип и объем растворителя; температуру реакции; время гибридизации; перемешивание агентов для блокирования неспецифического присоединения молекулы жидкой фазы с твердым носителем (реагенты Денхардта или BLOTTO); концентрацию молекул; использование соединений для увеличения скорости ассоциации молекул (декстрансульфата или полиэтиленгликоля) и строгость условий промывки после гибридизации (см. Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (1989)). В соответствии с данными принципами, ингибирование гибридизации комплементарной молекулы с молекулой-мишенью может быть испытано с использованием анализа гибридизации; по существу гомологичная молекула, имеющая более высокую степень гомологии, будет конкурировать за связывание и ингибировать связывание полностью гомологичной молекулы с молекулой-мишенью в различных условиях строгости, как описано в Wahl et al., (1987).

Как использовано в данном описании в отношении гибридизации, "строгие условия" являются условиями, которые (1) используют низкую ионную силу и высокую температуру для промывки, например, 0,015M NaCl/0,0015M цитрат натрия/0,1% NaDodSO₄ при 50°C; (2) используют во время гибридизации денатурирующий агент, такой как формамид, например, 50% (об./об.) формамид с 0,1% бычьим сывороточным альбумином, 0,1% Фиколлом, 0,1% поливинилпирролидоном, 50 мМ натрий-фосфатным буфером при рН 6,5 с 750 мМ NaCl, 75 мМ цитратом натрия при 42°C; или (3) используют 50% формамид, 5×SSC (0,75M NaCl, 0,075M цитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия (pH 6,8), 0,1% пирофосфат натрия, 5× раствор Денхардта, обработанную ультразвуком ДНК спермы лосося (50 г/мл), 0,1% ДСН и 10% декстрансульфат при 42°C в 0,2×SSC и 0,1% ДСН.

Аттенуированные бактерии

Способы аттенуирования вирулентности бактериальных патогенов известны в данной области. Обычно, в бактериальный геном вводят мутации для предотвращения или уменьшения экспрессии токсинов или других генов вирулентности для делеции или инактивации данного гена. В некоторых случаях, они приводят к полному нокауту функции данного гена. Это может достигаться либо упразднением синтеза любого полипептида вообще из данного гена, либо образованием мутации, которая приводит к синтезу нефункционального полипептида. Для упразднения синтеза полипептида может быть делетирован либо весь ген, либо его 5'-конец. Делеция или инсерция в кодирующей последовательности гена может быть использована для создания гена, который синтезирует только нефункциональный полипептид (например, полипептид, который содержит только N-концевую последовательность белка дикого типа). В случае гена токсина, данная мутация может сделать продукт данного гена нетоксичным.

"Мутация" включает любое изменение в ДНК-последовательности, т.е. геноме, организма в сравнении с родительским штаммом. Такие изменения могут возникать при подвергании данного организма мутагенному стимулу, такому как мутагенное химическое вещество, энергия, радиация, рекомбинантные способы, скрещивание или любой другой способ, используемый для изменения ДНК. Мутация может включать изменение в любой из описываемых нуклеотидных последовательностей или может включать изменение в нуклеотидной последовательности, кодирующей любой из описываемых полипептидов.

Мутация может "аттенуировать вирулентность", если в результате данной мутации уровень вирулентности данной мутантной клетки уменьшается по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%, в сравнении с родительским штаммом. Уменьшение вирулентности может быть также измерено по уменьшению по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% экспрессии и/или токсинной активности полипептида, например, полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, по существу идентичную последовательности SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, ее фрагмент или вариант, в мутантном штамме в сравнении с родительским штаммом.

Специалисту в данной области будет понятно, что аттенуированный бактериальный патоген по настоящему изобретению может быть пригоден для доставки одного или нескольких биологически активных полипептидов субъекту. Примеры биологически активных полипептидов, пригодных для доставки аттенуированными бактериями по настоящему изобретению, включают полипептиды, способные проявлять эндокринные активности, действующие локально или на метаболизм всего организма.

В одном варианте осуществления биологически активный полипептид может быть гетерологичным полипептидом. Термин "гетерологичный полипептид" хорошо понятен в данной области и относится к полипептиду, который не является эндогенным для клетки. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая представляющий интерес полипептид, может происходить из любого организма, способного продуцировать представляющий интерес полипептид, или может быть полностью синтетическим геном. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая данный полипептид, может быть добавлена в клетку, например, инфекцией, трансфекцией, микроинъекцией, электропорацией, доставкой “микроснарядов” или т.п.

В качестве примера, биологически активный полипептид может быть полипептидом, который способен регулировать иммуногемопоэтическую систему. Альтернативно, биологически активный полипептид может быть полипептидом, который способен влиять на жизнеспособность, рост и дифференцировку различных нормальных или неопластических клеток в организме. Альтернативно, биологически активный полипептид может быть полипептидом, который способен влиять на иммунную регуляцию или индукцию воспалительных реакций острой фазы на повреждение и инфекцию. Альтернативно, биологически активный полипептид может быть полипептидом, который способен усиливать или индуцировать устойчивость к инфекции клеток и тканей, опосредованную действием хемокинов на их рецепторы клетки-мишени, или пролиферацию эпителиальных клеток или стимуляцию заживления ран.

Конкретные примеры таких полипептидов включают инсулин, гормон роста, пролактин, кальцитонин, лютеинизирующий гормон, паратиреоидный гормон, соматостатин, тиреотропный (тиреостимулирующий) гормон, вазоактивный кишечный полипептид, цитокин структурной группы 1, такой как IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-32, cMGF, LT, GM-CSF, M-CSF, SCF, IFN-γ, IFN-λ, EPO, G-CSF, LIF, OSM, CNTF, GH, PRL или IFNα/β, цитокин структурной группы 2, такой как TNF-семейство цитокинов, например, TNFα, TNFβ, CD40, CD27 или FAS-лиганды, IL-1-семейство цитокинов, семейство факторов роста фибробластов, тромбоцитарные факторы роста, трансформирующий фактор роста β и факторы роста нервов, цитокин структурной группы 3, например, семейство эпидермального фактора роста цитокинов, хемокины, инсулиноподобные цитокины, цитокин структурной группы 4, такой как херегулины или нейрегулины, например, EGF.

Альтернативно, биологически активный полипептид может быть рецептором или антагонистом для биологически активных полипептидов, определенных выше.

В другом варианте осуществления биологически активный полипептид является антителом, предпочтительно рекомбинантным антителом.

Альтернативно, биологически активный полипептид может быть антимикробным пептидом или его синтетическим вариантом. Антимикробные пептиды включают цекропины, магаинины и дефенсины. Цекропины были первым хорошо охарактеризованным семейством структурно родственных антимикробных пептидов и были обнаружены в широком распространении насекомых (Boman, 2003). У позвоночных, семейство магаининов антимикробных пептидов было выделено из кожных желез и желудочно-кишечного тракта Xenopus laevis, и считали, что они образуют основу защитной системы слизистых поверхностей земноводных против инфекции (Soravia et al., 1988).

Дефенсины являются антимикробными пептидами, обнаруженными в фагоцитарных клетках, выделенных из нескольких видов млекопитающих, включая человека, и могут быть охарактеризованы восемью инвариантными остатками в данной последовательности (Gabay et al., 1989). Механизм антимикробной активности таких пептидов, как дефенсины, осуществляется через селективное разрушение мембран, приводящее к характерному широкому спектру антибиотической активности (Boman, 1995). Антимикробный спектр дефенсинов включает грамположительные и грамотрицательные бактерии, микобактерии, многие грибы и некоторые имеющие оболочку вирусы.

Антимикробные пептиды бактериального происхождения известны как микроцины, колицины и бактериоцины (Jack et al., 1995; Ingham et al., 2003). Известно, что последовательность, структура и механизм активности бактериоцинов разнообразны. Наиболее изобилующие и основательно исследованные бактериоцины включают бактериоцины класса I (лантибиотики) и бактериоцины класса II (малые стабильные в отношении нагревания, не содержащие лантионина пептиды) (Ennahar et al., 2000). Бактериоцины класса II образуют важную подгруппу вследствие их активности и потенциального использования. Бактериоцины класса IIa включают писциколин 126, лейкоцин А и энтероцин Р, среди прочих. Бактериоцины класса IIa имеют общий N-концевой мотив: YGNGVXaaCXaa(K/N)XaaXaaCXaaV(N/D)(W/K/R)Xaa(G/A/S)(A/N), где остатки с более высокой вариабельностью представлены Xaa (Bhugaloo-Vial, et al., 1996). В примере, демонстрирующем антимикробные свойства бактериоцинов, было показано, что, при инъекции мышам, писциколин 126 проявляет антимикробную активность in vivo и значимо уменьшает нагрузку Listeria в печени и селезенке (Ingham et al., 2003).

