Оптические агенты визуализации

Настоящее изобретение относится к области медицины и фармацевтики и представляет собой агент визуализации, подходящий для оптической визуализации организма млекопитающего in vivo, который включает конъюгат пентаметинцианинового красителя с биологической молекулой-мишенью (RGD-пептид). Изобретение обеспечивает создание конъюгатов пентаметиновых цианиновых красителей, подходящих для исследований in vivo, характеризующихся пониженным неспецифическим связыванием in vivo, например, с белками плазмы. 7 н. и 19 з.п. ф-лы, 1 ил., 11 пр., 7 табл.

 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к агентам визуализации, подходящим для оптической визуализации in vivo, которые включают конъюгаты пентаметинцианиновых красителей с пониженным неспецифическим связыванием, например, с белками плазмы. Этого достигают путем регулирования природы и положения сульфоновокислотных заместителей, в частности сульфоалкильных групп. Также раскрыты фармацевтические композиции и наборы, а также способы визуализации in vivo.

Предшествующий уровень техники

В патенте США 6083485 и его аналогах раскрыты способы оптической визуализации in vivo в ближней инфракрасной области спектра (NIR) с использованием цианиновых красителей, имеющих коэффициент распределения октанол-вода 2,0 или менее. Также раскрыты конъюгаты указанных красителей с "биологическими детектирующими субъединицами" молекулярной массы вплоть до 30 кДа, которые связываются со специфическими клеточными популяциями, либо избирательно связываются с рецепторами, либо накапливаются в тканях или опухолях. Красители согласно патенту США 6083485 могут быть также конъюгированы с макромолекулами, такими как полилизин, декстран или полиэтиленгликоль. Конкретные конъюгаты с красителем не раскрыты.

В WO 00/16810 раскрыты контрастные NIR флуоресцентные агенты, которые имеют 3 или более сульфоновокислотных групп в молекуле и имеют формулу А:

где:

R¹ и R² являются одинаковыми или разными и каждый представляет собой замещенный или незамещенный алкил;

Z¹ и Z² каждый представляет собой атом неметалла, необходимый для образования замещенного или незамещенного конденсированного бензокольца или конденсированного нафтокольца;

r равен 0, 1 или 2;

L¹-L⁷ являются одинаковыми или разными и каждый представляет собой замещенный или незамещенный метин при условии, что, когда г равен 2, L⁶ и L⁷, которые присутствуют в двойном количестве, являются одинаковыми или разными;

Х и Y являются одинаковыми или разными и каждый представляет собой группу формулы -O-, -S-, -СН=СН- или -C(R³R⁴)-, где R³ и R⁴ являются одинаковыми или разными и каждый представляет собой замещенный или незамещенный алкил.

В WO 00/16810 раскрыто, что r из формулы А предпочтительно равен 1, то есть красители представляют собой гептаметинцианиновые красители, и что предпочтительные красители, имеющие 3 или более сульфоновокислотных групп в молекуле, представляют собой бензиндольные красители формулы В:

где R¹, R², L¹-L⁷, Х и Y являются такими, как определено для формулы А, и

R⁵-R¹⁶ являются одинаковыми или разными и каждый представляет собой Н, сульфоновокислотную группу, карбоксильную группу, ОН, алкил(сульфоалкил)аминогруппу, бис(сульфоалкил)аминогруппу, сульфоалкоксильную группу, (сульфоалкил)сульфонильную группу или (сульфоалкил)аминосульфонильную группу за исключением некоторых конкретных соединений.

L¹-L⁷ полиметиновая цепь согласно WO 00/16810 предпочтительно представлена формулой С:

где Z³ представляет собой атомы неметалла, необходимые для образования 5- или 6-членного кольца;

А представляет собой Н или одновалентную группу.

В WO 00/16810 раскрыто, что для превосходной водорастворимости количество сульфоновокислотных групп предпочтительно равно 4 или более, однако для легкости синтеза суммарное количество не должно превышать 10, предпочтительно не более чем 8. В WO 00/16810 также раскрыты предпочтительные положения сульфоновокислотных групп:

формула А - положения R¹, R², Z¹ и/или Z²;

формула В - положения R¹, R², R⁵, R⁷, R¹¹ и/или R¹³;

формула С - положение А через двухвалентную группу, такую как алкилен.

В WO 01/43781 раскрыты цианиновые красители с 7 метиновыми атомами углерода (то есть гептаметиновые или Cy7 красители), соответствующие r, равному 1 в формуле А выше. Красители из WO 01/43781 имеют 4-6 сульфоновокислотных заместителей.

В Licha et al. [Photochem. Photobiol., 72(3), 392-398 (2000)] сообщается, что цианиновые красители, имеющие по меньшей мере один гидрофильный глюкамидный или глюкозамидный заместитель, проявляют пониженное связывание с белками плазмы (РРВ) по сравнению с исходным красителем. Сказано, что два таких заместителя вместо одного еще больше снижают РРВ. Также сказано, что гидрофильные заместители улучшают фотофизические свойства красителя и изменяют фармакокинетические параметры, так что контраст между опухолью и нормальной тканью усиливается.

В патенте США 6977305 (Molecular Probes, Inc.) предложены соединения формулы:

где:

R² и R¹² независимо представляют собой алкил или сульфоалкил;

R³ представляет собой карбоксиалкил;

R⁴, R¹³ и R¹⁴ независимо представляют собой алкил;

R⁶-R⁹ и R¹⁶-R¹⁹ независимо представляют собой Н или сульфо; и

n равен 1, 2 или 3.

Также раскрыты активированные сложные эфиры красителей. В родственном патенте США 6974873 раскрыты способы окрашивания биологических образцов с использованием красителей, а также способы образования конъюгатов красителей с белками, пептидами или полимером нуклеиновой кислоты с использованием N-гидроксисукцинимидных сложных эфиров красителей.

В WO 2005/044923 раскрыты красители, подходящие для мечения и детектирования биологических материалов. Красители представляют собой триметиновые, пентаметиновые и гептаметиновые цианиновые красители (то есть n равен 1, 2 или 3) формулы D:

где:

R¹ и R² представляют собой C_1-6алкил; бензил, незамещенный или замещенный сульфоновой кислотой или -(CH₂)_k-W;

где W представляет собой сульфоновую кислоту или фосфоновую кислоту, а k равен целому числу от 1 до 10;

R³-R⁶ представляют собой Н, SO₃H или -E-F;

где Е представляет собой простую связь или спейсерную группу, имеющую цепь из 1-20 соединенных атомов, выбранных из С, N и О, и F представляет собой группу, связывающую мишень;

R¹¹, R¹², R¹³ и R¹⁴ представляют собой C_1-6алкил или -(CH₂)_k-W;

Z¹ и Z² независимо представляют собой атомы углерода, необходимые для получения завершенной одно- или двухкольцевой ароматической системы; при условиях, что:

(1) один или более чем один из R¹¹, R¹², R¹³ и R¹⁴ независимо представляет собой -(CH₂)_k-W,

(2) по меньшей мере один из R¹-R⁷ представляет собой -E-F.

Группа, связывающая мишень (F), из WO 2005/044923 предназначена для взаимодействия с функциональной группой целевого компонента (например белка, пептида, нуклеиновой кислоты или углевода). В WO 2005/044923 раскрыто, что присутствие одной или, предпочтительно, нескольких групп, придающих растворимость в воде, присоединенных по положению 3 индолиниевого кольца (то есть R¹¹ или R¹²), уменьшает взаимодействия краситель-краситель, в частности, когда красители присоединены к компонентам, таким как нуклеиновые кислоты, белки, антитела и другие, и таким образом способствует минимизации потери интенсивности флуоресценции из-за межплоскостных взаимодействий краситель-краситель. В WO 2005/044923 раскрыто, что W предпочтительно представляет собой сульфоновую кислоту и что должно присутствовать по меньшей мере 2 группы -(CH₂)_k-W, которые предпочтительно выбраны таким образом, что одна из групп R¹¹/R¹² и одна из групп R¹³/R¹⁴ представляет собой -(CH₂)_k-W, а другая предпочтительно представляет собой -СН₃. В WO 2005/044923 раскрыто, что W предпочтительно представляет собой сульфоновую кислоту и k предпочтительно равен 3 или 4. В дополнительном воплощении в WO 2005/044923 раскрыто, что красители предпочтительно замещены 3-5 сульфоновокислотными группами и что применение таких красителей для мечения биологических молекул-мишеней снижает потерю флуоресценции из-за агрегации краситель-краситель. В WO 2005/044923 также раскрыты способы мечения биологических молекул с красителями формулы D. WO 2005/044923 относится непосредственно к применениям красителя in vitro, и ничего не сказано о применениях in vivo.

