Препарат для профилактики и лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта "токсибиовит"

Изобретение относится к области ветеринарии. Препарат предназначен для профилактики и лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта. Препарат (% масс.): стерилизованная культуральная жидкость Bacillus subtilis 3/28 ВКПМ В-3679 - 10,0-15,0; стерилизованная культуральная жидкость Bacillus licheniformis Л-34 ВКПМВ-4161 - 10,0-15,0; стерилизованная культуральная жидкость Halobacterium halobium - 10,0-15,0; глауконит - 50,0-55,0; клеточные оболочки штамма пивных дрожжей Saccharomyces cerevisiae - 5,0-15,0; стеарат кальция - 0,5-2,0. Использование препарата снижает выраженность диспептических расстройств, улучшает кишечное пищеварение, эффективно гармонизирует состав кишечного микробиоценоза, оказывает иммуномодулирующее действие. 1 з.п. ф-лы, 13 табл., 5 пр.

 

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к препаратам для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) на основе пребиотиков и может быть также использовано в медицине, прикладной биотехнологии, пищевой промышленности и смежных отраслях.

В настоящее время для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта предполагается вводить в организм перорально препараты, содержащие отдельные колонии микроорганизмов, в частности биопрепараты на основе молочнокислых микроорганизмов (ЕР 0097484, 1984; ЕР 0043962, 1980; US 4289888, 1979). Препараты, как правило, содержат клетки бактерий, остатки культуральной жидкости (КЖ), жиры, белки, лактозу, камедь и другие добавки. Составы композиций определяются особенностями используемых микроорганизмов и характером поставленной задачи.

Так, известны препараты на основе ацидофильных микроорганизмов (RU 2064269, 1994; SU 1227145, 1983; RU 2080795, 1997), содержащие клетки бактерий и остатки культуральной жидкости (КЖ) с некоторыми добавками, улучшающими его эксплуатационные характеристики (желатин, сахарозу, обезжиренное молоко), а также воду.

Недостатком таких препаратов является их относительно невысокая биологическая активность, связанная с процессом дезактивации живых микроорганизмов при их прохождении через верхние отделы ЖКТ (желудок, двенадцатиперстная кишка), а также отсутствие стабильности их биологических свойств при длительном хранении, что ведет к снижению эффективности лечебно-профилактических процедур.

Более стабильными при хранении являются препараты, содержащие в качестве активного начала спорообразующие бактерии и продукты метаболизма.

Известен лечебно-профилактический биопрепарат Бактиспорин для лечения широкого круга заболеваний, содержащий лиофильно высушенную биомассу штамма Bacillus subtilis 3Н и защитную среду на основе сахарозо-желатиновой смеси или лактозы (RU 2130316, 1999).

Однако биопрепарат Бактиспорин не эффективен против ряда возбудителей острых кишечных инфекций, например, вызываемых бактериями рода Pseudomonas spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., не обладает антиоксидантной и ионообменной активностью.

Наиболее близким из аналогов по технической сущности и заявляемому эффекту является препарат «Бактистатин» (RU №2287335, 2005), содержащий метаболиты микроорганизма Bacillus subtilis в композиции с цеолитом, защитной и питательной средой, которые обеспечивают защиту метаболитов к действию ферментов желудочно-кишечного тракта.

Недостатком препарата является использование в его составе только метаболитов одного вида микроорганизмов, что обуславливает низкое содержание протеолитических ферментов, отсутствие антиоксидантной активности и бедный микроэлементный состав, что затрудняет его использование в эффективной комплексной терапии заболеваний ЖКТ и повышении естественной резистентности организма, исключает его использование для антиоксидантной защиты при терапии со многими антибиотиками.

Задачей, решаемой авторами, является создание более эффективного и стабильного препарата для лечения заболеваний ЖКТ, в частности, при совместном применении с антибиотиками.

Указанная задача решается путем введения в организм веществ, тормозящих развитие патогенной микрофлоры, стимулирующих ферментную активность и антиоксидантную защиту, а также обладающих широким спектром микроэлементов и стимулирующих развитие полезных микроорганизмов, а именно метаболитов микроорганизмов Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Halobacterium halobium, иммобилизованных на активном носителе, представляющем собой смесь глауконита с клеточными оболочками пивных дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Клеточная стенка пивных дрожжей представляет собой твердый глюкановый слой, поверхность которого покрыта маннопротеином, чередующимся с глюканом и проникающим в периплазматическое пространство, и состоит на 30 % из маннанов, 30 % глюканов, 12 % протеинов и витаминов группы В. Причем для маннанового комплекса клеточных оболочек дрожжей пропорция компонентов по отношению друг к другу примерно одинакова и присуща практически всем штаммам.

Как показали проведенные эксперименты, клеточная оболочка обладает мощной способностью антигенной стимуляции и устойчива к пищеварительной кислотности. Именно эта способность проходить через весь пищеварительный тракт, целиком сохраняясь, придает заявляемой композиции повышенную биологическую активность, в результате чего в ЖКТ происходит торможение патогенной микрофлоры, обогащение провитамином А, амило- и протеолитическими ферментами, активация иммунитета и эффективный ионообмен с поглощением токсичных продуктов клеточными оболочками и молекулами адсорбента глауконита, и тем самым обеспечивается бесконкурентная жизнедеятельность и восстановление полезной микрофлоры и восстановление естественных метаболических процессов организма.