Альтернативно, биологически активный полипептид может быть ферментом. Данный фермент может быть любым ферментом, обладающим желаемой активностью. Например, может быть желательной доставка фермента, который играет роль в улучшении способности переваривания пищи или удаления антинутритивных соединений. Например, для увеличения перевариваемости пищи могут доставляться деградирующие полисахариды и фибролитические ферменты, такие как ксиланазы (Liu et al., 2005), глюканазы (Cho et al., 2000), целлюлазы (Liu et al., 2005), амилазы, левансахаразы и инулосахаразы. Протеиназы, пептидазы и липазы могут также доставляться для увеличения питательной ценности съеденных пищевых продуктов. Фитазы (Vohra and Satyanarayana, 2003; Nahashon et al., 1994) и кислые фосфатазы (Palacios et al., 2005) могут доставляться для уменьшения антинутритивных эффектов фитата, который обнаружен в семенах растений.

В другом варианте осуществления аттенуированный бактериальный патоген по настоящему изобретению может экспрессировать антиген. Если данный антиген происходит, например, из агента бактериального, грибного, паразитарного или вирусного заболевания, аттенуированный бактериальный штамм может быть использован для вакцинации субъекта против заболеваний, вызываемых такими агентами. Например, аттенуированный бактериальный штамм может быть использован для доставки антигена из птичьего патогенного микроорганизма. Такие микроорганизмы включают, но не ограничиваются ими, виды Corynebacteria, Mycoplasma, Listeria, Borrelia, Chlamydia, Clostridia, Coxiella, Eysipelothrix, Flavobacteria, Staphylococcus, Escherichia, Salmonella, Campylobacter и Streptococcus. Примеры грибковых и паразитических птичьих патогенов, о которых известно, что они инфицируют домашнюю птицу, являются видами Amoebotaenia, Aproctella, Ascaridia, Aspergillus, Candida, Capillaria, Cryptosporidium, Cyathostroma, Dispharynx, Eimeria, Fimbriaria, Gongylonemia, Heterakis, Histomonas, Oxyspirura, Plasmodium, Raillietina, Strongyloides, Subulura, Syngamus, Tetrameres и Trichostrongylus. Вирусы, о которых известно, что они инфицируют домашнюю птицу, включают аденовирусы (например, вирус геморрагического энтерита), астровирусы, коронавирусы (например, вирус инфекционного бронхита), парамиксовирусы (например, вирус ньюкаслской болезни), пикорнавирусы (например, вирус птичьего энцефаломиелита), поксвирусы, ретровирусы (например, вирусы птичьего лейкоза/птичьей саркомы), реовирусы и ротавирусы. Конкретные примеры включают вирус птичьего гриппа, вирус болезни Марека и вирус анемии кур. Предпочтительными продуктами генов для использования в качестве антигенов являются полипептиды и пептиды, включая гликопротеины и липопротеины. Антигенкодирующие гены из прокариотических и эукариотических организмов могут быть клонированы и экспрессированы в аттенуированных бактериях с использованием стандартных способов.

Композиции и введение

"Иммуногенной композицией" называют композицию, которая содержит материалы, которые индуцируют желаемую иммунную реакцию, и включает "вакцину". Термин "вакцина" включает любую композицию, которая индуцирует по меньшей мере частично иммунную реакцию против патогена-мишени или которая эффективно защищает против патогена; например, после введения или инъекции животному (например, представителю птичьих, такому как курица, или представителю свиных, такому как свинья), индуцирует по меньшей мере частично защитную иммунную реакцию против патогена (например, C. perfringens). Субъединица патогена, например, антиген или иммуноген или эпитоп, выделенная из данного патогена, и композиция субъединиц содержит по существу один или несколько антигенов, иммуногенов или эпитопов или состоит по существу из одного или нескольких антигенов, иммуногенов или эпитопов, выделенных из данного патогена. Под индуцированием "по меньшей мере частично защитной" иммунной реакции имеется в виду, что вакцина уменьшает инфекцию и/или колонизацию бактериями, экспрессирующими полипептид по настоящему изобретению, или уменьшает по меньшей мере один симптом, вызываемый инфекцией бактериями, экспрессирующими полипептид по настоящему изобретению.

Иммуногенная композиция может отбирать, активировать или размножать клетки иммунной системы, включающие В- и Т-клетки памяти, например, для создания возможности элиминации инфекционных агентов, таких как бактериальные патогены, экспрессирующие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:3, или их антигенные фрагменты.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция включает подходящий носитель, такой как адъювант, который является агентом, который действует неспецифическим образом, для увеличения иммунной реакции на специфический антиген, или на группу антигенов, делая возможным уменьшение количества антигена в любой конкретной дозе или уменьшение частоты введения доз, требуемых для генерирования желаемой иммунной реакции. Желаемая иммунная реакция может включать, например, полную или частичную защиту от распространения бактериального патогена (присутствия в фекалиях инфицированного животного, например млекопитающего или птицы) или колонизации (присутствия в кишечнике инфицированного животного, например, млекопитающего или птицы) бактериальным патогеном. Например, желаемая иммунная реакция может включать любую величину от 10%-100%, например, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, защиту от распространения бактериального патогена или колонизации бактериальным патогеном в вакцинированном животном в сравнении с невакцинированным животным.

Адъюванты могут быть использованы для улучшения иммунной реакции и/или увеличения стабильности вакцинных препаратов. Адъюванты обычно описываются как неспецифические стимуляторы иммунной системы, но могут быть также использованы для нацеливания на конкретные ветви иммунной системы. Одно или несколько соединений, которые обладают такой активностью, могут быть добавлены к вакцине. Таким образом, конкретные вакцины по настоящему изобретению дополнительно содержат адъювант. Примеры химических соединений, которые могут быть использованы в качестве адъювантов, включают, но не ограничиваются ими, соединения алюминия (например, гидроксид алюминия), метаболизируемые и не метаболизируемые масла, минеральные масла, включающие производные олеата маннида в растворе минеральных масел (например, MONTANIDE ISA 70 из Seppic SA, France), и легкие минеральные масла, такие как DRAKEOL 6VR, блок-сополимеры, ISCOM (иммунные стимулирующие комплексы), витамины и минералы (включающие, но не ограничивающиеся ими, витамин Е, витамин A, селен и витамин B12) и CARBOPOL^®.

Другие подходящие адъюванты, которые иногда называют иммуностимуляторами, включают, но не ограничиваются ими: цитокины, факторы роста, хемокины, супернатанты от клеточных культур лимфоцитов, моноциты, клетки из лимфоидных органов, препараты клеток и/или экстракты из растений, бактерий или паразитов (препараты Staphylococcus aureus или липополисахаридные препараты) или митогены.

Обычно, адъювант вводят в то же самое время, что и антиген по настоящему изобретению. Однако адъюванты также могут, или альтернативно, вводиться в пределах двухнедельного периода перед вакцинацией и/или в течение некоторого периода времени после вакцинации, т.е. пока антиген, например, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, или ее антигенный фрагмент, сохраняется в тканях.

Иммуногенные композиции по настоящему изобретению могут включать описанные в данном описании молекулы полипептидов и нуклеиновых кислот, или их иммуногенные фрагменты, и могут вводиться с использованием любой формы введения, известной в данной области или описанной в данном описании. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения иммуногенная композиция или вакцина может включать живой бактериальный патоген, убитый бактериальный патоген или их компоненты. Живые бактериальные патогены, которые могут вводиться в форме пероральной вакцины, могут быть аттенуированы таким образом, что уменьшается вирулентность данного бактериального патогена, но не его индукция иммунной реакции. Живая вакцина может быть способна колонизировать кишечник инокулированного животного, например, птицы.