В WO 2005/123768 раскрыты конъюгаты цианиновых красителей (которые представляют собой карбацианины, оксацианины, тиацианины или азацианины) с пептидами RGD-типа для оптической визуализации ангиогенеза in vivo. Цианиновые красители из WO 2005/123768 предпочтительно представляют собой пентаметиновые или гептаметиновые красители и предпочтительно имеют ноль, один или два сульфоновокислотных заместителя. Сказано, что уменьшение количества сульфонатных групп по сравнению с цианиновыми красителями предшествующего уровня техники дает пониженное связывание с белками плазмы (РРВ) и тем самым пониженный неспецифический захват in vivo. В Примере 5 в WO 2005/123768 предложены данные по РРВ конъюгатов с пентаметиновыми цианиновыми красителями, имеющими 1, 2 и 4 сульфоновокислотных группы. Было обнаружено, что РРВ возрастает с увеличением количества сульфоновокислотных групп (РРВ 17, 21 и 45% соответственно).

В Bullok et al. [Biochem., 46(13), 4055-4065 (2007)] раскрыт апоптозный зонд TcapQ₅₄₇, который содержит эффекторную последовательность распознавания каспазы (тетрапептид DEVD), конъюгированную с: (1) мембранным транспортерным пептидом (Tat-пептид); (2) гасителем дальнего красного спектра (QSY 21) и (3) цианиновым красителем флуорофором Alexa Fluor™ 647. Интактный зонд проявляет очень малую флуоресценцию из-за гашения QSY 21. После расщепления каспазами по сайтам каспазной активности расщепленный пептид проявляет флуоресценцию ввиду того факта, что конъюгированный Alexa Fluor™ 647 теперь находится в другой молекуле относительно гасителя. Эта статья относится к исследованиям как с использованием разделенных интактных клеток, так и с использованием животной модели in vivo.

В Strong et al. [Eur. Cytokine Netw., 17, 49-59 (2006)] раскрыты хемокиновые белки, модифицированные с Alexa Fluor™ 647 по конкретным положениям их последовательностей. Оценивали специфичность клеточного окрашивания in vitro, что привело авторов к выводу о том, что соединения могут быть полезны в анализах хемокинового рецептора на основе интактных клеток.

Настоящее изобретение

В настоящем изобретении предложены агенты визуализации, подходящие для оптической визуализации in vivo, которые содержат конкретный класс пентаметинового цианинового красителя с конкретной картиной сульфонирования и конъюгированы с биологической группировкой-мишенью (ВТМ). Авторы настоящего изобретения обнаружили, что для пентаметиновых красителей сульфоалкильные группы проявляют важную роль в снижении связывания с белками плазмы (РРВ). Это является важным как для in vivo, так и для in vitro применений, так как способствует подавлению неспецифического связывания. Предполагается, что это происходит благодаря более трехмерной пространственной, или "объемной", природе таких модифицированных красителей в противоположность по существу двухмерным (или "плоскостным") арильным сульфонированным красителям (например Cy5 и Cy5.5).

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что даже в пределах когерентного ряда пентаметиновых цианиновых красителей при конъюгировании с биологическими молекулами-мишенями (например, RGD-пептидами) имеются значительные вариации в биологических характеристиках, в частности в неспецифическом связывании. Это вносит вклад в нежелательный фоновый захват in vivo и тем самым пониженный контраст изображения и более медленный фоновый клиренс, требующий нежелательной задержки перед визуализации. В дополнение и как не рассматривается в уровне техники, неспецифическое связывание с коллагеном (которое широко распространено в организме млекопитающего) варьирует в значительной степени. В настоящем изобретении предложен конкретный подкласс пентаметиновых цианиновых красителей, которые имеют предпочтительные характеристики в отношении визуализации in vivo.

Подробное описание изобретения

В первом аспекте настоящего изобретения предложен агент визуализации, подходящий для оптической визуализации организма млекопитающего in vivo, включающий конъюгат формулы I:

где:

ВТМ представляет собой биологическую молекулу-мишень;

Cy^D представляет собой цианиновый краситель формулы II:

где:

Y¹ и Y² независимо представляют собой -O-, -S-, -NR⁶- или -CR⁷R⁸- и выбраны таким образом, что по меньшей мере один из Y¹ и Y² представляет собой -CR⁷R⁸-;

R¹ и R² независимо представляют собой Н, -SO₃M¹ или R^a, где М¹

представляет собой Н или B^c,

и B^c представляет собой биосовместимый катион;

R³ представляет собой Н, С_1-5алкил, С_1-6карбоксиалкил или группу R^a;

R⁴-R⁶ независимо представляют собой С_1-5алкил, C_1-6карбоксиалкил или R^а;

R⁷ представляет собой C_1-3алкил;

R⁸ представляет собой R^a или C_1-6карбоксиалкил;

R^a представляет собой С_1-4 сульфоалкил;

L представляет собой синтетическую линкерную группу формулы -(А)_m-, где каждый А независимо представляет собой -CR₂-, -CR=CR-, -C≡C-, -CR₂CO₂-, -CO₂CR₂-, -NRCO-, -CONR-, -NR(C=O)NR-, -NR(C=S)NR-, -SO₂NR-, -NRSO₂-, -CR₂OCR₂-, -CR₂SCR₂-, -CR₂NRCR₂-, С_4-8циклогетероалкиленовую группу, C_4-8циклоалкиленовую группу, С_5-12ариленовую группу или С_3-12гетероариленовую группу, аминокислоту, сахар или монодисперсную полиэтиленгликолевую (PEG) структурную единицу;

каждый R независимо выбран из Н, С_1-4алкила, С_2-4алкенила, С_2-4алкинила, С_1-4алкоксиалкила или С_1-4гидроксиалкила;

m равен целому числу от 1 до 20;

n равен целому числу 0 или 1;

при условиях, что:

(1) цианиновый краситель содержит по меньшей мере одну группу R^a и суммарно от 3 до 6 сульфоновокислотных заместителей из групп R¹, R² и R^a;

(2) агент визуализации не содержит гасителя флуоресценции.

Термин "агент визуализации" означает соединение, подходящее для оптической визуализации интересующей области целого (то есть интактного) организма млекопитающего in vivo. Предпочтительно, млекопитающее представляет собой человека. Визуализация может быть инвазивной (например, интраоперационной или эндоскопической) или неинвазивной. Визуализация возможно может быть использована для облегчения биопсии (например, через канал для биопсии в эндоскопическом оборудовании) или резекции опухоли (например, во время интраоперационных процедур посредством определения границ резекции опухоли).

В то время как конъюгат формулы I является подходящим для визуализации in vivo, его также можно использовать для in vitro применений (например, анализы количественного определения ВТМ в биологических образцах или визуализация ВТМ в тканевых образцах). Предпочтительно, агент визуализации используют для визуализации in vivo.