Технический результат достигался созданием препарата, содержащего метаболиты стерилизованные жидкостей, полученных в результате культивирования и стерилизации штамма Bacillus subtilis 3/28 ВКПМ В-3679, штамма Bacillus licheni-formis Л-34 ВКПМ В-4161 и Halobacteriuin halobium, и носитель - смесь глауконита с клеточными оболочками штамма пивных дрожжей Saccharomyces cerevisiae при следующем соотношении ингредиентов (% масс.):

стерилизованная культуральная жидкость
Bacillus subtilis 3/28 ВКПМ В-3679	10,0-15,0
стерилизованная культуральная жидкость
Bacillus licheniformis Л-34 ВКПМ В-4161	10,0-15,0
стерилизованная культуральная жидкость
Halobacterium halobium	10,0-15,0
глауконит	50,0-55,0
клеточные оболочки штамма пивных
дрожжей Saccharomyces cerevisiae	5,0-15,0
стеарат кальция (аэросил)	0,5-2,0

Оптимальный состав препарата, получившего условное наименование «ТоксиБиоВит» (заявка на ТЗ направлена заявителем в Роспатент):

стерилизованная культуральная жидкость
Bacillus subtilis 3/28 ВКПМ В-3679	12,0
стерилизованная культуральная жидкость
Bacillus licheniformis Л-34 ВКПМ В-4161	12,0
стерилизованная культуральная жидкость
Halobacterium halobium	12,0
глауконит	53,0
клеточные оболочки штамма пивных
дрожжей Saccharomyces cerevisiae	10,0
стеарат кальция (аэросил)	1,0

Небольшие вариации состава в рамках заявляемого интервала не оказывают существенное влияние на комплексное воздействие препарата на организм, изменяя спектр данного воздействия.

Действие препарата базируется на выделении в полость кишечника иммобилизованных на частицах глауконита метаболитов и иных компонентов препарата. При этом вокруг частиц глауконита формируются образования мицеллярной структуры, которые в процессе движения по ЖКТ постепенно высвобождаются с пористой поверхности глауконита. С одной стороны, это позволяет поддерживать в ЖКТ активность биологических компонентов препарата, диффузию антиоксидантов и ионообмен не менее суток, что необходимо для восстановления и стимуляции функциональной активности нормальной микрофлоры кишечника. С другой стороны, эффект постепенного высвобождения с поверхности глауконита компонентов препарата приводит к появлению открытых поверхностей его пористой структуры, что обеспечивает включение механизмов ионного обмена и избирательной сорбции токсичных соединений как молекулами глауконита, так и клеточными оболочками галобактерий, что особенно важно для общей детоксикации организма.

Роль и значение отдельных ингредиентов, входящих в препарат, можно определить следующим образом.

Культуральные среды Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, получаемые при глубинном выращивании, содержат уникальный набор биологически активных соединений как молекулами глауконита, так и клеточными оболочками галобактерий, что особенно важно для общей детоксикации организма.

Роль и значение отдельных ингредиентов, входящих в препарат, можно определить следующим образом.

Культуральные среды Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, получаемые при глубинном выращивании, содержат уникальный набор биологически активных компонентов, вырабатываемых в процессе жизнедеятельности. Среди них широко представлены различные природные антибактериальные субстанции (бактериоцины, лизоцим, каталазы), которые селективно подавляют рост и размножение патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в кишечнике, не влияя при этом на симбионтную микрофлору. Кроме того, микроорганизмы вырабатывают различные ферменты и коферменты, аминокислоты, полипептиды, пребиотические компоненты, способствующие улучшению микроэкологических условий в кишечнике, влияющие на обменные процессы и оказывающие иммуномодулирующее действие.

В таблице 1 представлены результаты хроматографического анализа по определению содержания некоторых веществ в культуральной жидкости после удаления биомассы на примере штамма Bacillus subtilis 3/28 ВКПМ В-3679.

Таблица 1
Состав стерилизованной культуральной жидкости В. subtilis 3/28 ВКПМ В-3679
Наименование анализируемых показателей	Фугат В. subtilis
Остаточная концентрация микроба-продуцента, КОЕ/мл	0
Содержание белка*, мкг/см-3	550,5
Протеолитическая активность (ПА), ед. ПА, дм-3	8,1
Амилолитическая активность (АА), ед. АА, дм-3	44,8
Суммарная концентрация общих аминокислот, мкг/см-3	569,9
Суммарная концентрация свободных аминокислот, мкг/см-3	67,3
Концентрация гексозаминов, мкг/см-3	105,4
Концентрация глюкозаминов, мкг/см-3	96,3
Концентрация диаминопимелиновой кислоты, мкг/см-3	20,6
Концентрация свободного глюкозамина, мкг/см-3	7,5
Концентрация аденина / Ха**, мкг/см-3	12,4/3,3
Концентрация гуанина / Хг**, мкг/см-3	0/16,5
Концентрация тимина / Хт**, мкг/см-3	8,7/0
Концентрация урацила / Ху**, мкг/см-3	12,1/8,4
Концентрация цитозина / Хц**, мкг/см-3	0/12,6
Примечания:
*содержание белка определяли по методу Лоури;
**Ха, Хг, Хт, Ху, Хц - неидентифицированные производные аденина, гуанина, тимина, урацила и цитозина в пересчете на основное вещество.

Результаты хроматографического анализа показывали значительное содержание в стерилизованной культуральной жидкости азотистых оснований и их производных, которые обладают иммуномодулирующими свойствами и повышают функциональную активность единой макрофагальной системы организма при различных стадиях инфекционного процесса.

В таблице 2 представлены результаты анализа по определению содержания некоторых веществ в культуральной жидкости после удаления биомассы на примере штамма Bacillus subtilis 3/28 ВКПМ В-3679.

Таблица 2
Состав культуральной жидкости Bacillis licheniformis Л-34, ВКПМ В-4161
Наименование анализируемых показателей	Фугат
Остаточная концентрация микроба-продуцента, КОЕ/мл	0
Содержание белка*, мкг/см-3	552,3
Протеолитическая активность (ПА), ед. ПА, дм-3	24,8
Суммарная концентрация общих аминокислот, мкг/см-3	571,9
Суммарная концентрация свободных аминокислот, мкг/см-3	65,6

Известно, что метаболиты некоторых микроорганизмов, в частности Escherichia coli (E.coli), полученные из клеток микроорганизмов, помещенных в дистиллированную воду на 5-9 суток (RU 1638156, 1991) способны тормозить рост патогенной микрофлоры и стимулировать развитие нормальной микрофлоры желудка.

Авторами было установлено, что подобным воздействием обладают и метаболиты Bacillus subtilis. Лучшие результаты были получены при использовании для этих целей метаболитов штаммов Bacillus subtilis 3/28 ВКПМ В-3679 и В.licheniformis Л-34 ВКПМ В-4161 (штаммы депонированы в Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов 07.03.2012 по д № ВКПМ В-3679 и В-4161 - справки о депонировании прилагаются).