В некоторых вариантах осуществления описанные в данном описании молекулы полипептидов и нуклеиновых кислот, или их антигенные фрагменты, или мутированные бактерии (например, аттенуированные бактерии), описанные в данном описании, могут вводиться домашней птице, например, курице, уткам, индейкам и т.д. для индукции иммунной реакции, например, индукции антител у домашней птицы. Яйца или их продукты, полученные от такой домашней птицы, которые проявляют иммунную реакцию против описываемых молекул полипептидов и нуклеиновых кислот, или их иммуногенные фрагменты, могут вводиться животному, например, людям, крупному рогатому скоту, козам, овцам и т.д. для индуцирования иммунной реакции на описываемые молекулы полипептидов и нуклеиновых кислот, у животного. Способы индуцирования антител у домашней птицы и введения таких антител описаны, например, в патенте США 5750113 и патенте США 6730822.

Иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению могут быть дополнительно дополнены добавлением других рекомбинантных или очищенных антигенов, которые могут приводить к получению антител разнообразных специфичностей при введении субъекту-животному. Не все из таких антител должны быть защитными от заболевания. В конкретном варианте данного типа, такие антигены происходят также из C. perfringens. Таким образом, вакцина по настоящему изобретению может содержать различные другие активные или инактивированные патогенные факторы, вместе с полипептидом по настоящему изобретению. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением, полипептид по настоящему изобретению может быть комбинирован с другими клостридиальными или неклостридиальными клетками, анатоксинами и экстрактами.

Дополнительные антигены могут содержать вирусный антиген и/или бактериальный антиген, и/или паразитарный антиген. Например, данный антиген может быть получен из микроорганизма, включающего, но не ограничивающегося ими, виды Corynebacteria, Mycoplasma, Listeria, Borrelia, Chlamydia, Clostridia, Coxiella, Eysipelothrix, Flavobacteria, Staphylococcus, Escherichia, Salmonella, Campylobacter и Streptococcus. Примеры грибковых и паразитарных птичьих патогенов, о которых известно, что они инфицируют домашнюю птицу, включают виды Amoebotaenia, Aproctella, Ascaridia, Aspergillus, Candida, Capillaria, Cryptosporidium, Cyathostroma, Dispharynx, Eimeria, Fimbriaria, Gongylonemia, Heterakis, Histomonas, Oxyspirura, Plasmodium, Raillietina, Strongyloides, Subulura, Syngamus, Tetrameres и Trichostrongylus. Вирусы, о которых известно, что они инфицируют домашнюю птицу, включают аденовирусы (например, вирус геморрагического энтерита), астровирусы, коронавирусы (например, вирус инфекционного бронхита), парамиксовирусы (например, вирус ньюкаслской болезни), пикорнавирусы (например, вирус птичьего энцефаломиелита), поксвирусы, ретровирусы (например, вирусы птичьего лейкоза/птичьей саркомы), реовирусы и ротавирусы.

Поливалентная вакцина по настоящему изобретению также может содержать один или несколько из следующих антигенов: бета-токсин C. perfringens, бета-2-токсин C. perfringens, энтеротоксин C. perfringens, эпсилон-токсин C. perfringens, йота-токсин C. perfringens, каппа-токсин C. perfringens, лямбда-токсин C. perfringens, тета-токсин C. perfringens, геморрагический токсин C. sordellii, летальный токсин C. sordellii, А-токсин C. difficile, В-токсин C. difficile, альфа-токсин C. septicum, альфа-токсин C. novyi и бета-токсин C. novyi.

Иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению могут вводиться в виде жидкости, эмульсии, высушенного порошка и/или “тумана” любым парентеральным способом, внутривенно, внутрибрюшинно, интрадермально, скарификацией, подкожно, внутримышечно или инокулироваться через слизистую оболочку, например, перорально, интраназально, в виде аэрозоля, с использованием глазных капель, введением in ovo или имплантироваться в виде лиофилизированного порошка.

Введение описываемых молекул полипептидов и нуклеиновых кислот или их иммуногенных фрагментов, мутированных бактерий (например, аттенуированных бактерий) и/или описываемых иммуногенных композиций может удобным образом достигаться инъекцией в яйцо птицы (например, домашней птицы) и обычно инъекцией в воздушный мешок. Несмотря на то, что воздушный мешок является предпочтительным способом введения in ovo, другие участки, такие как желточный мешок или хориоаллантоисная жидкость, могут быть также инокулированы инъекцией. Скорость вылупляемости может слегка уменьшаться, когда воздушный мешок не является мишенью для введения, хотя необязательно при коммерчески неприемлемых уровнях. Механизм инъекции не является решающим для применения на практике настоящего изобретения, хотя предпочтительно, чтобы игла не вызывала чрезмерного повреждения яйца или ткани и органов развивающегося зародыша или внеэмбриональных мембран, окружающих зародыш.

Как правило, подходящим является шприц для подкожных инъекций, снабженный иглой калибра 22. Способ по настоящему изобретению особенно хорошо приспособлен для применения с автоматизированной системой инъекции, такой как системы инъекций, описанные в US 4903635, US 5056464, US 5136979 и патенте США 20060075973.

Настоящее изобретение также относится к способам обеспечения пассивного иммунитета потомку самки животного (например, беременной самки), предусматривающим введение вакцины по настоящему изобретению самке животного (например, матери) перед рождением ее потомка. "Пассивным иммунитетом" называют перенос иммунитета от матери к потомку, и он может выполняться inter alia через введение внутрь молозива, как это происходит у млекопитающих, или абсорбцией антитела в кровоток из яичного желтка, как это происходит у птиц.

В одном варианте осуществления самка является птицей, и вакцину вводят самке птицы перед откладыванием яиц, которые содержат потомство. Таким путем ее потомство обеспечивается пассивным иммунитетом. В одном подобном варианте осуществления птицей является домашняя птица. Предпочтительно домашней птицей является курица, индейка или утка.

Иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению могут содержать фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый носитель включает приемлемый в ветеринарии носитель. В конкретном варианте осуществления термин "фармацевтически приемлемый" означает “одобренный регулирующим ведомством Федерального правительства или правительства штата или находящийся в списке в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применения животным и, более конкретно, людям. Термин "носитель" относится к разбавителю, эксципиенту или наполнителю, с которым вводится данное терапевтическое средство. Такие фармацевтические носители могут быть стерильными жидкостями, такими как вода и масла, включающие масла, происходящие из нефти, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло и т.п.

Обычно, ингредиенты препаратов по настоящему изобретению поставляются либо по отдельности, либо смешанными вместе в единичной дозированной форме, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или пакетик, с указанием количества активного агента.

Предоставлены также композиции, содержащие полипептид по настоящему изобретению, полинуклеотид по настоящему изобретению, вектор по настоящему изобретению и/или клетку-хозяина по настоящему изобретению. Как будет понятно специалисту в данной области, данные композиции могут содержать подходящие носители или эксципиенты.

ДНК-вакцины

ДНК-вакцинация включает прямое введение in vivo ДНК, кодирующей антиген, в клетки и/или ткани субъекта для экспрессии данного антигена клетками ткани субъекта. Такие вакцины называют в данном описании "ДНК-вакцинами" или "вакцинами на основе нуклеиновых кислот". Примеры ДНК-вакцин описаны в US 5939400, US 6110898, WO 95/20660 и WO 93/19183. Способность непосредственно инъецированной ДНК, которая кодирует антиген, индуцировать защитную иммунную реакцию была продемонстрирована в многочисленных экспериментальных системах (см., например, Conry et al., 1994; Cardoso et al., 1996; Montgomery et al., 1993; Yang et al., 1997).

Фактором, о котором известно, что он влияет на иммунную реакцию, индуцируемую ДНК-иммунизацией, является способ доставки ДНК, например парентеральные способы, могут давать низкие скорости переноса гена и производить значительную вариабельность экспрессии гена (Montgomery et al., 1993). Высокоскоростная инокуляция плазмид, с использованием генного пистолета, ускоряла иммунные реакции мышей (Fynan et al., 1993), предположительно вследствие большей эффективности трансфекции ДНК и более эффективной презентации антигена дендритными клетками. Векторы, содержащие вакцину на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, могут также вводиться желаемому хозяину другими способами, известными в данной области, например, трансфекцией, электропорацией, микроинъекцией, трансдукцией, слиянием клеток, DEAE-декстрановым способом, осаждением фосфатом кальция, липофекцией (слиянием липосом) или ДНК-вектором в качестве транспортера.