Термин "сульфоновокислотный заместитель" означает заместитель формулы -SO₃M¹, где M¹ представляет собой Н или B^c, и B^c представляет собой биосовместимый катион. Заместитель -SO₃M¹ ковалентно связан с атомом углерода, и этот атом углерода может быть арильным (таким, как группы R¹ или R²) или алкильным (то есть группа R^a). Термин "биосовместимый катион" (B^c) означает положительно заряженный противоион, который образует соль с ионизированной отрицательно заряженной группой (в данном случае сульфонатной группой), где указанный положительно заряженный противоион является также нетоксичным и поэтому подходящим для введения в организм млекопитающего, особенно в организм человека. Примеры подходящих биосовместимых катионов включают: щелочные металлы натрий и калий; щелочноземельные металлы кальций и магний и ион аммония. Предпочтительные биосовместимые катионы представляют собой натрий и калий, наиболее предпочтительно натрий.

Термин "гаситель флуоресценции" означает группировку, которая подавляет флуоресценцию Cy^D, так что ВТМ, имеющая присоединенные гаситель и Cy^D, будет иметь минимальную флуоресценцию. Молекулы гасителей известны в данной области техники [Johansson, Meth. Mol. Biol., 335, 17-29 (2006) и Bullok et al. (выше)]. Таким образом, конъюгаты агента визуализации по настоящему изобретению соответственно уже являются флуоресцентными благодаря присутствию Cy^D и не нуждаются в метаболической активации для отделения Cy^D от гасителя. Это имеет преимущество в том, что ВТМ не имеет конъюгированной с ней дополнительной молекулы, которая может влиять на способность ВТМ взаимодействовать с его биологическим сайтом распознавания in vivo ввиду, например, стерического препятствия или изменения конформации из-за взаимодействия между гасителем и Cy^D, или гасителем и ВТМ, или гасителем и линкерной группой. В дополнение, необходимость в гасителе ограничивает ВТМ до одной, которая представляет собой субстрат для биологической мишени (то есть ферментативно расщепляемой) или которая подвергается значительному конформационному изменению при связывании. Отсутствие гасителя дает возможность использования большего численного диапазона ВТМ, что в свою очередь обеспечивает возможность диагностики более широкого ряда болезненных состояний. Какие-либо проявления токсичности из-за гасителя также исключены.

Термин "биологическая группировка-мишень" (ВТМ) означает соединение, которое после введения избирательно захватывается или локализуется в конкретном сайте организма млекопитающего. Такие сайты могут, например, быть вовлечены в конкретное болезненное состояние, показывая как функционирует орган или метаболический процесс. Биологическая группировка-мишень предпочтительно включает: 3-100-мерные пептиды, аналоги пептидов, пептоиды или миметики пептидов, которые могут представлять собой линейные пептиды или циклические пептиды или их комбинации; или субстраты ферментов, антагонисты ферментов, или ингибиторы ферментов; синтетические рецептор-связывающие соединения; олигонуклеотиды или фрагменты олиго-ДНК или олиго-РНК.

Термин "пептид" означает соединение, содержащее две или более аминокислот, как определено выше, связанных пептидной связью (то есть амидной связью, присоединяющей амин одной аминокислоты к карбоксилу другой аминокислоты). Термин "миметик пептида" или "миметик" относится к биологически активным соединениям, которые имитируют биологическую активность пептида или белка, но более не являются пептидными по химической природе, то есть они более не содержат никаких пептидных связей (то есть амидных связей между аминокислотами). Здесь термин «миметик пептида» используют в более широком смысле для включения молекул, которые более не являются полностью пептидными по природе, таких как псевдопептиды, полупептиды и пептоиды. Термин "аналог пептида" относится к пептидам, содержащим один или более чем один аналог аминокислоты, как описано ниже. См. также "Synthesis of Peptides and Peptidomimetics", M.Goodman et al. Houben-Weyl E22c, Thieme.

Термин "аминокислота" означает L- или D-аминокислоту, аналог аминокислоты (например, нафтилаланин) или миметик аминокислоты, которые могут быть естественного происхождения или получены тонким синтезом и могут быть оптически чистыми, то есть в виде индивидуального энантиомера и поэтому хиральными, или в виде смеси энантиомеров. Для обозначения аминокислот в данном описании использованы общепринятые 3-буквенные или однобуквенные сокращения. Предпочтительно, аминокислоты по настоящему изобретению являются оптически чистыми. Термин "миметик аминокислоты" означает синтетические аналоги существующих в природе аминокислот, которые являются изостерами, то есть разработаны так, чтобы имитировать стерическую и электронную структуру природного соединения. Такие изостеры хорошо известны специалистам в данной области техники и включают депсипептиды, ретро-инверсо-пептиды, тиоамиды, циклоалканы или 1,5-дизамещенные тетразолы, но не ограничены ими [см. M.Goodman, Biopolymers, 24, 137, (1985)].

Подходящие субстраты ферментов, антагонисты или ингибиторы включают глюкозу и аналоги глюкозы такие как фтордезоксиглюкоза; жирные кислоты или эластазу, ингибиторы ангиотензина II или металлопротеиназы. Предпочтительный непептидный антагонист ангиотензина II представляет собой лосартан. Подходящие синтетические рецептор-связывающие соединения включают эстрадиол, эстроген, прогестин, прогестерон и другие стероидные гормоны; лиганды для рецептора дофамина D-1 или D-2 или транспортер дофамина, такой как тропаны; и лиганды для рецептора серотонина.

Цианиновый краситель (Cy^D) формулы II представляет собой флуоресцентный краситель или хромофор, который способен к прямому или опосредованному детектированию в процедуре оптической визуализации с использованием длин волн в области спектра от зеленой до ближней инфракрасной (500-1200 нм, предпочтительно 600-1000 нм). Предпочтительно Cy^D имеет флуоресцентные свойства.

Предусмотрено, что одна из ролей линкерной группы -(А)_m- формулы I заключается в том, чтобы отдалять Cy^D от активного сайта ВТМ. Это особенно важно, так как Cy^D является относительно объемной, так что возможны неблагоприятные стерические взаимодействия. Этого можно достичь комбинацией гибкости (например, простые алкильные цепи), так что Cy^D имеет свободу для саморасположения вдали от активного сайта, и/или жесткости, такой как циклоалкильный или арильный спейсер, который ориентирует Cy^D вдали от активного сайта. Природа линкерной группы может также быть использована для модификации биораспределения агента визуализации. Таким образом, например, включение сложноэфирных групп в линкер будет способствовать минимизации связывания с белками плазмы. Когда -(А)_m- содержит полиэтиленгликолевую (PEG) структурную единицу или пептидную цепь из 1-10 аминокислотных остатков, линкерная группа может иметь функцию модифицирования фармакокинетических параметров и скорости клиренса из крови агента визуализации in vivo. Такие "биомодифицирующие" линкерные группы могут ускорять клиренс агента визуализации из фоновой ткани, такой как мышечная или печеночная, и/или из крови, тем самым давая лучшее диагностическое изображение вследствие меньших фоновых помех.

Биомодифицирующая линкерная группа может также быть использована для того чтобы способствовать конкретному пути экскреции, например, через почки в противоположность пути через печень.

Термин "сахар" означает моно-, ди- или трисахарид. Подходящие сахара включают: глюкозу, галактозу, мальтозу, маннозу и лактозу. Возможно сахар может быть функционализирован, чтобы обеспечить легкое сочетание с аминокислотами. Таким образом, например, глюкозаминное производное аминокислоты может быть конъюгировано с другими аминокислотами через пептидные связи. Глюкозаминное производное аспарагина (имеющееся в продаже от NovaBiochem) является одним из таких примеров:

Формула I означает, что группировка -(L)_nCy^D] может быть присоединена по любому подходящему положению ВТМ. Такие подходящие положения для группировки -(L)_n[Cy^D] следует выбирать по положениям вдали от той части ВТМ, которая ответственна за связывание с активным сайтом in vivo. Группировка [BTM]-(L)_n- формулы I может быть присоединена по любому подходящему положению Cy^D формулы II. Группировка [BTM]-(L)_n- либо занимает место имеющегося заместителя (например, одной из групп R¹-R⁸), либо ковалентно присоединена к имеющемуся заместителю Cy^D. Группировка [BTM]-(L)_n- предпочтительно присоединена через карбоксиалкильный заместитель Cy^D.