Использование метаболитов штамма В.subtilis ВКПМ В-3679 характеризуется следующими показателями зон задержки роста тест-культуры (мм):

Shigella sonnei - 17-22

Salmonella typhimarium - 21-25

S.stenly - 13-17

S.reading - 14-18

S.derby - 15-18

Staphylococcus aureus - 22-27

Pseudomonas fluoresocens - 8-10

Pseudomonas vulgaris - 10-12

Pseudomonas aeruginose - 7-9

Proteus vulgaris - 12-14

Klebsiella pheumoniae - 13-15

Candida albicans - 25-32

С.tropicalis - 22-26

Использование метаболитов штамма В.licheniformis 4161 характеризуется следующими показателями зон задержки роста тест-культуры (мм):

Shigella sonnei - 22-27

Salmonella typhimurim - 26-30

S.stenly - 18-22

S.reading - 19-23

S.derby - 20-23

Stapgylococcus aureus - 27-33

Pseudomonas aeruginose - 12-15

Proteus vulgaris - 17-19

Klebsiella pneumoniae - 18-20

Candida albicans - 30-34

С.tropicalis -27-31.

Оптимальная концентрация в смеси стерилизованных культуральных жидкостей

Bacillus subtilis 3/28 ВКПМ В-3679 и Bacillus lichemformis Л-34 ВКПМВ-4161 - по 12% масс.

Снижение их концентрации менее 10% масс. резко снижает антибактериальный эффект. Повышение концентрации более чем 15% масс. практически не влияет на свойства препарата, но повышает возможность разрушения метаболитов в желудке, т.к. в этом случае иммобилизация метаболитов на носителе осуществляется не в полном объеме.

Отличительное свойство галобактерий Halobacterium halobium - наличие в них бактериородопсина, сложного молекулярного комплекса, состоящего из белка бактериородопсина и ретиналя (вещество, которое содержится в сетчатке глаза человека). Кроме бактериородопсина, о котором уже шла речь, клетки галобактерий синтезируют белки, нуклеиновые кислоты, каротиноиды (такие, как ксантофиллы, бактериоруберин, бета-каротин), липиды (фосфатидилглицерофосфат, фосфатидилглицеросульфат), глицерин, кардиолипин, гликолипиды, гликопротеины, а также витамины А, Е, С, бета-каротин, В1, В2, В3, В6, Н, PP. Кроме того, в клетках галобактерий были обнаружены сквалены, производные гераниевого масла, бактериоруберины, ликопин (каротеноид, обладающий большей антиоксидантной активностью, чем бета-каротин).

Стерилизованная культуральная жидкость Halobacterium halobium, высушенная методом сублимации, содержит от 0,05 до 0, 20 мг/г общей суммы каротиноидов. Выделяемые каротиноиды работают как ловушки свободных радикалов, повышают иммунный статус, улучшают состояние кожи, благотворно влияют на зрение. Бетаины и эктоины галобактерий способны защищать биологические молекулы и живые клетки от экстремальных воздействий (замораживания/размораживания, высушивания, нагревания).

Антиоксидантную активность стерилизованной культуральной жидкости Halobacterium halobium оцененивали по его действию на растертую ткань печени мышей, результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3
Антиоксидантная активность культуральной жидкости Halobacterium halobium
Наименование объекта	Антиоксидантная активность, у.е./мг
Культуральная жидкость Halobacterium halobium	5-11
Альфа-токоферол	2

Оптимальная концентрация в смеси стерилизованной культуральной жидкости Halobacterium halobium - 12% масс.

Снижение ее концентрации менее 10% масс. существенно снижает антиоксидантное действие препарата. Повышение концентрации более чем 15% масс. практически не влияет на свойства препарата, но повышает возможность разрушения метаболитов в желудке, т.к. в этом случае иммобилизация метаболитов на носителе осуществляется не в полном объеме.

В качестве составной части носителя-адсорбента использовали глауконит - природный минерал Каринского месторождения Челябинской области, разрешенного к применению без ограничений в пищевой, медицинской и ветеринарной практике.

Глауконит обеспечивает транспортировку метаболитов в оптимальном режиме и постепенное высвобождение иммобилизованных на нем биологически активных веществ, что позволяет не менее суток поддерживать уровень активности препарата. Вместе с тем, он обеспечивает связывание и выведение низкомолекулярных токсинов (метан, сероводород, аммиак и др.), тяжелых металлов и радионуклидов. Кроме того, проходя через желудочно-кишечный тракт, глауконит участвует в селективном ионообмене (снимает или уменьшает негативное влияние на организм ионов алюминия, синергически взаимодействует с магнием и фтором, является дополнительным источником микроэлементов). Глауконит как источник кремния принимает участие в реакциях, обеспечивающих синтез коллагена, придает упругость волокнистым тканям; участвует в ингибировании сукцинатдегидрогеназы, эстеразы, гиалуронидазы, ускоряет синтез иролина, гликозаминогликанов; имеет особое значение для формирования структуры кожи, волос, ногтей.

Количество глауконита должно быть достаточно для полной иммобилизации метаболитов. Оптимальное количество глауконита - 53% масс. Снижение его концентрации менее чем до 50% не обеспечивает полной сорбции метаболитов и снижает эффективность препарата. Повышение концентрации глауконита более 55% снижает удельное количество сорбируемых метаболитов и соответственно эффективность воздействия метаболитов на патогенные микроорганизмы.

Комбинация клеточных стенок дрожжей с метаболитами спорообразующих микроорганизмов, иммобилизованных на природных энтеросорбентах типа глауконита, значительно расширяет спектр сорбционных и иммуногенных свойств и способов применения как в комбинации с антибиотиками, так и в роли самостоятельных препаратов для медицины и ветеринарии.

Воздействие на организм оказывают как цельные оболочки дрожжевых клеток, так и составляющие их компоненты: сами полисахариды и их конъюгаты с белком. Итак, маннановый комплекс оболочек проявляет высокую противоопухолевую активность. Так, введение маннанов дрожжей подавляет рост мышиной саркомы 180 на 65-90%, вызывает полную регрессию карциномы молочной железы мышей ММ46. У излеченных мышей наблюдается специфическая противоопухолевая резистентность.