Вакцины, полученные из трансгенных растений

Термин "растение" относится к целым растениям, органам растений (например, листьям, стеблям, корням и т.д.) семенам, клеткам растений и т.п. Растения, рассматриваемые для применения в практике настоящего изобретения, включают как однодольные, так и двудольные растения. Примеры двудольных включают кукурузу, томат, картофель, фасоль, сою и т.п. Обычно, трансгенное растение рутинным образом используют в качестве источника кормового продукта для сельскохозяйственных животных, в частности, кур.

Трансгенные растения, определенные в контексте настоящего изобретения, включают растения (а также части и клетки указанных растений) и их потомство, которые были генетически модифицированы с использованием способов рекомбинантных ДНК для вызывания или увеличения продуцирования по меньшей мере одного полипептида по настоящему изобретению в желаемом растении или органе растения.

Существуют несколько способов введения чужеродного генетического материала в клетку растения и получения растений, которые стабильно сохраняют и экспрессируют введенный ген. Такие способы включают ускорение генетического материала, нанесенного в виде покрытия на микрочастицы, непосредственно в клетки (см., например, US 4945050 и US 5141131). Растения могут быть трансформированы с использованием Agrobacterium-технологии (см., например, US 5177010, US 5104310, US 5004863, US 5159135). Технологию электропорации также использовали для трансформации растений (см., например, WO 87/06614, US 5472869, 5384253, WO 92/09696 и WO 93/21335). Кроме многочисленных технологий для трансформации растений, может также варьироваться тип ткани, которую приводят в контакт с чужеродным геном. Такая ткань может включать, но не ограничивается ими, эмбриогенную ткань, каллусную ткань типа I и II, гипокотиль, меристему и т.п. Почти все ткани растений могут быть трансформированы во время развития и/или дифференцировки при помощи подходящих описываемых способов.

Ряд векторов, подходящих для стабильной трансфекции клеток растений, были описаны, например, Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987; Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989 и Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Обычно, экспрессирующие векторы растений включают, например, один или несколько клонированных генов растений под транскрипционным контролем 5'- или 3'-регуляторных последовательностей и доминантный селектируемый маркер. Такие экспрессирующие векторы растений могут также содержать промоторный регуляторный район (например, регуляторный район, регулирующий индуцибельную или конститутивную, регулируемую окружающей средой или стадией развития или клетко- или тканеспецифическую экспрессию), сайт инициации транскрипции, сайт связывания рибосом, сигнал процессинга РНК, сайт терминации транскрипции и/или сигнал полиаденилирования.

Примеры промоторов растений включают, но не ограничиваются ими, промотор малой субъединицы рибулозо-1,6-бисфосфаткарбоксилазы, промотор бета-конглицинина, промотор фазеолина, промотор ADH, промоторы белков теплового шока и тканеспецифические промоторы.

Промоторы могут также содержать определенные энхансерные элементы последовательности, которые могут улучшать эффективность транскрипции. Типичные энхансеры включают, но не ограничиваются ими, Adh-интрон 1 и Adh-интрон 6.

Конститутивные промоторы управляют непрерывной экспрессией генов во всех типах клеток и во всех временных точках (например, промоторы актина, убиквитина, CaMV 35S). Тканеспецифические промоторы ответственны за экспрессию генов в конкретных типах клеток или ткани, таких как листья или семена (например, промоторы зеина, олеозина, напина, АСР, глобулина и т.п.), и такие промоторы также могут быть использованы. Промоторы также могут быть активными во время определенной стадии развития растения, а также активными в тканях или органах растений. Примеры таких промоторов включают, но не ограничиваются ими, специфические для пыльцы, специфические для зародыша, специфические для шелка (совокупности столбиков в початке) кукурузы, специфические для волокна хлопчатника, специфические для корня, специфические для эндосперма семян промоторы и т.п.

При определенных обстоятельствах может быть желательным использование индуцибельного промотора. Индуцибельный промотор является ответственным за экспрессию генов в ответ на конкретный сигнал, такой как: физические стимулы (гены белков теплового шока); свет (RUBP-карбоксилаза), гормон (Em); метаболиты и стресс. Могут быть использованы другие желаемые элементы транскрипции и трансляции, которые функционируют в растениях.

В дополнение к промоторам растений, промоторы из различных источников могут быть эффективно использованы в клетках растений для экспрессии чужеродных генов. Например, могут быть использованы промоторы бактериального происхождения, такие как промотор октопинсинтазы, промотор нопалинсинтазы, промотор маннопинсинтазы; промоторы вирусного происхождения, такие как промотор вируса мозаичной болезни цветной капусты (35S и 19S) и т.п.

Ряд полученных из годных в пищу растений вакцин развиты в настоящее время для патогенов как животных, так и человека (Hood and Jilka, 1999). Иммунные реакции получали также при пероральной иммунизации трансгенными растениями, продуцирующими вирус-подобные частицы (VLP), или химерными вирусами растений, обнаруживающими антигенные эпитопы (Modelska et al., 1998; Kapustra et al., 1999). Предполагалось также, что состоящая из частиц форма VLP или химерных вирусов может приводить к более высокой стабильности антигена в желудке, с эффективным увеличением количества антигена, доступного для поглощения в кишечнике (Modelska et al., 1998).

Пища

В одном варианте осуществления композицией по настоящему изобретению является пища (корм) или пищевой (кормовой) продукт. Для целей настоящего изобретения, "пища" или "пищевые продукты" включают любую пищу или любой препарат для потребления человеком или животным (таким как крупный рогатый скот, лошади, козы и овцы) (включая энтеральное и/или парентеральное потребление), которые при попадании в организм (а) служат для питания или построения тканей или подачи энергии; и/или (b) сохраняют, восстанавливают или поддерживают пищевой статус или метаболическую функцию.

Пищевые продукты включают пищевые вещества, такие как годные в пищу макронутриенты, витамины и/или минеральные вещества, в количествах, желаемых для конкретного применения. Количества ингредиентов будут варьироваться в зависимости от того, предназначена данная композиция для применения нормальными индивидуумами или для применения индивидуумами, имеющими индивидуализированные потребности, например, индивидуумами, страдающими от метаболических нарушений, или т.п.

Примеры веществ с питательной ценностью включают, но не ограничиваются ими, макронутриенты, такие как годные в пищу жиры, углеводы и белки. Примеры таких годных в пищу жиров включают, но не ограничиваются ими, кокосовое масло, масло бурачника, грибное масло, масло черной смородины, соевое масло и моно- и диглицериды. Примеры таких углеводов включают (но не ограничиваются ими): глюкозу, годную в пищу лактозу и гидролизованный крахмал. Кроме того, примеры белков, которые могут быть использованы в пищевых композициях по настоящему изобретению, включают (но не ограничиваются ими) белки сои, электродиализованную молочную сыворотку, электродиализованное сепарированное молоко, молочную сыворотку или гидролизаты белков.

Что касается витаминов и минеральных веществ, следующее может быть добавлено к пищевым композициям по настоящему изобретению: кальций, фосфор, калий, натрий, хлорид, магний, марганец, железо, медь, цинк, селен, йод и витамины А, Е, D, C и комплекс В. Могут быть также добавлены другие подобные витамины и минеральные вещества.

Компоненты, используемые в пищевых композициях по настоящему изобретению, могут быть полуочищены или очищены. Под полуочищенным или очищенным подразумевают материал, который был получен очисткой природного материала или синтезом de novo.

В одном варианте осуществления полипептид по настоящему изобретению используют при приготовлении пищи (корма). Например, пища, содержащая полипептид по настоящему изобретению, может быть использована для вакцинации животных для обеспечения по меньшей мере частичной защиты от инфекции и/или колонизации бактериальным патогеном, экспрессирующим полипептид с токсинной активностью. Предпочтительно, бактериальный патоген экспрессирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40% идентична SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:3. В одном варианте осуществления бактериальный патоген принадлежит к роду Clostridium, например, бактериальным патогеном является Clostridium perfringens.