Предпочтительные признаки

Молекулярная масса агента визуализации составляет подходящим образом вплоть до 30000 дальтон. Предпочтительно, молекулярная масса находится в диапазоне от 1000 до 20000 дальтон, наиболее предпочтительно от 2000 до 18000 дальтон, особенно предпочтительно от 2500 до 16000 дальтон.

ВТМ может быть синтетического или природного происхождения, но предпочтительно является синтетической. Термин "синтетический" имеет свое общепринятое значение, то есть искусственный в противоположность выделенному из натуральных источников, например из организма млекопитающего. Такие соединения имеют преимущество в том, что их производство и уровень примесей можно полностью контролировать. Моноклональные антитела и их фрагменты природного происхождения таким образом не входят в объем термина "синтетический", как он использован здесь.

ВТМ предпочтительно выбрана из: 3-100-мерного пептида, субстрата фермента, антагониста фермента или ингибитора фермента. ВТМ наиболее предпочтительно представляет собой 3-100-мерный пептид или аналог пептида. Когда ВТМ представляет собой пептид, он предпочтительно представляет собой 4-30-мерный пептид и наиболее предпочтительно 5-28-мерный пептид.

В формуле II Y¹ и Y² предпочтительно оба независимо представляют собой -CR⁷R⁸-. В формуле II R³ предпочтительно представляет собой Н или группу R^a и наиболее предпочтительно представляет собой Н. R⁷ предпочтительно представляет собой СН₃.

Группировка [BTM]-(L)_n- формулы I предпочтительно присоединена по положениям R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ или R⁸ Cy^D формулы II, более предпочтительно по R³, R⁴ или R⁵, наиболее предпочтительно по R⁴ или R⁵. Присоединение ВТМ по положению R³ имеет преимущество в том, что:

(1) становятся доступными дополнительные предпочтительные сайты для локализации сульфоалкильных групп (R^a);

(2) объемность красителя увеличивается, способствуя тем самым снижению РРВ.

Цианиновый краситель (Cy^D) предпочтительно имеет суммарно 4 сульфоновокислотных заместителя, выбранных из групп R¹, R² и R^a. Две группы R^a предпочтительно локализованы по положениям Y², R³, R⁴ или R⁵, наиболее предпочтительно по R⁵ вместе с Y²=-CR⁷R^a- или R⁴=R^a. В формуле II группы R^a предпочтительно имеют формулу -(СН₂)_kSO₃M¹, где М¹ представляет собой Н или B^c, k равен целому числу от 1 до 4, и В^с представляет собой биосовместимый катион (как определено выше), k предпочтительно равен 3 или 4.

В формуле II R¹ и R² оба предпочтительно представляют собой SO₃M¹. Когда R¹ и R² оба представляют собой SO₃M¹, эти заместители SO₃M¹ предпочтительно находятся в положении 5 индольных/индолениновых колец.

Особенно предпочтительные красители представлены формулой III:

где:

R^b независимо представляет собой группу R^a или С_1-6карбоксиалкил;

R⁹-R¹² независимо представляют собой С_1-5алкил или группу R^b и выбраны таким образом, что

либо R⁹ и R¹⁰ оба представляют собой R^c, либо R¹¹ и R¹² оба представляют собой R^c, где R^c представляет собой С_1-2алкил;

R^a и М¹ являются такими, как определено выше для формулы II.

Группы R^a формулы III предпочтительно независимо представляют собой -(СН₂)_kSO₃M¹, где k равен целому числу от 1 до 4, и k предпочтительно равен 3 или 4. Предпочтительно красители формулы III имеют C_1-6карбоксиалкильный заместитель для обеспечения легкого ковалентного присоединения к ВТМ.

Предпочтительные красители формулы III выбраны таким образом, что один из R⁹-R¹² представляет собой группу R^b, а каждый из остальных представляет собой группы R^c, наиболее предпочтительно каждый представляет собой СН₃. Особенно предпочтительные красители формулы III представлены формулой IIIa, где один из R⁹-R¹² представляет собой группу R^a, а каждый из остальных представляет собой группы R^c, наиболее предпочтительно каждый представляет собой СН₃. Предпочтительные красители формулы IIIa имеют одну из групп R^b, выбранную из C_1-6карбоксиалкила.

Наиболее предпочтительные конкретные красители формул III и IIIa соответственно представляют собой Alexa Fluor™ 647 и Cy5^**, причем Cy5^** является наиболее подходящим:

Когда ВТМ представляет собой пептид, предпочтительные такие пептиды включают:

- соматостатин, октреотид и аналоги,

- пептиды, которые связываются с рецептором ST, где ST относится к термостабильному токсину, продуцируемому E.coli и другими микроорганизмами;

- фрагменты ламинина, например YIGSR, PDSGR, IKVAV, LRE и KCQAGTFALRGDPQG,

- N-формилпептиды для сайтов-мишеней аккумуляции лейкоцитов,

- фактор тромбоцитов 4 (PF4) и его фрагменты,

- RGD (Arg-Gly-Asp)-содержащие пептиды, которые могут, например, нацеливаться на ангиогенез [R.Pasqualini et al. Nat Biotechnol. 1997 Jun; 15(6):542-6]; [E.Ruoslahti, Kidney Int. 1997 May; 51(5):1413-7];

- пептидные фрагменты α₂-антиплазмина, фибронектина или бета-казеина, фибриногена или тромбоспондина. Аминокислотные последовательности α₂-антиплазмина, фибронектина, бета-казеина, фибриногена и тромбоспондина можно найти в следующих ссылках: предшественник α₂-антиплазмина [M.Tone et al. J.Biochem, 102, 1033, (1987)]; бета-казеин [L.Hansson et al. Gene, 139. 193, (1994)]; фибронектин [A.Gutman et al. FEBS Lett., 207, 145, (1996)]; предшественник тромбоспондина-1 [V.Dixit et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83, 5449, (1986); R.F.Doolittle, Ann. Rev. Biochem., 53, 195, (1984)];

- пептиды, которые являются субстратами или ингибиторами ангиотензина, такие как:

ангиотензин II Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (Е.С.Jorgensen et al, J. Med. Chem., 1979, Vol 22, 9, 1038-1044);

[Sar, Ile] ангиотензин II: Sar-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile (R.K.Turker et al., Science, 1972, 177, 1203);

- ангиотензин I: Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu.

Когда ВТМ представляет собой пептид, один из обоих концов пептида, предпочтительно оба, конъюгированы с группой, ингибирующей метаболизм (M^IG). Наличие обоих пептидных концов, защищенных таким образом, является важным для применений в визуализации in vivo, так как в противном случае следует ожидать быстрый метаболизм с последующей потерей аффинности избирательного связывания в отношении ВТМ-пептида. Термин "группа, ингибирующая метаболизм" (M^IG), означает биосовместимую группу, которая ингибирует или подавляет действие фермента, особенно пептидазы, такой как карбоксипептидаза, метаболизм ВТМ-пептида либо по амино-концу, либо по карбокси-концу. Такие группы особенно важны для применения in vivo и хорошо известны специалистам в данной области техники и выбраны подходящим образом для амино-конца пептидов из: N-ацилированных групп -NH(C=O)R^G, где ацильная группа -(С=O)R^G имеет R^G, выбранный из: C_1-6алкила, С_3-10арильных групп, или содержит полиэтиленгликолевую (PEG) структурную единицу. Подходящие группы PEG описаны ниже для линкерной группы (L). Предпочтительные такие группы PEG являются биомодификаторами формул Bio1 или Bio2 (ниже). Предпочтительные такие аминоконцевые группы M^IG представляют собой ацетил, бензилоксикарбонил или трифторацетил, наиболее предпочтительно ацетил.