Дрожжевые маннаны клеточных стенок наряду с противоопухолевым действием являются довольно эффективными противовирусными и бактерицидными препаратами. Так, известно, что они подавляют in vivo рост вируса табачной мозаики, развитие некрозов на листьях табака, тормозят рост Х-вируса картофеля.

Одна из сторон воздействия олигосахаридов маннанового комплекса - способность лимитировать колонизацию кишечных стенок некоторыми штаммами, признанными патогенными. Это связано с тем, что бактерии имеют лектины (протеины или гликопротеины) или волоконца, которые выявляют некоторые специфические сахара и позволяют клеткам их зацепить. Подобные сахара часто находятся на поверхности клетки пищеварительного эпителия. Фиксация таких бактерий, как Salmonella, E.Coli, Vibrio Cholera, на клетках кишечника может быть объяснена участием маннозспецифичной лектиноподобной субстанции, находящейся на поверхности этих бактерий.

Опыты позволили выявить, что патогены прикрепляются предпочтительно к маннан-олигосахаридам, включенным в пищу или корм, существенно сокращая тем самым количество бактерий, закрепляющихся на поверхности клеток кишечника, а поскольку маннановый комплекс не разрушается пищеварительными энзимами, он может закрепиться на пектинах патогенных бактерий, тем самым предупредит колонизацию ими пищеварительного тракта. В этом случае он воздействует как "челнок", увозящий на борту некоторые штаммы патогенных бактерий, помогая, таким образом, полезной нормофлоре, и вместе с тем маннановая композиция не может служить субстратом для большого числа патогенов, так как в общем и целом большинство штаммов патогенных бактерий не могут использовать сахар, присутствующий в маннан-олигосахаридах как источник энергии, обеспечивающий их рост, и напротив, полезные бактерии могут им стимулироваться.

Патогенные для человека и животных дрожжи С.albicans в опытах in vitro хорошо прилипают к препарату. Препарат способствует эпителиальным клеткам сорбировать и инактивировать болезнетворные микробы, что способствует проявлению терапевтического действия при экспериментальном перитоните и сепсисе, вызванном Е.coli, С.albicans и Leishmania donovani.

Стеарат кальция (аэросил) выступает в качестве скользящего вещества и структурообразователя при изготовлении капсул и таблеток препарата. Одновременно он обладает антистрессовым, антиоксидантным эффектом, присутствие соли кальция обеспечивает улучшение состояния костной системы, улучшает деятельность нервной системы.

Лучшие результаты были получены при использовании композиции выше приведенного состава с содержанием стеарата кальция 1%. Снижение концентрации менее 0,5% масс. понижает механические свойства таблетированного препарата. Повышение концентрации более 2% не влияет на свойства препарата и экономически нецелесообразно.

Препарат может выпускаться в виде порошка, таблеток, эмульсии, капсул. Показания к применению препарата

1. Дисбактериоз различного генеза:

- при хронических заболеваниях пищеварительного тракта (синдром раздраженного кишечника, гастриты, дуодениты, язвенная болезнь, глютеновая энтеропатия, ферментопатии, дисфункции желчевыводящих путей);

- после перенесенных острых кишечных инфекций;

- при хронических заболеваниях пищеварительного тракта (синдром раздраженного кишечника, гастриты, дуодениты, язвенная болезнь, глютеновая энтеропатия, ферментопатии, дисфункции желчевыводящих путей);

- после перенесенных острых кишечных инфекций;

- после приема антибиотиков, после проведения химиотерапии на фоне длительной гормональной терапии;

- на фоне хронических стрессовых состояний;

- на фоне нерациональной диетотерапии.

2. Иммунодефицитные состояния.

3. Профилактика дисбиотических расстройств при инфекционных и вирусных заболеваниях.

4. Неалкогольный и алкогольный стеатогепатоз, стеатогепатит.

5. Аллергические заболевания (попинозы, вазомоторный ринит, хроническая крапивница, отек Квинке).

6. Дерматологические заболевания (нейродермит, экзема, псориаз).

7. Профилактика осложнений после оперативных вмешательств в абдоминальной хирургии, травматологии, гинекологии.

При назначении антибиотиков препарат применяют совместно с первого дня антибиотикотерапии и не менее двух недель после ее завершения в целях профилактики развития антибиотикоассоциированной диареи и дисбиоза кишечника.

При пребывании в условиях эколого-профессионального напряжения (неблагоприятные природные и климатические условия) препарат назначают на протяжении всего адаптационного периода.

Препарат полностью совместим со всеми компонентами эрадикационной антихеликобактерной терапии и способствует повышению ее эффективности и безопасности.

Пример 1. Получение заявляемого препарата «ТоксиБиоВит»

Препарат получают следующим образом. Микроорганизмы Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis и Halobacterium halobium выращивают методом глубинного культивирования в ферментерах, имеющих объем 130 л. После окончания процесса культивирования проводят центрифугирование. Культуральную жидкость (КЖ) смешивают 1:1:1 и иммобилизируют на смеси глауконита с клеточными оболочками дрожжей в соотношении 5:1, предварительно измельченных до частиц размером 100 мкм, и стерилизуют автоклавированием в течении 30 мин при 80°С. В полученную стерильную культуральную жидкость (СКЖ) вводят заранее заданные количества стеарата кальция.

Образовавшийся комплекс лиофилизируют или высушивают в вакуум-сушильных аппаратах или напылением на расчетное количество глауконита, фонтанирующее в нагретом до 90°С воздухе, в сушильной установке до достижения остаточной влажности 4-6%, после чего препарат выгружается и расфасовывается. Выход получаемого продукта 200±5 кг.

Пример 2. Изучение воздействия состава заявляемого препарата на ингибирование роста патогенной и условно-патогенной микрофлоры.

В таблице 4 приведены результаты влияния дозы 500 мг препарата, введенной в МПА, на ингибирование роста Sh.sonnei и S.aureus 1479.