В другом варианте осуществления пища содержит трансгенное растение по настоящему изобретению и/или часть указанного растения, и/или экстракт указанного растения.

Агонисты и антагонисты - Анализы и молекулы

Полипептиды по настоящему изобретению могут быть использованы в способе скрининга на соединения, которые активируют (агонисты) или ингибируют (антагонисты) токсинную активность рассматриваемого полипептида.

Примеры потенциальных антагонистов включают антитела, олигонуклеотиды и их производные. Потенциальный антагонист включает малую молекулу, которая связывается с полипептидом по настоящему изобретению, делая его недоступным для субстрата полипептида. Примеры малых молекул включают, но не ограничиваются ими, малые пептиды или пептид-подобные молекулы. Малые молекулы могут имитировать структуру субстрата полипептида по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение включает также анализы высокопроизводительного скрининга (HTS) для идентификации соединений, которые взаимодействуют с полипептидом или ингибируют биологическую активность (т.е. влияют на ферментативную активность) полипептида, обладающего токсинной активностью. HTS-анализы делают возможным эффективный скрининг больших количеств соединений. HTS-анализы предназначены для идентификации "хитов" или "соединений-примеров", обладающих желаемым свойством, модификации которых могут быть спроектированы для улучшения желаемого свойства. Химическая модификация "хита" или "соединения-примера" часто основана на идентифицируемой взаимосвязи структура/активность между "хитом" и токсинным полипептидом.

Антагонисты полипептида по настоящему изобретению могут быть использованы для защиты животных от заболевания добавлением их в корм или напиток животных. Такая обработка может уменьшать нагрузку активных происходящих из окружающей среды организмов, с которыми животное находится в контакте. Таким образом, настоящее изобретение относится к корму и/или напитку, содержащим антагонист полипептида по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к применению корма и/или напитка, содержащих такие антагонисты, для уменьшения инфекции и/или колонизации животного бактерией, которая экспрессирует полипептид по настоящему изобретению.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Токсин NetB Clostridium perfringens

Секвенирование гена, кодирующего NetB

10 мкг геномной ДНК, выделенной из штамма Clostridium perfringens EHE-NE18, использовали для получения показателей считывания последовательностей, контигов и баллов качества последовательностей. Аминокислотную последовательность расшифровывали из нуклеотидной последовательности. Предсказание сигнального пептида выполняли с использованием программы SignalP v 3.0 (Bendtsen et al., 2004). Последовательности, гомологичные расшифрованной аминокислотной последовательности, подвергали поиску с использованием гэпированной программы BLAST (Altschul et al., 1997).

Нуклеотидная последовательность гена, кодирующего NetB, представлена в виде SEQ ID NO:1, и аминокислотная последовательность NetB, включающая сигнальную последовательность, представлена в виде SEQ ID NO:3. Последовательность сигнального пептида отщепляется от зрелого секретируемого белка (SEQ ID NO:2). Поиск BLAST идентифицировал бета-токсин C. Perfringens как имеющий менее чем 39%-ную идентичность с NetB (фиг.1).

Очистка рекомбинантного NetB и генерирование кроличьих анти-rNetB-антисывороток

Ген netB ПЦР-амплифицировали и клонировали в pENTR/SD/D-TOPO и субклонировали в рамке считывания в экспрессирующий вектор pDest41BA. Белок очищали на аффинной колонке с никелем, с последующей гель-фильтрацией (S200). Фракции пиков объединяли, расщепляли TEV и повторно наносили на колонку с никелем для удаления нерасщепленных белков и TEV. Рекомбинантный белок (~1,3 мг) отсылали в Chemicon для получения антитела (Chemicon-Millipore, CA, USA). Анти-rNetB-антисыворотку использовали в Вестерн-блот-анализе штаммов C. perfringens и для исследований нейтрализации.

Очистка нативного NetB

C. perfringens EHE-NE18 выращивали в бульоне TPG до OD₆₀₀ нм 0,6. Культуральный супернатант (3 л) получали центрифугированием при 18000 g в течение 15 минут при 4°С. Полученный супернатант концентрировали в 5 раз с использованием ультрафильтрации (Amicon 8400) через мембрану 10 кДа (DIAFLO^® YM 10-76 мм, Amicon), с последующим осаждением 40%-ным (масса/объем) (NH₄)₂SO₄ при 4°C в течение ночи и разделяли центрифугированием при 18000 g в течение 2 часов при 4°C. Осадок, содержащий токсин, концентрировали в 20 раз (всего в 100 раз) и диализировали против 10 мМ Трис-HCl pH 7,2 в течение 48 часов при 4°C. Белки хроматографировали с использованием анионообменной смолы Sepharose Q FF (GE) с Трис-буфером (pH 8,5) и проходящий через колонку раствор собирали.

Пример 2. Генерирование мутантного штамма C. perfringens, лишенного токсина

Манипуляции с ДНК проводили в соответствии со стандартными способами. Олигонуклеотидами, используемыми в конструировании суицидной плазмиды, были AKP60 (SEQ ID NO:7), AKP61 (SEQ ID NO:8), AKP58 (SEQ ID NO:9) и AKP59 (SEQ ID NO:10). Все амплифицированные продукты клонировали в систему клонирующего вектора pGEM^®-T Easy (Promega) и затем субклонировали в случае необходимости. Меченую, частично делетированную суицидную плазмиду, pALK.16, конструировали клонированием фрагментов области гена netB на любой стороне кассеты catP в pALK1 и получали делецию 541 п.н. гена netB. Сначала MfeI-SpeI-фрагмент, амплифицированный с использованием AKP60 и AKP61, направленно клонировали в сайты EcoRI-SpeI pALK1, с последующим клонированием BamHI-NheI-фрагмента 1937 п.н., амплифицированного с использованием AKP58 и AKP59, в сайты BamHI-NheI полученной плазмиды. Наконец, ermB и oriT, амплифицированные из pJIR1457, клонировали с затуплением концов в сайт SmaI. Конечную суицидную плазмиду pALK16 вводили в штамм C. perfringens EHE-NE18, как описано ранее (Scott and Rood, (1989)). После роста при 37°C на TSC, дополненной тиамфениколом, колонии перекрестно наносили на TSC, дополненную эритромицином, для подтверждения того, что имел место двойной кроссовер. Колонии, которые выращивали на соответствующих антибиотиках, отбирали для дополнительного анализа. Получали хромосомную ДНК и использовали ПЦР и блот-анализ по Саузерну для подтверждения, что полученные мутанты происходили из событий двойного кроссовера в области гена netB. Конструировали комплентационную плазмиду, pALK20, клонированием полноразмерного гена netB в челночный вектор pJIR1457 C. perfringens и вводили в оба мутанта. Комплементацию подтверждали с использованием отбора с эритромицином и тестировали в анализе цитотоксичности. Схематическая диаграмма области хромосомы NE18-ΔnetB показана на фиг.2.

Пример 3. Анализ активности NetB

Анализ цитотоксичности выполняли на культуральном супернатанте C. perfringens EHE-NE18. Клетки LMH культивировали до 70% конфлюэнтности в 26-луночных планшетах, покрытых 0,2% желатином, и выращивали в среде EMEM при 37°C. Культуральный супернатант добавляли к среде с 2-кратным разведением по всей чашке до 1:32 и инкубировали в течение 16 часов при 37°C. Клетки LMH инкубировали в присутствии неразбавленной культуральной среды TPG (фиг.3a); культурального супернатанта C. perfringens EHE-NE18, разведение 1:16 (фиг.3b); культурального супернатанта ненекротического штамма 13 энтерита C. perfringens JIR325, разведение 1:2 (фиг.3c); или культурального супернатанта C. perfringens NE18-M1 (мутанта plc, не экспрессирующего альфа-токсин), разведение 1:16 (фиг.3d). Цитопатические эффекты (CPE) наблюдали под световым микроскопом при увеличении 100×.

Нормальные клетки (фиг.3a) выглядят здоровыми, но добавление культурального супернатанта из штамма, продуцирующего NetB, заставляет клетки округляться и умирать (фиг.3b). Супернатант из штамма, который не экспрессирует NetB, не влиял на данные клетки (фиг.3с). Делеция гена альфа-токсина не влияет на способность культурального супернатанта убивать клетки (фиг.3d).