Подходящие группы, ингибирующие метаболизм, для пептидного карбоксильного конца включают: карбоксамид, трет-бутиловый эфир, бензиловый эфир, циклогексиловый эфир, аминоспирт или полиэтиленгликолевую (PEG) структурную единицу. Подходящая группа M^IG для карбоксильного концевого аминокислотного остатка ВТМ-пептида является такой, где концевая аминогруппа аминокислотного остатка N-алкилирована C_1-4алкильной группой, предпочтительно метильной группой. Предпочтительные такие группы M^IG представляют собой карбоксамид или PEG, наиболее предпочтительные такие группы представляют собой карбоксамид.

Когда один или оба конца пептида защищены группой M^IG, группировка -(L)_n[Cy^D] возможно может быть присоединена к группе M^IG. Предпочтительно, по меньшей мере один конец пептида не имеет группы M^IG, так что присоединение группировки -(L)_n[Cy^D] по тому положению дает соединения формул IVa или IVb соответственно:

где:

Z¹ присоединен к N-концу ВТМ-пептида и представляет собой Н или M^IG;

Z² присоединен к С-концу ВТМ-пептида и представляет собой ОН, OB^c или M^IG,

где B^c представляет собой биосовместимый катион (как определено выше).

В формуле IVa и IVb, Z¹ и Z² предпочтительно оба независимо представляют собой M^IG. Предпочтительные такие группы M^IG для Z¹ и Z² являются такими, как определено выше для концов пептида. Хотя ингибирование метаболизма ВТМ-пептида по одному из концов пептида может также быть достигнуто путем присоединения группировки -(L)_n[Cy^D] таким способом, что сама -(L)_n[Cy^D] не входит в определение M^IG по настоящему изобретению.

ВТМ-пептид возможно может содержать по меньшей мере один дополнительный аминокислотный остаток, имеющий боковую цепь, подходящую для легкой конъюгации Cy^D, и образует часть А остатков линкерной группы (L). Подходящие такие аминокислотные остатки включают остатки Asp или Glu для конъюгации с красителями Cy^D, функционализированными аминогруппами, или остаток Lys для конъюгации с красителем Cy^D, функционализированным карбоксигруппами или активным сложным эфиром. Дополнительный(е) аминокислотный(е) остаток(ки) для конъюгации Cy^D подходящим образом расположен(ы) вдали от связывающего участка ВТМ-пептида и предпочтительно расположен(ы) по С- или N-концу. Предпочтительно, аминокислотный остаток для конъюгации представляет собой остаток Lys.

Когда присутствует синтетическая линкерная группа (L), она предпочтительно содержит концевые функциональные группы, которые облегчают конъюгацию с [ВТМ] и Cy^D. Подходящие такие группы (Q^a) описаны в пятом аспекте (ниже). Когда L содержит пептидную цепь из 1-10 аминокислотных остатков, эти аминокислотные остатки предпочтительно выбраны из глицина, лизина, аргинина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты и серина. Когда L содержит группировку PEG, она предпочтительно содержит структурные единицы, полученные при олигомеризации монодисперсных PEG-подобных структур формул Bio1 или Bio2:

17-амино-5-оксо-6-аза-3,9,12,15-тетраоксагептадекановая кислота формулы Bio1, где р равен целому числу от 1 до 10. Альтернативно, может быть использована PEG-подобная структура на основе производного пропионовой кислоты формулы Bio2:

где р является таким, как определено для формулы Bio1, и q равен целому числу от 3 до 15.

В формуле Bio2 р предпочтительно равен 1 или 2, и q предпочтительно равен числу от 5 до 12.

Когда линкерная группа не содержит PEG или пептидную цепь, предпочтительные группы L имеют основную цепь соединенных атомов, образующих группировку -(А)_m- из 2-10 атомов, наиболее предпочтительно из 2-5 атомов, особенно предпочтительно из 2 или 3 атомов. Минимальная линкерная группа с основной цепью из 2 атомов дает преимущество в том, что Cy^D хорошо отделена, так что какое-либо нежелательное взаимодействие минимизировано.

ВТМ-пептиды, которые не имеются в продаже, могут быть синтезированы твердофазным пептидным синтезом, как описано в Р.Lloyd-Williams, F.Albericio and E.Girald; Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, CRC Press, 1997.

Агенты визуализации могут быть получены следующим образом.

С целью облегчения конъюгации Cy^D с ВТМ Cy^D подходящим образом присоединена к ней реакционно-способной функциональной группой (Q^a). Эта группа Q^a предназначена для взаимодействия с комплементарной функциональной группой ВТМ, тем самым образуя ковалентную связь между Cy^D и ВТМ. Комплементарная функциональная группа ВТМ может представлять собой внутреннюю часть ВТМ или может быть включена при использовании дериватизации с бифункциональной группой, как известно в данной области техники. В Таблице 1 показаны примеры реакционно-способных групп и их комплементарные эквиваленты:

Таблица 1
Реакционно-способные заместители и реагирующие с ними комплементарные группы
Реакционно-способная группа (Qa)	Комплементарные группы
Активированный сложный эфир	Первичная аминогруппа, вторичная аминогруппа
Ангидрид кислоты, галогенангидрид	Первичная аминогруппа, вторичная аминогруппа, гидроксил
Изотиоцианат	Аминогруппы
Винилсульфон	Аминогруппы
Дихлортиазин	Аминогруппы
Галогенацетамид, малеимид	Тиол, имидазол, гидроксил, амины, тиофосфат
Карбодиимид	Карбоновые кислоты
Гидразин, гидразид	Карбонил, включая альдегид и кетон
Фосфорамидит	Гидроксильные группы

Термин "активированный сложный эфир" или "активный сложный эфир" означает сложноэфирное производное карбоновой кислоты, которое является лучшей уходящей группой и поэтому обеспечивает более легкое взаимодействие с нуклеофилом, таким как амины. Примеры подходящих активных сложных эфиров представляют собой: N-гидроксисукцинимид (NHS), пентафторфенол, пентафтортиофенол, пара-нитрофенол и гидроксибензотриазол. Предпочтительные активные сложные эфиры представляют собой N-гидроксисукцинимидные или пентафторфенольные сложные эфиры.

Примеры функциональных групп, присутствующих в ВТМ, таких как белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, углеводы и тому подобное, включают: гидрокси, амино, сульфгидрил, карбонил (включая альдегид и кетон) и тиофосфат. Подходящие группы Q^a могут быть выбраны из: карбоксила; активированных сложных эфиров; изотиоцианата; малеимида; галогенацетамида; гидразида; винилсульфона, дихлортриазина и фосфорамидита. Предпочтительно Q^a представляет собой: активированный сложный эфир карбоновой кислоты, изотиоцианат, малеимид или галогенацетамид.

Когда комплементарная группа представляет собой амин или гидроксил, Q^a предпочтительно представляет собой активированный сложный эфир, где предпочтительные такие сложные эфиры описаны выше. Предпочтительный такой заместитель по Cy^D представляет собой активированный сложный эфир 5-карбоксипентильной группы. Когда комплементарная группа представляет собой тиол, Q^a предпочтительно представляет собой малеимид или иодоацетамидную группу.

Общие способы конъюгирования цианиновых красителей с биологическими молекулами описаны Licha et al. [Topics Curr. Chem., 222, 1-29 (2002); Adv. Drug Deliv. Rev., 57, 1087-1108 (2005)]. Пептид, белок или олигонуклеотидные субстраты для применения в данном изобретении могут быть мечеными по концевому положению или, альтернативно, по одному или более, чем одному внутреннему положению. Для обзора и примеров мечения белков с использованием реагентов для введения метки на основе флуоресцентного красителя см. "Non-Radioactive Labelling a Practical Introduction", Garman, A.J. Academic Press, 1997; "Bioconjugation - Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", Aslam, M. and Dent, A., Macmillan Reference Ltd, (1998). Протоколы доступны для получения сайт-специфического мечения в синтезированном пептиде, например, см. Hermanson, G.T., "Bioconjugate Techniques", Academic Press (1996).