Таблица 4
Ингибирование роста микроорганизмов на МПА содержащем 500 мг препарата
Состав препарата, % масс.	Зона угнетения роста Sh.sonnei через 24 ч, мм	Зона угнетения роста S.aureus 1479 через 24 ч, мм
Смесь КЖ	носитель
22	78	16,7	24,2
15	85	13,5	15,3
32	68	16,2	19,8

Представленные результаты показывают, что при введении в МПА 500 мг препарата в следующих соотношениях компонентов: КЖ-12%, носитель - 78%, обеспечивается максимальное ингибирование роста Sh.sonnei (16,7 мм) S.aureus 1479 (24,2 мм). При этом происходит более эффективный выход антибактериальных метаболитов из препарата, который способствует селективному ингибированию роста патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. В дальнейшем исследования проводились на препарате вышеуказанной рецептуры.

Пример 3. Изучение воздействия различных доз препарата «ТоксиБиоВит» на рост нормальной микрофлоры.

Влияние препарата на рост нормальной микрофлоры было исследовано на примере микроорганизмов Escherichia coli M-17. Суточную культуру E.coli М-17 в объеме 0,1 мл вносили в пробирки, содержащие 10 мл мясопептонного бульона (МПБ). Пробирки с МПБ содержали следующие концентрации заявляемого препарата - 0,1 мг/мл; 1,0 мг/мл; 500 мг/мл и 1000 мг/мл. В контрольный ряд пробирок с МПБ также вносили суточную культуру E.coli M-17, но в этих средах концентрация препарата отсутствовала. Посевы культивировали при +37,0°С в течение 24 ч. После культивирования по 0,1 мл МПБ высевали на мясопептонный агар (МПА), на котором через 24 ч проводили учет выросших колоний микроорганизмов и расчеты их концентраций (КОЕ/мл). Концентрации микроорганизмов выражали в виде натурального логарифма (Ln С, КОЕ/мл). Результаты исследования представлены в таблицах 5 и 6.

Представленные результаты свидетельствуют, что при внесении в МПБ дозы препарата 500 мг/мл происходит достоверная стимуляция роста E.coli М-17. По сравнению с контрольными значениями концентраций микроорганизмов эффект увеличения их количества составляет 30%. Это позволяет считать, что для эффективной стимуляции и восстановления нормальной микрофлоры ЖКТ оптимальная доза заявляемой композиции препарата находится в диапазоне 400-600 мг,

Пример 4. На стабильность изучено 9 экспериментальных серий препарата, полученного тремя способами. Как показывают полученные результаты, после хранения препарата при комнатной температуре на протяжении 24 месяцев показатели ферментативной активности препаратов не изменились ни в одной партии.

Таблица 7
Стабильность ТоксиБиоВита, полученного различными способами высушивания
Способ высушивания	Показатели протеолитической (П), амилолитической (АА) и антиоксидантной (А) активности препарата в процессе хранения, у.е./мг
	6 мес.	12 мес.	18 мес.	24 мес.
П	АА	А	П	АА	А	П	АА	А	П	АА	А
Сублимация	3,5	4,0	10,0	3,5	4,0	10,0	3,5	4,0	10,0	3,5	4,0	10,0
Капиллярно-химическое обезвоживание	3,7	4,1	11,0	3,5	4,1	11,0	3,3	4,0	10,0	3,3	4,0	10,0
Вакуум-сушильный шкаф	3,5	4,2	10,5	3,2	4,0	10,5	3,1	4,0	10,3	3,0	4,0	10,1

Пример 5. Для оценки терапевтической эффективности препарата для новорожденных телят-аналогов 2-5-дневного возраста, у которых отмечались признаки диареи (проффузный понос, каловые массы с неприятным запахом, угнетенное состояние, отказ от корма), были сформированы 5 опытных групп, животные которых получали препарат в различных дозах 2 раза в день в течение 6 дней, и 2 контрольные группы.

Так как препарат в минимальных дозах не обладал достаточной профилактической эффективностью, мы сочли возможным начать испытание лечебной активности препарата с дозы 1 г, считая дозы в 0,3 и 0,5 г недостаточными для лечения больных телят.

Телята I контрольной группы получали бифидумбактерин, согласно наставления, по 1 дозе 3 раза в день в течение 3 дней, животных II контрольной группы лечили антибиотиками тетрациклинового ряда и другими препаратами. За телятами вели наблюдение в течение 14 дней с начала постановки опыта.

Результаты исследования терапевтической эффективности препарата представлены в таблице 8.

Таблица 8
Терапевтическая эффективность различных доз препарата при желудочно-кишечных болезнях телят
Группы животных	Кол-во животных	Доза (г/гол) и кратность	Продолжительность курса, дн.	Выздоровело	Длительность заболевания, ДН.	Терап. эффекность, %
I опытная	10	1,0×2	6	10	100	6-7	100
II опытная	10	1,5×2	6	10	100	5-6	100
III опытная	10	2,0×2	6	10	100	5	100
IV опытная	12	2,5×2	6	12	100	4-5	100
V опытная	14	3,0×2	6	14	100	4-5	100
I контрольная	10	1д×3	3	7	70	6-7	70
II контрольная	18	-	-	9	50	7-9	50

Клинический контроль за телятами опытных групп показал, что терапевтическая эффективность препарата составила 100% во всех опытных группах.

Заболевание у телят опытных групп протекало в более легкой, чем у контрольных животных, форме и длительность его составила от 4 до 7 дней, тогда как в I и II контрольной группах длительность болезни составила 6-7 и 7-9 дней соответственно.

В I контрольной группе, где телята получали бифидумбактерин, число выздоровевших животных составило 7 голов (70%), длительность заболевания равнялась 6-7 дней, что было на 1-2 дня продолжительнее, чем у телят опытных групп.

Во II контрольной группе, где телят лечили антибиотиками, выздоровело 9 голов из 18, что составило 50%.

Заболевание у телят этой группы протекало в более тяжелой форме, продолжительность болезни равнялась 7-9 дням, что на 2-4 дня больше, чем у телят опытных групп.

После окончания эксперимента телята были вялыми, плохо поедали и усваивали корм, имели тусклый шерстный покров и отставали в росте.

Вывод: терапевтическая эффективность препарата составляет 100% при даче препарата 2 раза в день в течение 6 дней в дозе 2 г на голову.

Терапевтическая эффективность бифидумбактерина составила 70%.

Помимо клинической характеристики эффективности препарата при лечении желудочно-кишечных болезней телят оценивались в динамике также гематологические показатели.

Результаты гематологических исследований у телят опытных и контрольных групп представлены в таблице 9.