Пример 4. Комплементация мутантов C. perfringens, лишенных токсина NetB

NE18-делетированный netB1 штамм (netB-отрицательный штамм) комплементировали комплементационной плазмидой pALK20 netB. Затем комплементированный штамм C. perfringens тестировали на токсинную активность. Для анализа цитотоксичности, клетки LMH культивировали до 70% конфлюэнтности в 24-луночных планшетах, покрытых 0,2% желатином, и выращивали: с культуральным супернатантом EHE-NE18, разведение 1:16 dilution (фиг.4а); культуральным супернатантом NE18-делетированного netB1, разведение 1:2 (фиг.4b); культуральным супернатантом NE18-делетированного netB1+pJIR.1457 (челночная плазмида), разведение 1:2 (фиг.4c); культуральным супернатантом NE18-делетированного netB1+pALK20 (netB-комплементационная плазмида), разведение 1:16 (фиг.4d); неразбавленной культуральной средой TPG (фиг.4e); или очищенным на колонке рекомбинантным NetB, разведение 1:8 (фиг.4d).

Делеция гена netB уничтожала убивающую активность в анализе культуры клеток. Комплементация данного мутанта геном, клонированным на плазмиду, восстанавливала убивающую активность. Рекомбинантный белок NetB убивает культивируемые клетки.

Пример 5. Количественный анализ убивания клеток токсинным белком

Для определения способности NetB убивать клетки, анализ цитотоксичности с использованием лактатдегидрогеназы выполняли на клетках LMH, обработанных NetB. Клетки LMH культивировали до 70% конфлюэнтности в 96-луночных планшетах, покрытых 0,2% желатина, и выращивали в среде EMEM при 37°C. Полуочищенный NetB из NE18-M1 добавляли к данной среде с 2-кратным разведением по всему планшету до разведения 1:128 и инкубировали в течение 4 часов при 37°C. LDH, высвобожденную в супернатанте, измеряли в качестве индикатора цитолиза с использованием набора Cyto-Tox (Promega) и выражали в виде процента цитотоксичности. Каждое разведение представляли в трех повторах и рассчитывали SEM для каждого разведения (фиг.5).

Пример 6. netB-мутантные штаммы на модели заболевания кур

Группы из 11 птиц заражали либо штаммом дикого типа C. perfringens (NE18), либо netB-делетированными мутантами данного штамма (NE18-NetB-M1 и NE18-NetB-M2) в возрасте 20 дней и 21 день. В возрасте 24 дней птиц подвергали аутопсии для оценивания в баллах некротических повреждений в кишечнике. Сегменты подвздошной или тощей кишки, размером приблизительно 2-4 см, собирали в 10% нейтральный забуференный фосфатом натрия формалин. Образцы тонкой кишки разрезали поперечно при интервалах 4 мм и сегменты обрабатывали, с получением залитых в парафин блоков для рутинной гистологии, делали срезы 4-5 мкм и окрашивали их гематоксилином и эозином (РЕ). Гистологические предметные стекла исследовали световой микроскопией. Кишечники оценивали в баллах в соответствии с количеством некротических повреждений: 0 - нет повреждений, 1 - тонкостеночные и рыхлые кишечники, 2 - очаговый некроз или изъязвление (16 или более очагов), 3 - очаговый некроз или изъязвление (6-15 очагов), 4 - очаговый некроз или изъязвление (16 или более очагов), 5 - некротические участки длиной 2-3 см, 6 - диффузный некроз, типичный для полевых случаев. Штамм дикого типа показывал значительный уровень заболевания, тогда как ни один из независимо выделенных мутантов не обнаруживал каких-либо признаков заболевания. Был сделан вывод, что NetB является главным фактором вирулентности, необходимым для патогенеза заболевания.

Таблица 2 NetB-мутантные штаммы имеют уменьшенную вирулентность на модели заболевания кур
Номер птицы	Штамм для заражения
NE18	NE18-NetB-Ml	NE18-NetB-M2
1	3	0	0
2	2	0	0
3	0	0	0
4	0	0	0
5	0	0	0
6	4	0	0
7	2	0	0
8	3	0	0
9	0	0	0
10	3	0	0
11	0	0	0
Средний балл поражения	1,55	0	0
Число пораженных птиц в группе	6	0	0
Взвешенный балл - среднее × число	9,3	0	0

Пример 7. Исследование на присутствие токсина в штаммах C. perfringens

ПЦР-исследование на присутствие токсина в штаммах C. perfringens

Присутствие гена netB в штаммах NE и non-NE C. perfringens исследовали при помощи ПЦР. Для каждого из тестируемых штаммов C. perfringens единственную колонию суспендировали в 0,1 мл дистиллированной воды, кипятили в течение 10 минут и затем центрифугировали при 10000 g в течение 10 минут. Супернатанты собирали и использовали в качестве матричных ДНК в ПЦР. ПЦР выполняли в общем объеме 25 мкл реакционной смеси, содержащей: 1× ПЦР-буфер (не содержащий Mg²⁺); 2,5 мМ MgCl₂; смесь 0,2 мМ dNTP; 2,5 единиц ДНК-полимеразы Go Taq (Promega); 50 пМ праймеров AK.P78 и AK.P79; и 5 мкл раствора матрицы. В ПЦР использовали следующие условия: денатурация при 94°C в течение 2 мин; 35 циклов денатурации при 94°C в течение 30 с; отжиг при 55°C в течение 30 с и удлинение при 72°C в течение 1 мин; с конечной стадией удлинения при 72°C в течение 12 мин. Продукты ПЦР анализировали электрофорезом на 1,5% агарозных гелях, как показано на фиг.6: а. штаммы NE; b. штаммы Non-NE. netB-фрагмент 384 п.н. виден в большинстве штаммов C. perfringens, выделенных из заболевших некротическим энтеритом кур. netB-специфический ПЦР-фрагмент не наблюдается ни в одном другом штамме. Это свидетельствует о том, что присутствие гена netB было хорошим индикатором вирулентности C. perfringens у кур, и такой анализ может быть использован для детектирования потенциально вирулентных штаммов.

Вестерн-блот исследование на присутствие токсина в штаммах C. perfringens

Штаммы C. perfringens выращивали в предварительно прокипяченных бульонах TPG до OD₆₀₀ нм ~0,6. Культуральный супернатант получали центрифугированием при 18000 g в течение 10 минут. Супернатанты разделяли электрофорезом в ДСН-ПААГ (NuPAGE^® Novex 4-12% Бис-Трис-гель, Invitrogen) в рабочем буфере MES-SDS (NuPAGE^® MES SDS Running Buffer, Invitrogen). Белки переносили на мембрану PDVF (Millipore) и зондировали кроличьим поликлональным антителом против rNetB (Chemicon, USA). Блоты проявляли с использованием набора для Вестерн-блоттинга ECL (Amersham Biosciences, NJ, USA) и результаты регистрировали на радиоавтографической пленке, как показано на фиг.7. Скобки указывают штаммы NE и non-NE C. perfringens. Результаты Вестерн-блоттинга подтвердили результаты ПЦР-исследования: данный ген и белок присутствуют в большинстве произведенных из NE штаммов, но не в штаммах non-NE. Данный способ детектирования на основе антител является другим способом для детектирования потенциально вирулентных штаммов.

Пример 8. Защитная эффективность рекомбинантной субъединичной вакцины NetB

Эффективность рекомбинантного белка NetB (SEQ ID NO:2) при доставке в виде субъединичной вакцины тестировали в исследовании с использованием вакцинации.

Исследование с использованием вакцинации 1193-4

Бройлерных кур Ross 308 (Aviagen) вакцинировали 50 мкг рекомбинантного NetB в качестве антигена на дозу в 0,5 мл гидроксида алюминия в качестве адъюванта. Птиц вакцинировали в день 7 и день 14 и заражали в дни 20 и 21 1,5 мл пероральной дозы штамма Clostridium perfringens EHE-NE18. Для увеличения восприимчивости птиц к некротическому энтериту их кормили рационом с высоким содержанием белка, содержащим рыбную муку, во время периода заражения. Птиц подвергали эвтаназии и подвергали аутопсии в день 25 для оценивания в баллах повреждений кишечника вследствие некротического энтерита.