Предпочтительно, способ получения агента визуализации включает одно из следующего:

(1) взаимодействие функциональной группы ВТМ, представляющей собой амин, с соединением формулы Y¹-(L)_n-[Cy^D]; или

(2) взаимодействие функциональной группы ВТМ, представляющей собой карбоновую кислоту или активированный сложный эфир, с соединением формулы Y²-(L)_n-[Cy^D];

(3) взаимодействие тиоловой группы ВТМ с соединением формулы

Y³-(L)_n-[Cy^D];

где ВТМ, M^IG, L, n и Cy^D являются такими, как определено выше, и

Y¹ представляет собой карбоновую кислоту, активированный сложный эфир, изотиоцианатную или тиоцианатную группу;

Y² представляет собой аминогруппу;

Y³ представляет собой малеимидную группу.

Y² предпочтительно представляет собой первичную или вторичную аминогруппу, наиболее предпочтительно первичную аминогруппу. На стадии (3) тиоловая группа ВТМ предпочтительно является производной остатка цистеина.

На стадиях (1)-(3) ВТМ возможно может иметь другие функциональные группы, которые могут потенциально взаимодействовать с производным Cy^D, защищенным подходящими защитными группами, так что химическое взаимодействие происходит избирательно по единственному желательному сайту. Термин "защитная группа" означает группу, которая ингибирует или подавляет нежелательные химические реакции, но которая предназначена быть достаточно реакционно-способной, так чтобы ее можно было удалить с интересующей функциональной группы в достаточно мягких условиях, которые не изменяют остальную часть молекулы. После снятия защиты получают желаемый продукт. Защитные группы для амино хорошо известны специалистам в данной области техники, и они подходящим образом выбраны из: Boc (где Boc представляет собой трет-бутоксикарбонил), Fmoc (где Fmoc представляет собой флуоренилметоксикарбонил), трифторацетил, аллилоксикарбонил, Dde [то есть 1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогексилиден)-этил] или Npys (то есть 3-нитро-2-пиридинсульфенил). Подходящие защитные группы для тиола представляют собой Trt (тритил), Аст (ацетамидометил), t-Bu (трет-бутил), трет-бутилтио, метоксибензил, метилбензил или Npys (3-нитро-2-пиридинсульфенил). Использование других защитных групп описано в "Protective Groups in Organic Synthesis", Theorodora W.Greene и Peter G.M.Wuts, (JohnWiley & Sons, 1991). Предпочтительные защитные группы для амино представляют собой Boc и Fmoc, наиболее предпочтительно Boc. Предпочтительные защитные группы для амино представляют собой Trt и Аст.

Цианиновые красители (Cy^D), функционализированные подходящим образом для конъюгации с пептидами, имеются в продаже от GE Healthcare Limited, Atto-Tec, Dyomics, Molecular Probes и других. Большинство таких красителей доступны в виде NHS сложных эфиров. Alexa Fluor™ 647, функционализированные гидразидом, малеимидом или сукцинимидиловыми сложноэфирными группами, имеются в продаже от Molecular Probes. Cy^D, функционализированные по положению R³ карбоксильными или малеимидными группами, могут быть получены способом, аналогичным описанному в ЕР 1816475 А1.

Способы конъюгирования оптических репортерных красителей с аминокислотами и пептидами описаны Licha (см. выше), а также Flanagan et al. [Bioconj. Chem., 8, 751-756 (1997)]; Lin et al. [там же, 13, 605-610 (2002)] и Zaheer [Mol. Imaging, 1(4), 354-364 (2002)]. В способах конъюгирования линкерной группы (L) с ВТМ используют химические реакции, аналогичные используемым для красителей в отдельности (см. выше), и они известны в данной области техники.

Красители формулы III описаны в пятом аспекте ниже.

Во втором аспекте настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая агент визуализации по первому аспекту вместе с биосовместимым носителем, в форме, подходящей для введения млекопитающему.

"Биосовместимый носитель" представляет собой жидкость, в частности жидкость, в которой агент визуализации может быть суспендирован или растворен, так чтобы композиция была физиологически переносимой, то есть могла быть введена в организм млекопитающего без проявления токсичности или чрезмерного дискомфорта. Биосовместимый носитель представляет собой подходящим образом инъецируемый жидкий носитель, такой как стерильная апирогенная вода для инъекций; водный раствор, такой как физиологический раствор (который может быть преимущественно отрегулирован так, чтобы конечный продукт для инъекции был изотоническим); водный раствор одного или более чем одного вещества, регулирующего тоничность (например, соли катионов плазмы с биосовместимыми противоионами), сахара (например, глюкоза или сахароза), сахарные спирты (например, сорбит или маннит), гликоли (например, глицерин) или другие неионные полиолы (например, полиэтиленгликоли, пропиленгликоли и тому подобное). Предпочтительно, биосовместимый носитель представляет собой апирогенную воду для инъекций или изотонический физиологический раствор.

Агенты визуализации и биосовместимый носитель каждый предложены в подходящих флаконах или сосудах, включающих герметичный контейнер, который обеспечивает поддержание стерильной целостности и/или радиоактивной безопасности, а также, возможно, инертный газ в свободном пространстве над продуктом (например, азот или аргон), в то же время обеспечивая возможность добавления и извлечения растворов шприцом или канюлей. Предпочтительный такой контейнер представляет собой закрытый герметичной мембраной флакон, где газонепроницаемая крышка прижата дополнительным укупорочным средством (как правило, алюминиевым). Указанная крышка является подходящей для прокалывания шприцом или многократного прокалывания иглой для подкожных инъекций (например, герметичная крышка с прижатой мембраной), в то же время сохраняя стерильную целостность. Такие контейнеры имеют дополнительное преимущество в том, что крышка может выдерживать вакуум при необходимости (например, для смены газа в свободном пространстве над продуктом или дегазации растворов) и выдерживать изменения давления, такие как падения давления, не давая возможности при этом проникновения внешних атмосферных газов, таких как кислород или пары воды.

Предпочтительные многодозовые контейнеры включают флакон с единым содержимым (например, объемом от 10 до 30 см³), который содержит множество доз для пациента, причем разовые дозы для пациента могут таким образом быть извлечены в шприцы для клинического использования в различные интервалы времени в течение приемлемого срока годности препарата в соответствии с данной клинической ситуацией. Предварительно заполненные шприцы разработаны для содержания однократной дозы для человека, или "стандартной дозы", и таким образом предпочтительно представляют собой одноразовые или другие шприцы, подходящие для клинического применения. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению предпочтительно имеют дозировку, подходящую для индивидуального пациента, и предложены в подходящем шприце или контейнере, как описано выше.

Фармацевтическая композиция возможно может содержать дополнительные эксципиенты, такие как противомикробный консервант, pH-регулирующий агент, наполнитель, стабилизатор или агент, регулирующий осмоляльность. Термин "противомикробный консервант" означает агент, ингибирующий рост потенциально вредных микроорганизмов, таких как бактерии, дрожжи или плесневые грибы. Противомикробный консервант может также проявлять некоторые бактерицидные свойства в зависимости от используемой дозировки. Основная роль противомикробного(ых) консерванта(ов) по настоящему изобретению заключается в том, чтобы ингибировать рост любого такого микроорганизма в фармацевтической композиции. Однако противомикробный консервант возможно также может быть использован для ингибирования роста потенциально вредных микроорганизмов в одном или более чем одном компоненте наборов, используемых для приготовления указанной композиции перед введением. Подходящие противомикробные консерванты включают: парабены, то есть метил-, этил-, пропил- или бутилпарабен или их смеси; бензиловый спирт; фенол; крезол; цетримид и тиомерсал. Предпочтительные противомикробные консерванты представляют собой парабены.

Термин "pH-регулирующий агент" означает соединение или смесь соединений, применяемых для обеспечения того, чтобы значение pH композиции находилось в пределах приемлемых границ (приблизительно pH от 4,0 до 10,5) для введения человеку или млекопитающему. Подходящие такие pH-регулирующие агенты включают фармацевтически приемлемые буферы, такие как трициновый, фосфатный или TRIS [то есть трис(гидроксиметил)-аминометан], и фармацевтически приемлемые основания, такие как карбонат натрия, бикарбонат натрия или их смеси. Когда композицию используют в форме набора, pH-регулирующий агент возможно может быть предложен в отдельном флаконе или контейнере, так чтобы пользователь данного набора мог регулировать значение pH как часть многостадийной процедуры.