Анализируя данные гематологических исследований телят опытных и контрольных групп, можно сделать следующие выводы.

1. У телят до начала постановки опыта наблюдалась выраженная эозинопения, что говорит, как правило, об острой интоксикации организма.

Таблица 9
Лейкограмма крови у телят опытных и контрольных групп
Периоды исследований	Базофилы	Эозинофилы	Нейтрофилы	Лимфоциты	Моноциты
Ю	П	С
I опытная группа
До дачи препарата	0	4,55	5,05	7,05	39,70	40,0	3,65
На 3 день	0,20	4,10	4,30	6,55	39,0	40,5	4,35
На 7 день	0	6,35	3,15	5,45	39,0	41,5	4,60
На 14 день	0,20	4,45	3,10	4,97	45,05	42,5	4,75
II опытная группа
До дачи препарата	0	4,35	3,95	8,85	40,95	40,65	3,25
На 3 день	0,20	4,10	3,80	6,60	40,75	39,95	4,60
На 7 день	0,20	5,25	3,60	5,55	37,10	40,55	5,75
На 14 день	0,20	4,05	3,05	5,75	36,40	43,45	5,35
III опытная группа
До дачи препарата	0	4,55	4,05	6,75	41,55	40,05	3,05

На 3 день	0,20	4,30	4,25	6,35	40,90	39,90	4,10
На 7 день	0,20	6,05	3,45	6,55	38,15	41,45	5,35
На 14 день	0,25	5,75	3,25	6,75	39,20	42,30	5,95
IV опытная группа
До дачи препарата	0	4,60	3,95	6,75	41,7	39,95	3,05
На 3 день	0	6,05	4,15	5,35	39,85	40,05	4,55
На 7 день	0,20	7,60	4,0	5,45	36,15	41,25	5,35
На 14 день	0	5,15	3,05	5,15	40,05	42,0	4,60
V опытная группа
До дачи препарата	0,20	4,50	3,80	6,15	39,20	42,40	3,75
На 3 день	0,20	5,05	4,35	6,25	38,20	41,95	4,20
На 7 день	0	8,05	3,50	6,05	35,0	40,65	6,75
На 14 день	0	6,80	3,40	5,10	39,0	40,50	6,20
I контрольная группа (с бифидумбактерином)
До постановки опыта	0	4,60	4,95	6,80	39,20	40,50	3,95
На 3 день	0,20	4,40	4,50	5,85	39,50	41,35	4,20
На 7 день	0,20	5,95	3,75	5,60	38,20	42,05	4,25
На 14 день	0,20	5,35	3,20	5,15	37,65	40,25	4,20
II контрольная группа
До постановки опыта	0	4,55	3,75	5,50	40,70	42,35	3,15
На 3 день	0	4,05	3,35	5,05	38,65	44,70	4,20
На 7 день	0,20	4,20	3,25	5,35	35,80	47,25	3,95
На 14 день	0	4,35	3,10	5,25	37,85	45,70	3,80

2. К 7 дню наблюдения у телят опытных групп отмечена тенденция к увеличению количества эозинофилов, но даже к концу эксперимента число эозинофилов было ниже уровня нормы, что, по-видимому, объясняется их разрушением при интенсивном фагоцитозе. Этим же можно объяснить и снижение числа сегментоядерных нейтрофилов. Аналогичная динамика эозинофилов отмечена и у телят I контрольной группы, которые получали бифидумбактерин.

3. В цитоплазме сегментоядерных нейтрофилов и моноцитов обнаруживаются бактериальные включения.

4. У животных II контрольной группы, которых лечили антибиотиками, уровень эозинофилов оставался без изменений и был ниже, чем у животных опытных групп. Это можно объяснить более продолжительной интоксикацией организма, так как телята этой группы болели в два раза дольше, чем телята опытных групп.

5. Длительная моноцитопения при наличии стойкой эозинопении в контрольных группах также свидетельствует о перенесении телятами тяжелой интоксикации.

6. К моменту выздоровления, что соответствовало 7 дню опыта, в лейкограмме животных всех опытных групп установлено повышение числа моноцитов при одновременном увеличении числа эозинофилов, что является хорошим прогностическим признаком.

7. У животных опытных групп, по окончании курса лечения, отмечена нормализация уровня лимфоцитов и нейтрофилов, тогда как во II контрольной группе, по мере развития заболевания, число лимфоцитов возрастало, достигая максимума к 14 дню наблюдения.

Таким образом, использование препарата для лечения телят при желудочно-кишечных болезнях вызывает нормализацию состава крови.

Исследования по изучению динамики сывороточных иммуноглобулинов М и G у телят опытных и контрольных групп в разные дни исследований представлены табл.10.

Таблица 10
Динамика сывороточных иммуноглобулинов М и G у телят опытных и контрольных групп
Периоды исследований	Иммуноглобулины
IgM	IgG
I опытная группа
До дачи препарата	3,93±0,25	19,55±1,75
На 3 день	2,93±0,15	19,23±1,50
На 7 день	3,01±0,11	19,87±2,35
На 14 день	2,05±0,15	19,96±2,05
II опытная группа
До дачи препарата	3,34±0,10	18,05±2,35
На 3 день	2,96±0,13	19,45±2,15
На 7 день	2,15±0,15	20,37±2,11
На 14 день	2,05±0,11	20,65±1,17
III опытная группа
До дачи препарата	3,95±0,07	18,98±2,05
На 3 день	2,85±0,15	19,55±3,05
На 7 день	2,05±0,10	19,75±1,55
На 14 день	2,01±0,11	20,96±2,05
IV опытная группа
До дачи препарата	3,05±0,15	19,31±1,75
На 3 день	3,90±0,11	17,35±2,15
На 7 день	2,45±0,09	19,25±2,05
На 14 день	2,45±0,25	20,45±3,15
V опытная лечебная группа
До дачи препарата	3,91±0,08	17,70±3,05
На 3 день	3,05±0,10	19,35±1,05
На 7 день	2,46±0,15	19,15±2,50
На 14 день	2,40±0,11	20,40±1,75
I контрольная группа
До постановки опыта	3,85±0,13	18,01±1,75
На 3 день	2,95±0,21	19,35±2,05
На 7 день	2,15±0,09	19,55±1,50
На 14 день	2,05±0,20	21,05±1,35
II контрольная группа
До постановки опыта	3,90±0,10	17,30±2,05
На 3 день	2,87±0,15	17,45±3,05
На 7 день	2,85±0,09	18,10±2,15
На 14 день	2,15±0,10	18,70±1,45

Анализируя динамику показателей иммуноглобулинов классов М и G у больных телят по сравнению с нормативными показателями для данного возраста, следует отметить, что уровень иммуноглобулинов М у больных животных был достоверно выше, по сравнению со здоровыми.