Повреждения оценивали в соответствии со следующей схемой:

0 Нет повреждений

1 Тонкостеночный и рыхлый кишечник

2 Очаговый некроз или изъязвление (1-5 очагов)

3 Очаговый некроз или изъязвление (6-15 очагов)

4 Очаговый некроз или изъязвление (16 или более очагов)

5 Некротические участки длиной 2-3 см

6 Диффузный некроз, типичный для полевых случаев

Результаты

Средние баллы повреждений кур, вакцинированных рекомбинантным антигеном NetB, и кур адъювантного контроля представлены в таблице 3.

Таблица 3 Средний балл поражения кур, вакцинированных рекомбинантным антигеном NetB
Группа	Число птиц	Средний балл поражения	Количество пораженных птиц (нормализованное относительно группы из 10)	Среднее × число (нормализованное относительно группы из 10)
Адъювант в качестве контроля (заражение NE18)	27	1,74	5,93	12,37
Вакцинация NetB (заражение NE18)	18	0,21	2,1	0,46

Статистический анализ балльных оценок повреждения с использованием критерия Манна-Уитни показывает, что различие между вакцинированной NetB группой и группой адъювантного контроля является статистически значимым при доверительности, большей чем 95%.

Пример 9. Вестерн-блот-анализ сывороток из вакцинированных птиц

Сыворотки из вакцинированных кур анализировали Вестерн-блоттингом для определения, продуцируют ли куры сывороточные антитела к белку NetB. 4 мкг рекомбинантного NetB-антигена наносили на лунку в полиакриламидном геле и подвергали электрофорезу на ДСН-ПААГ. Белок переносили на мембрану PVDF Вестерн-блоттингом. Сыворотки из вакцинированных птиц разводили 1:1000 в 5% сепарированном молоке в TBS/0,5% Твин 20 и инкубировали с мембраной при комнатной температуре в течение 1 часа. Мембрану промывали 3 раза TBS/0,5% Твин 20 и затем инкубировали с конъюгированными с HRP козьими антителами против антител кур (KPL; Cat# 14-24-06; Lot# 050860), разведенными 1:10000 в 5% сепарированном молоке в TBS/0,5% Твин 20, в течение 1 часа при комнатной температуре. После инкубирования мембрану промывали 3 раза TBS/0,5% Твин 20. HRP-меченые вторичные антитела детектировали реагентами Вестерн-блоттинга GE Healthcare ECL (Cat# RPN2106) в соответствии с инструкциями изготовителей. Большинство птиц, вакцинированных рекомбинантным NetB, продуцировали сывороточные антитела к белку NetB (фиг.8), что указывало на то, что используемая вакцина была способна индуцировать значительную реакцию на антиген NetB.

Пример 10. Повторение методики вакцинации и заражения

Исследование вакцинации 1219-1

Результаты, полученные в исследовании 1193-4, тестировали на воспроизводимость повторением процедуры вакцинации и заражения с независимо полученной партией рекомбинантного белка NetB. Результаты данного повторения представлены в таблице 4.

Таблица 4 Вакцинированная NetB группа в сравнении с адъювантом в качестве контроля
Группа	Число птиц	Средний балл поражения	Количество пораженных птиц	Среднее × число (нормализованное относительно группы из 10)
Адъювант в качестве контроля (заражение NE18)	9	2,33	7	18,1
Вакцинация NetB (заражение NE18)	11	0,64	3	1,74

Статистический анализ балльных оценок повреждения с использованием критерия Манна-Уитни показывает, что различие между вакцинированной NetB группой и группой адъювантного контроля является статистически значимым при доверительности, большей чем 95%.

Исследование вакцинации 1250-1

С использованием того же самого протокола вакцинации и заражения, который использовали в предыдущих исследованиях, живые массы птиц измеряли при аутопсии. Средняя масса каждого из отрицательного контроля, положительного контроля и NetB-вакцинированных птиц представлена в таблице 5.

Таблица 5 Живая масса NetB-вакцинированных птиц в сравнении с группой положительного контроля
Группа	Число птиц	Средняя масса (г)	Стандартное отклонение (г)
Отрицательный контроль (без заражения)	23	930	105,5
Положительный контроль (заражение NE18)	22	798	107,5
NetB-вакцинированные (заражение NE18)	22	914	85,7

Статистический анализ с использованием непарного t-критерия масс птиц показывает, что различие масс между NetB-вакцинированной группой и группой положительного контроля является статистически значимым при доверительности, большей чем 99% (Р=0,0004685). Вакцинированные птицы были защищены от задержки прироста массы, которая влияет на незащищенных зараженных птиц положительного контроля.

Пример 11. Защитная эффективность альтернативных вакцин на основе NetB

В исследовании вакцинации 1250-1, испытывали ряд альтернативных вакцин. Альтернативными вакцинами были: бактерин плюс NetB; вектор живой E. coli, экспрессирующий NetB; и живой C. perfringens (netB-делетированный). Альтернативные вакцины описаны ниже, и живые массы вакцинированных птиц в сравнении с группой положительного контроля представлены в таблице 6.

Бактерин плюс NetB

Получали ночную культуру штамма C. perfringens EHE-NE18 (400 мл TPG). Культуру центрифугировали и фракции осадка клеток и супернатанта сохраняли. Осадок клеток ресуспендировали в 20 мл забуференного фосфатом раствора, обрабатывали ультразвуком для раскрывания клеток и затем обрабатывали 0,3% формальдегидом. Супернатант концентрировали ультрафильтрацией до объема 20 мл и затем обрабатывали 0,3% формальдегидом. Равные объемы обработанного осадка клеток, супернатанта и растворов адъюванта объединяли и добавляли рекомбинантный белок NetB до конечной концентрации 100 мкг/мл. 0,5 мл приготовленной вакцины использовали подкожно на одну птицу на одну вакцинацию.

Вектор живой E. coli, экспрессирующий NetB

Штамм E. coli CCEC31m (описанный в WO 2007/025333) трансформировали плазмидой, экспрессирующей netB от его нативного промотора. NetB конститутивно экспрессируется из данной плазмиды. Каждой птице вводили перорально дозы 0,5 мл ночной культуры (в бульоне Луриа) в день 2.

Живой C. perfringens (netB-делетированный)

netB-делетированный мутант C. perfringens EHE-NE18 выращивали в жидком тиогликолатном бульоне и 0,5 мл перорально инокулировали 2-дневным птицам.

Таблица 6 Живая масса вакцинированных птиц в сравнении с группой положительного контроля
Группа	Число птиц	Средняя масса (г)	Стандартное отклонение (г)
Бактерин плюс NetB	21	895	97
Вектор живой E. coli, экспрессирующий NetB	23	877	127,5
Живой C. perfringens (netB-делетантный)	23	924	101

Статистический анализ с использованием непарного t-критерия масс птиц показывает, что различие масс между группой, вакцинированной бактерином плюс NetB, и группой положительного контроля является статистически значимым с доверительностью, большей чем 99% (Р=0,003879), различие масс между группой, вакцинированной вектором живой E. coli, экспрессирующим NetB, и группой положительного контроля является статистически значимым с доверительностью, большей чем 95% (Р=0,0217605), и различие масс между группой, вакцинированной живым штаммом C. perfringens с делетированным геном netB, и группой положительного контроля является статистически значимым с доверительностью, большей чем 99% (Р=0,0003855). Полученные результаты указывают на то, что все различные вакцины могут защищать птиц от задержки прироста массы, которая наблюдается в невакцинированных зараженных птицах.

Специалистам в данной области будет понятно, что могут быть произведены многочисленные вариации и/или модификации в отношении настоящего изобретения, показанного в конкретных вариантах осуществления, без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения, описанного в общих чертах. Таким образом, варианты осуществления должны рассматриваться во всех отношениях как иллюстративные, а не ограничивающие.

Все обсуждаемые и/или цитируемые публикации включены в данное описание во всей их полноте.

По данной заявке испрашивается приоритет согласно US 60/942858, полное содержание которой включено в данное описание посредством ссылки.

Любое обсуждение документов, актов, материалов, устройств, изделий или т.п., которые было включено в данное описание, служит только цели обеспечения контекста настоящего изобретения. Обсуждение не должно пониматься как признание того, что любой или все из указанных документов образуют часть основы известного уровня техники или обычное общее знание в области, к которой относится настоящее изобретение, которое существовало до даты приоритета каждого пункта формулы изобретения данной заявки.