Термин "наполнитель" означает фармацевтически приемлемый наполняющий агент, который может облегчить обработку материала во время производства и лиофилизации. Подходящие наполнители включают неорганические соли, такие как хлорид натрия, и водорастворимые сахара или сахарные спирты, такие как сахароза, мальтоза, маннит или трегалоза.

Фармацевтические композиции по второму аспекту могут быть изготовлены в асептических условиях производства (например, стерильной комнате) с получением желаемого стерильного апирогенного продукта. Предпочтительно, когда ключевые компоненты, особенно ассоциированные реагенты, а также те части оборудования, которые вступают в контакт с агентом визуализации (например, флаконы), были стерильными. Компоненты и реагенты могут быть стерилизованы способами, известными в данной области техники, включая: стерильную фильтрацию, терминальную стерилизацию с использованием, например, гамма-облучения, автоклавирования, сухого нагрева или химической обработки (например, этиленоксидом). Предпочтительно стерилизовать некоторые компоненты заранее, так чтобы требовалось осуществлять минимальное количество манипуляций. Однако в качестве меры предосторожности предпочтительно включать по меньшей мере стадию стерильной фильтрации в качестве конечной стадии в изготовление фармацевтической композиции.

Фармацевтическая композиция по второму аспекту предпочтительно приготовлена из набора, как описано для третьего аспекта ниже.

В третьем аспекте настоящего изобретения предложен набор для приготовления фармацевтической композиции по второму аспекту, содержащий агент визуализации по первому аспекту в стерильной твердой форме, так что после разбавления стерильной добавкой биосовместимого носителя по второму аспекту происходящее растворение дает желаемую фармацевтическую композицию.

В этом отношении агент визуализации и другие возможные эксципиенты, как описано выше, могут быть предложены в виде лиофилизированного порошка в подходящем флаконе или контейнере. В таком случае агент предназначен для разведения желаемым биосовместимым носителем с получением фармацевтической композиции в стерильной апирогенной форме, готовой для введения млекопитающему.

Предпочтительная стерильная твердая форма агента визуализации представляет собой лиофилизированное твердое вещество. Стерильная твердая форма предпочтительно предложена в контейнере фармацевтической категории, как описано для фармацевтической композиции (выше). Когда набор лиофилизирован, препарат возможно может содержать криопротектор, выбранный из сахарида, предпочтительно маннита, мальтозы или трицина.

В четвертом аспекте настоящего изобретения предложен конъюгат формулы Ia:

где ВТМ, L и n являются такими, как определено для первого аспекта, и Cy^D представлен формулой IIIa:

где:

R⁹-R¹² независимо представляют собой группы R^a и R^c и выбраны таким образом, что

один из R⁹ и R¹⁰ представляет собой группу R^a, а каждый другой представляет собой группу R^c, где R^c представляет собой C_1-2алкил;

R^a, R^b и М¹ являются такими, как определено для формулы III.

Предпочтительные воплощения формулы IIIa в конъюгате являются такими, как определено выше.

Конъюгаты по четвертому аспекту полезны в получении агентов визуализации и фармацевтических композиций, имеющих предпочтительные цианиновые красители формулы IIIa. Предпочтительные аспекты ВТМ, L, n и красителя формулы IIIa являются такими, как описано выше. Конъюгаты могут быть получены, как описано в первом и пятом аспектах.

В пятом аспекте настоящего изобретения предложен цианиновый краситель формулы IIIa, как определено в четвертом аспекте. Красители по пятому аспекту полезны в получении ВТМ-конъюгатов, агентов визуализации и фармацевтических композиций, имеющих предпочтительные цианиновые красители формулы IIIa.

Предпочтительные аспекты цианинового красителя формулы IIIa являются такими, как описано выше. Красители предпочтительно дополнительно содержат группу Q^a, где Q^a представляет собой реакционно-способную функциональную группу, подходящую для конъюгации с ВТМ. Подходящие и предпочтительные группы Q^a являются такими, как описано выше. Красители формулы IIIa могут быть получены, как описано для Cy5^** в Примере 3. Такие красители, включающие группы Q^a, где Q^a представляет собой активный сложный эфир, могут быть получены согласно Примеру 4.

В шестом аспекте настоящего изобретения предложен способ оптической визуализации in vivo организма млекопитающего, включающий использование агента визуализации по первому аспекту или фармацевтической композиции по второму аспекту с получением изображений сайтов локализации ВТМ in vivo.

Термин "оптическая визуализация" означает любой способ, в котором получают изображение для детектирования, определения стадии заболевания или диагностики заболевания, отслеживания развития заболевания или для отслеживания лечения заболевания, на основе взаимодействия со светом в области спектра от зеленой до ближней инфракрасной (длина волны 500-1200 нм). Оптическая визуализация дополнительно включает все способы от прямой визуализации без использования какого-либо устройства и включая использование устройств, таких как различные видеоизмерительные приборы, катетеры и оборудование для оптической визуализации, например автоматизированное оборудование для томографических изображений. Средства и способы измерений включают: люминесцентную визуализацию; эндоскопию; флуоресцентную эндоскопию; оптическую когерентную томографию; визуализацию по коэффициенту пропускания; регулируемую по времени визуализацию по коэффициенту пропускания; конфокальную визуализацию; нелинейную микроскопию; фотоакустическую визуализацию; акустооптическую визуализацию; спектроскопию; отражательную спектроскопию; интерферометрию; когерентную интерферометрию; диффузную оптическую томографию и опосредованную флуоресценцией диффузную оптическую томографию (системы, работающие в непрерывном режиме, временные и частотные системы) и измерение светорассеяния, поглощения, поляризации, люминесценции, времени жизни флуоресценции, квантового выхода и гашения флуоресценции, но не ограничены ими. Дополнительные подробности этих методик предложены в: (Tuan Vo-Dinh (редактор): "Biomedical Photonics Handbook" (2003), CRC Press LCC; Mycek & Pogue (редакторы): "Handbook of Biomedical Fluorescence" (2003), Marcel Dekker, Inc.; Splinter & Hopper: "An Introduction to Biomedical Optics" (2007), CRC Press LCC.

Область спектра от зеленой до ближней инфракрасной подходящим образом представлена длинами волн 500-1200 нм, предпочтительно длинами волн 600-1000 нм. Способ оптической визуализации предпочтительно представляет собой флуоресцентную эндоскопию. Организм млекопитающего по шестому аспекту предпочтительно представляет собой организм человека. Предпочтительные воплощения агента визуализации являются такими, как описано для первого аспекта (выше). В частности, предпочтительно, когда используемый краситель Cy^D является флуоресцентным.

В способе по шестому аспекту агент визуализации или фармацевтическую композицию предпочтительно предварительно вводят в указанный организм млекопитающего. Термин "предварительно вводят" означает, что данная стадия, включающая участие лечащего врача, который дает агент визуализации пациенту, например, в виде внутривенной инъекции, уже была осуществлена до визуализации. Это воплощение включает использование агента визуализации по первому воплощению для производства диагностического агента для диагностической визуализации in vivo болезненных состояний организма млекопитающего, в которые вовлечена ВТМ.

Предпочтительный способ оптической визуализации по шестому аспекту представляет собой флуоресцентную отражательную визуализацию (Fluorescence Reflectance Imaging, FRI). При FRI агент визуализации по настоящему изобретению вводят субъекту, подлежащему диагностике, и затем поверхность ткани субъекта просвечивают возбуждающим светом, как правило, с возбуждением незатухающих волн (CW). Свет возбуждает краситель Cy^D агента визуализации. Флуоресценцию от агента визуализации, которая генерируется возбуждающим светом, детектируют с использованием детектора флуоресценции. Отраженный свет предпочтительно фильтруют для отделения флуоресцентного компонента (исключительно или частично). На основе флуоресцентного свечения формируют изображение. Как правило, проводят минимальную обработку (не используя процессор для расчета оптических параметров, таких как время жизни, квантовый выход и другие), и данное изображение отображает интенсивность флуоресценции. Агент визуализации предназначен для концентрирования в пораженной области, вызывая более высокую интенсивность флуоресценции. Таким образом, болезненная область дает положительный контраст в картине интенсивности флуоресценции. Изображение предпочтительно получают с использованием ПЗС-камеры или чипа, так что возможна визуализация в режиме реального времени.