Более высокий уровень Ig M у больных телят всех групп (до начала постановки опыта), по сравнению со здоровыми (после лечения), объясняется постоянным антигенным раздражением, следовательно, организм на заражение реагирует повышением уровня сывороточных Ig М. Снижение к 7 дню эксперимента уровня Ig М объясняется активизацией процессов фагоцитоза, который непосредственно коррелирует с содержанием Ig М в сыворотке крови. К 14 дню эксперимента показатели иммуноглобулина М у телят всех групп были близки к норме.

У всех животных опытных и I контрольной групп содержание Ig G до начала опыта было ниже нормы, а к 14 дню наблюдения отмечена тенденция к повышению уровня Ig G.

Во II контрольной группе уровень Ig G оставался ниже нормативных показателей во все дни исследования. Это согласуется с клиническими показателями, так как у телят этой группы заболевание протекало в более тяжелой форме и более длительный период.

Определение биохимических показателей сыворотки крови телят проводили в динамике по общепринятым методикам (табл.11).

Исследованиями были выявлены определенные закономерности изменений биохимических показателей крови телят опытных и контрольных групп. У телят всех групп до постановки опыта уровень биохимических показателей крови находился на нижней границе нормы и был близок по значению. На 3, 7 и 14 дни исследований у телят опытных групп отмечалось увеличение в сыворотке крови таких показателей, как общий белок и альбумины (на 2-10 г/л и 15-20 г/л соответственно). У телят контрольных групп уровень этих показателей к 14 дню исследований снижался на 25 и 0,8 г/л соответственно в сравнении с периодом до постановки опыта. Остальные биохимические показатели варьировали в разные дни исследований, но оставались в пределах нормы или на нижней границе нормы.

Полученные данные свидетельствуют о том, что препарат способствует повышению уровня общего белка и альбуминов в сыворотке крови новорожденных телят в результате лучшей усвояемости корма и не оказывает негативного воздействия на биохимические показатели крови животных. Уменьшение содержания общего белка и альбуминов в сыворотке крови контрольных животных свидетельствует о нарушениях обмена веществ в организме, плохом усвоении протеина из кормов вследствие расстройства желудочно-кишечного тракта и острых воспалительных процессах.

Варьирование таких показателей, как кальций и фосфор, у животных опытных и контрольных групп зависело от уровня их поступления в организм с кормами.

Определение гормонального фона сыворотки крови телят учитывали по изменению величины кортизола в динамике (табл.12).

Таблица 12
Уровень кортизола (нмоль/л) в сыворотке крови телят опытных и контрольной групп
Группа животных	Период исследований
До дачи препарата	на 3 сутки	на 7 сутки	на 14 сутки
I опытная	25,63±2,3	24,30±2,1	25,62±2,4	28,15±2,2
II опытная	24,79±3,3	28,07±2,3	24,92±3,4	29,12±2,4
III опытная	26,02±2,1	26,52±2,4	24,13±2,1	28,63±3,6
IV опытная	27,08±1,8	27,03±3,3	25,06±0,8	29,15±2,3
V опытная	26,15±3,5	28,12±2,3	26,11±1,2	29,56±2,4
I контрольная	24,35±3,1	29,77±2,4	27,65±1,5	29,59±2,1
II контрольная	25,11±2,4	43,52±3,2	43,64±2,3	39,54±3,3

Как следует из данных, представленных в таблицы 12, у телят опытных групп гормональный уровень организма был стабильным во все дни исследований, уровень кортизола варьировал в пределах физиологической нормы.

У телят контрольной группы происходило нарастание уровня кортизола, к 7 дню исследований показатель гормона увеличился на 18,53 нмоль/л, в сравнении с периодом до постановки опыта, и на 19,14 нмоль/л, в сравнении с животными опытных групп за тот же период, что свидетельствует о развитии воспалительных процессов у телят контрольной группы.

На основании проведенных исследований были сделаны выводы.

1. Уровень иммуноглобулина класса М у больных животных всех групп был достоверно выше, чем у здоровых. К 14 дню эксперимента уровень иммуноглобулина класса М снижался до нормы.

2. У животных опытных и I контрольной групп содержание Ig G до начала опыта было ниже нормы, а к 14 дню наблюдений у всех животных отмечена тенденция к повышению уровня Ig G. У телят II контрольной группы уровень Ig G оставался ниже нормы во все дни исследований.

3. Препарат способствует повышению уровня общего белка и альбуминов в сыворотке крови новорожденных телят в результате лучшей усвояемости корма и не оказывает негативного воздействия на биохимические показатели крови животных.

Для изучения количественного и качественного состава фекалий у телят с острым расстройством пищеварения были сформированы 5 опытных групп, которые получали препарат в различных лечебных дозах, и 2 контрольные группы (табл.13).

От телят опытных и контрольных групп во все дни исследований наиболее часто выделяли Е.coli, P.vulgaris, K.pneumonia, C.freundii, лакто- и бифидобактерии.

Как видно из таблицы, в 1 г фекалий телят I опытной группы, получавших препарат в дозе 1 г 2 раза в сутки, на 3 день с начала постановки опыта отмечалось повышенное содержание P.vulgaris, K.pneumonia и C.freundii. На 7 день исследований из содержимого кишечника исчезала K.pneumonia, а количество C.freundii снижалось до допустимого уровня. На 14 день с начала постановки опыта у телят этой группы отмечалась полная нормализация состава кишечной микрофлоры на фоне высокого уровня содержания полезных бактерий.

В фекалиях телят II опытной группы, получавших препарат в дозе 1,5 г 2 раза в сутки, на 3 день с начала постановки опыта обнаруживали в высокой концентрации P.vulgaris и C.freundii, однако на 14 день исследований C.freundii и P.vulgaris исчезали из кишечного содержимого.