Источники информации

1. По существу очищенный или рекомбинантный антигенный полипептид, содержащий:
i) аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, при этом полипептид выделяют из Clostridium perfringens, и он имеет токсинную активность,
ii) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40% идентична SEQ ID NO:2, при этом полипептид имеет токсинную активность, или
iii) антигенный фрагмент i) или ii).

2. Полипептид по п.1, где полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:2.

3. Полипептид по п.1, где является анатоксином.

4. Полипептид по п.1, где полипептид представляет собой слитый белок, содержащий по меньшей мере одну другую полипептидную последовательность.

5. Выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий антигенный полипептид, где полинуклеотид содержит:
i) последовательность нуклеотидов, представленную в SEQ ID NO:1, при этом полинуклеотид выделяют из Clostridium perfringens, и он кодирует полипептид, имеющий токсинную активность,
ii) последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид по любому из пп.1-4,
iii) последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 40% идентична SEQ ID NO:1 и кодирует полипептид, который имеет токсинную активность, и/или
iv) последовательность, которая гибридизуется с любой из i)-iii) в строгих условиях, или ее обращенный комплемент.

6. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п.5.

7. Вектор экспрессии по п.6, где полинуклеотид функционально связан с промотором.

8. Вектор экспрессии по п.6 или 7, который является вирусным вектором или плазмидным вектором.

9. Клетка-хозяин, экспрессирующая полипептид по любому из пп.1-4, при этом клетка-хозяин содержит полинуклеотид по п.5 или вектор экспрессии по любому из пп.6-8.

10. Клетка-хозяин по п.9, которая представляет собой бактерию.

11. Клетка-хозяин по п.10, где бактерией является Е.coli.

12. Способ получения полипептида по любому из пп.1-4, предусматривающий культивирование клетки-хозяина по п.9 или 11, или вектора по любому из пп.6-8, кодирующего указанный полипептид, в условиях, которые допускают экспрессию полинуклеотида, кодирующего данный полипептид.

13. Способ по п.12, дополнительно предусматривающий выделение указанного полипептида.

14. По существу очищенное антитело, которое специфически связывается с полипептидом по любому из пп.1-4.

15. Иммуногенная композиция, содержащая полипептид по любому из пп.1-4 для получения иммунного ответа у субъекта, где при введении субъекту получают иммунный ответ к полипептиду.

16. Иммуногенная композиция по п.15, дополнительно содержащая адъювант и/или фармацевтически приемлемый носитель.

17. Вакцина, содержащая антиген для получения иммунного ответа у субъекта, где антиген содержит полипептид по любому из пп.1-4, и где при введении субъекту получают иммунный ответ к антигену.

18. Вакцина по п.17, дополнительно содержащая адъювант и/или фармацевтически приемлемый носитель.

19. ДНК-вакцина, содержащая полинуклеотид, кодирующий полипептид по любому из пп.1-4, для получения иммунного ответа у субъекта, где после введения субъекту полипептид экспрессируется, и получают иммунный ответ к данному полипептиду.

20. Способ индуцирования иммунного ответа у субъекта, предусматривающий введение данному субъекту полипептида по любому из пп.1-4, полинуклеотида по п.5, вектора по любому из пп.6-8, клетки-хозяина по любому из пп.9-11, композиции по п.15 или 16 или вакцины по любому из пп.17-19, где при введении субъекту индуцируется иммунный ответ к полипептиду по любому из пп.1-4.

21. Способ по п.20, где клетка-хозяин является живой.

22. Способ по п.20 или 21, где указанные полипептид, полинуклеотид, композиция, вектор, клетка-хозяин доставляются in ovo.

23. Способ определения, подвергался ли субъект воздействию патогена, который экспрессирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40% идентична SEQ ID NO:2, предусматривающий определение присутствия или отсутствия данного полипептида в образце, полученном у данного субъекта, где присутствие данного полипептида является показателем воздействия данного патогена.

24. Способ определения, подвергался ли субъект воздействию патогена, который экспрессирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40% идентична SEQ ID NO:2, предусматривающий определение присутствия или отсутствия антител в данном образце, которые связываются специфически с полипептидом по любому из пп.1-4, где присутствие антител является показателем воздействия данного патогена.

25. Способ определения, подвергался ли субъект воздействию патогена, который экспрессирует полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 40% идентична SEQ ID NO:1, предусматривающий определение присутствия или отсутствия данного полинуклеотида в образце, полученном у данного субъекта, где присутствие данного полинуклеотида является показателем воздействия данного патогена.

26. Способ по любому из пп.20-25, где субъектом является птица.

27. Способ по п.26, где субъектом является домашняя птица.

28. Способ по п.27, где субъектом является курица.

29. Способ скрининга агониста или антагониста, который модулирует активность полипептида по п.1, предусматривающий контактирование полипептида по любому из пп.1-4 с соединением-кандидатом и определение, увеличивает или уменьшает указанное соединение токсинную активность полипептида по п.1.

30. Способ тестирования образца на токсинную активность, предусматривающий:
(a) разделение образца, в котором подозревают присутствие полипептида по любому из пп.1-4, по меньшей мере на первую и вторую части образца,
(b) контактирование первой части образца с антителом по п.14 и
(c) определение, обладают ли первая и вторая части образца токсинной активностью,
где отсутствие токсинной активности в первой части образца и присутствие токсинной активности во второй части образца является показателем присутствия полипептида, который по меньшей мере на 40% идентичен SEQ ID NO:2.

31. Способ по п.30, где стадия (c) предусматривает независимо инкубирование первой и второй частей образца с клетками животного, в условиях и в течение периода времени, достаточных для проявления цитопатического действия полипептида, и определение присутствия или отсутствия цитопатического действия на данные клетки.

32. Применение корма, содержащего антитело по п.14 для уменьшения инфицирования и/или колонизации животного бактерией, которая экспрессирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40% идентична SEQ ID NO:2.

33. Применение напитка, содержащего антитело по п.14, для уменьшения инфицирования и/или колонизации животного бактерией, которая экспрессирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40% идентична SEQ ID NO:2.

34. Трансгенное растение, содержащее экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид по любому из пп.1-4.

35. Корм, содержащий полипептид по любому из пп.1-4 для кормления животного для предупреждения заболевания, вызванного бактериями, экспрессирующими полипептид по пп.1-4.

36. Напиток, содержащий полипептид по любому из пп.1-4 для введения животному для предупреждения заболевания, вызванного бактериями, экспрессирующими полипептид по пп.1-4.

37. Способ индуцирования иммунного ответа против полипептида по любому из пп.1-4 у субъекта, предусматривающий пероральное введение данному субъекту трансгенного растения по п.34, корма по п.35 и/или напитка по п.36.

38. Способ обеспечения пассивного иммунитета у потомства самок птиц, предусматривающий введение полипептида по любому из пп.1-4, полинуклеотида по п.5, вектора по любому из пп.6-8, клетки-хозяина по любому из пп.9-11, композиции по п.15 или 16, вакцины по любому из пп.17-19, трансгенного растения по п.34, корма по п.35 и/или напитка по п.36 самке птицы перед откладыванием яиц самкой птицы, содержащих потомство, в результате чего данное потомство обеспечивается пассивным иммунитетом в отношении бактерий, которые экспрессирует полипептид по любому из пп.1-4.

39. Применение полипептида по любому из пп.1-4, полинуклеотида по п.5, вектора по любому из пп.6-8, клетки-хозяина по любому из пп.9-11, композиции по п.15 или 16, вакцины по любому из пп.17-19, трансгенного растения по п.34, корма по п.35 и/или напитка по п.36 в производстве лекарственного средства для индуцирования иммунного ответа к полипептиду по любому из пп.1-4 у субъекта.

40. Применение полипептида по любому из пп.1-4, полинуклеотида по п.5, вектора по любому из пп.6-8, клетки-хозяина по любому из пп.9-11, композиции по п.15 или 16, вакцины по любому из пп.17-19, трансгенного растения по п.34, корма по п.35 и/или напитка по п.36 в качестве лекарственного средства для индуцирования иммунного ответа к полипептиду по любому из пп.1-4 у субъекта.