У телят III, IV и V опытных групп на 3 день с начала постановки опыта в фекалиях не обнаруживали содержание P.vulgaris. Количество лакто- и бифидобактерий у телят опытных групп возрастало во все дни исследований и на 14 день с начала постановки опыта достигало 10-10 м. кл/г фекалий. Энтеропатогенные штаммы бактерий, положительно реагирующие с антиадгезивной сывороткой К99, у телят опытных групп не обнаруживали.

Из фекалий телят I контрольной группы, получавших бифидумбактерин, на 7 день исследований выделяли в высоких концентрациях Е. coli, P.vulgaris, K.pneumonia, C.freundii. На 14 день исследований K.pneumonia элиминировала из кишечника, однако концентрация P.vulgaris возросла в 2 раза. Количество лакто- и бифидобактерий у телят данной группы во все дни исследований соответствовало физиологической норме. На 3, 7 и 14 дни исследований от 6 телят I контрольной группы были выделены энтеропатогенные штаммы Е.coli, содержащие К99 и F41 адгезивные антигены. От 1 больного теленка на 7 и 14 дни выделен S. aureus, обладающий гемолитическими свойствами, и Р.mirabilis, содержащий F41 адгезивный антиген.

Из фекалий телят II контрольной группы, которых лечили антибиотиками, были выделены E.coli, P.vulgaris, P.mirabilis, K.pneumonia, C.freundii, S.aureus, P.aerogenosa. У телят этой группы на 3 день с начала постановки опыта в фекалиях не обнаруживали лакто- и бифидобактерий, в то время как количество патогенной и условно-патогенной микрофлоры было выше допустимых норм. Выделенные от 5 телят на 3, 7 и 14 дни Е.coli дали положительную РА с антиадгезивной сывороткой К99 и обладали гемолитическими свойствами. Выделенные от 2 телят S.aureus дали положительный результат в реакции с плазмокоагулазой, что свидетельствует об их энтеропатогенности. На 14 день исследований нормализации состава кишечной микрофлоры у телят II контрольной группы не наблюдалось.

Сравнивая микробный фон больных и здоровых телят, можно утверждать, что причиной заболевания явилась ассоциация энтеропатогенных Е.coli, P.vulgaris и S.aureus.

Анализируя полученные результаты, можно заключить, что применение препарата с лечебной целью ведет к восстановлению нормального биоценоза пищеварительного тракта телят за счет подавления размножения и элиминации из организма патогенных и условно-патогенных бактерий и повышения концентрации лакто-и бифидобактерий.

Определение антибиотикочувствительности бактерий, выделенных из фекалий телят опытных и контрольных групп. При изучении чувствительности бактерий, выделенных из фекалий телят опытных и контрольных групп, к антибактериальным препаратам выявлена их резистентность к широкому набору антибиотиков и сульфаниламидов (ампициллин, бензилпенициллин, стрептомицин, эритромицин, левомицетин, гентамицин, азитромицин, пефлоксацин, неомицин, тетрациклин, полимиксин, оксациллин, цефотаксим, канамицин, нистатин, амфотерицин, клотримазол, сульфаниламид, фуразолидон, фурадонин).

Таким образом, из всех изученных антибиотиков и сульфаниламидных препаратов можно рекомендовать для лечения телят при желудочно-кишечных болезнях, вызванных ассоциацией условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, лишь пефлоксацин. Однако если в ассоциации бактерий обнаруживаются S.aureus и P.vulgaris, которые резистентны или умеренно чувствительны к данному антибиотику, то следует отказаться от его применения.

Как показали проведенные эксперименты, препарат «ТоксиБиоВит» является средством с многогранной клинической эффективностью, перспективным для использования в схемах терапии при лечении больных с дисбактериозом кишечника различного генеза (при хронических заболеваниях пищеварительного тракта, после перенесенных острых кишечных инфекций, на фоне и после приема антибиотиков, после проведения химиотерапии, на фоне длительной гормональной терапии, в условиях хронических стрессовых состояний, при нерациональной диетотерапии). Использование препарата значительно снижает выраженность диспептических расстройств, улучшает кишечное пищеварение, эффективно гармонизирует состав кишечного микробиоценоза, оказывает иммуномодулирующее действие.

1. Препарат для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта, содержащий стерилизованную культуральную жидкость, содержащую метаболиты, полученные в результате культивирования и стерилизации Bacillis subtilis, носитель и стеарат кальция, отличающийся тем, что он дополнительно содержит стерилизованную культуральную жидкость, содержащую метаболиты, полученные в результате культивирования и стерилизации Halobacterium halobium и штамма Bacillus licheniformis Л-34 ВКПМ В-4161, в качестве стерилизованной культуральной жидкости, содержащую метаболиты Bacillis subtilus, стерилизованную культуральную жидкость, содержащую метаболиты, полученные в результате культивирования и стерилизации штамма Bacillus subtilis 3/28 ВКПМ В-3679, в качестве носителя смесь глауконита с клеточными оболочками штамма пивных дрожжей Saccharomyces cerevisiae при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:

стерилизованная культуральная жидкость
Bacillus subtilis 3/28 ВКПМ В-3679	10,0-15,0
стерилизованная культуральная жидкость
Bacillus licheniformis Л-34 ВКПМ В-4161	10,0-15,0
стерилизованная культуральная жидкость
Halobacterium halobium	10,0-15,0
глауконит	50,0-55,0
клеточные оболочки штамма пивных
дрожжей Saccharomyces cerevisiae	5,0-15,0
стеарат кальция	0,5-2,0

2. Препарат по п.1, отличающийся тем, что содержит следующее соотношение ингредиентов, мас.%:

стерилизованная культуральная жидкость
Bacillus subtilis 3/28 ВКПМ В-3679	12,0
стерилизованная культуральная жидкость
Bacillus licheniformis Л-34 ВКПМ В-4161	12,0
стерилизованная культуральная жидкость
Halobacterium halobium	12,0
глауконит	53,0
клеточные оболочки штамма пивных
дрожжей Saccharomyces cervisiae	10,0
стеарат кальция (аэросил)	1,0