Длину волны возбуждения варьируют в зависимости от конкретного используемого красителя Cy^D, но, как правило, она находится в диапазоне 500-1200 нм для красителей по настоящему изобретению. Оборудование для генерирования возбуждающего света может представлять собой традиционный источник возбуждающего света, такой как: лазер (например, ионный лазер, лазер на красителях или полупроводниковый лазер); источник галогенового света или источник ксенонового света. Различные оптические фильтры возможно могут быть использованы для получения оптимальной длины волны возбуждения.

Предпочтительный способ FRI включает следующие стадии:

(1) поверхность интересующей ткани в организме млекопитающего просвечивают возбуждающим светом;

(2) используя детектор флуоресценции, детектируют флуоресценцию от агента визуализации, генерируемую путем возбуждения Cy^D;

(3) свет, детектируемый детектором флуоресценции, возможно фильтруют для отделения флуоресцентного компонента;

(4) из флуоресцентного свечения на стадиях (2) или (3) формируют изображение указанной поверхности интересующей ткани.

На стадии (1) возбуждающий свет предпочтительно представляет собой незатухающую волну (CW) по природе. На стадии (3) детектируемый свет предпочтительно фильтруют. Особенно предпочтительный способ FRI представляет собой флуоресцентную эндоскопию.

В альтернативном способе визуализации по шестому аспекту используют миграцию фотонов в частотной области (frequency-domain photon migration FDPM). Это имеет преимущества перед способами, использующими незатухающую волну (CW), где важна более глубокая степень детектирования красителя в ткани [Sevick-Muraca et al. Curr. Opin. Chem. Biol., 6, 642-650 (2002)]. Для такой частотной/временной визуализации предпочтительно, если Cy^D имеет флуоресцентные свойства, которые можно модулировать в зависимости от глубины поражения ткани, подлежащей визуализации, и типа используемого оборудования.

Способ FDPM осуществляют следующим образом:

(а) светорассеивающую биологическую ткань указанного организма млекопитающего, имеющую гетерогенный состав, подвергают воздействию света от источника света с заранее установленной варьируемой по времени интенсивностью для возбуждения агента визуализации, при котором наблюдают многократное рассеяние возбуждающего света в указанной ткани;

(б) детектируют многократно рассеянное световое излучение от ткани в ответ на указанное воздействие;

(в) проводят количественное определение параметра флуоресценции по всей ткани на основании этого излучения путем установления ряда показателей с использованием процессора, где каждый из показателей соответствует уровню параметра флуоресценции в различных положениях в пределах этой ткани, где данный уровень параметра флуоресценции варьирует согласно гетерогенному составу этой ткани; и

(г) генерируют изображение этой ткани путем построения изображений гетерогенного состава ткани в соответствии с показателями стадии (в).

Параметр флуоресценции стадии (в) предпочтительно соответствует захвату агента визуализации и предпочтительно дополнительно включает сопоставление ряда количественных показателей в соответствии с коэффициентами поглощения и рассеяния в данной ткани до введения агента визуализации. Параметр флуоресценции стадии (в) предпочтительно соответствует по меньшей мере одному из следующих: времени жизни флуоресценции, квантовому выходу флуоресценции, выходу флуоресценции и захвату агента визуализации. Параметр флуоресценции предпочтительно не зависит от интенсивности испускания и не зависит от концентрации агента визуализации.

Количественное определение на стадии (в) предпочтительно включает:

(1) установление оценочного показателя, (2) определение рассчитанного испускания как функции данного оценочного показателя, (3) сравнение рассчитанного испускания с испусканием при указанном детектировании для определения ошибки, (4) предложение модифицированного оценочного показателя флуоресценции как функции ошибки. Количественное определение предпочтительно включает определение показателей на основе математической зависимости, моделирующей поведение многократного рассеяния света данной тканью. Способ по первому варианту предпочтительно дополнительно включает мониторинг метаболического свойства ткани in vivo путем детектирования варьирования указанного параметра флуоресценции.

Оптическую визуализацию по шестому аспекту предпочтительно используют для облегчения тактики ведения болезненного состояния организма млекопитающего. Термин "тактика ведения больных" означает использование в: детектировании, определении стадии заболевания, диагностике, мониторинге прогрессирования заболевания или мониторинге лечения. Болезненное состояние соответственно представляет собой состояние, в которое вовлечена ВТМ агента визуализации. Применения визуализации предпочтительно включают визуализацию поверхности с использованием камеры, эндоскопию и хирургическое проведение. Дополнительные подробности подходящих способов оптической визуализации рассмотрены Sevick-Muraca et al. [Curr. Opin. Chem. Biol., 6, 642-650 (2002)].

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложен способ детектирования, определения стадии заболевания, диагностики заболевания, мониторинга прогрессирования заболевания или мониторинга лечения болезненного состояния организма млекопитающего, включающий способ оптической визуализации in vivo по шестому аспекту.

Данное изобретение проиллюстрировано неограничивающими Примерами, подробно описанными ниже. В Примерах 1а и 2 приведен синтез Соединений 1 и 3, соответственно, которые являются сравнительными Примерами родственных красителей, не входящих в объем формулы настоящего изобретения. В Примере 16 приведен синтез Соединения 2, которое представляет собой конъюгат красителя с контрольным пептидом (скремблированный RGD). В Примере 3 приведен синтез цианинового красителя Cy5^**, предпочтительного Cy^D согласно изобретению. В Примере 4 приведен синтез активного сложного эфира Cy5^**. В Примере 5 приведен синтез Соединения 4 пептидного конъюгата Cy5^**. В Примере 6 приведен синтез Соединения 6 пептидного конъюгата Alexa647. В Примере 7 приведены данные стабильности в плазме крови Соединений 1-8. Все конъюгаты проявили удовлетворительную стабильность в плазме крови за исключением Соединений 5 и 7 (46 и 70% от главного пика слева через 4 часа инкубации в плазме крови соответственно).

В Примере 8 приведены данные РРВ для соединений по изобретению. Самые высокие значения РРВ наблюдали для Соединений 3 и 7, а самые низкие для Соединений 4 и 6. В Примере 9 приведены данные по связыванию коллагена для Соединений 1-8. Большинство соединений показало высокую степень связывания в низких концентрациях, причем Соединения 4 и 6 проявили самое низкое связывание с коллагеном. В Примере 10 приведены данные анализа связывания для Соединений 1-8. Все из них проявили подобные значения Ki в суб-nM диапазоне за исключением Соединения 7, которое показывает слегка более высокое значение Ki, и Соединения 2 (скремблированный отрицательный контроль). Это демонстрирует то, что свойства биологического связывания сохраняются для RGD-пептида, несмотря на конъюгирование с цианиновым красителем, и что это остается справедливым для ряда цианиновых красителей. В Примере 11 приведены данные визуализации in vivo для Соединений 1-8. Программное обеспечение данного анализа предусматривает простое экспоненциальное вымывание красителя. Оцененные времена вымывания, как обнаружено, были неточными, в частности, для сигналов от кожи и мышц, где они по всей вероятности занижены. Это, как полагают, происходит из-за связывания RGD с интегринами и, возможно, коллагеном в фоновой ткани, давая кажущиеся характеристики двойного экспоненциального вымывания. Более медленное накопление и вымывание из опухоли по сравнению с мышцей считали благоприятным. Отрицательный контроль (Соединение 2) показал аналогичные кинетические параметры в опухоли и сравнительных тканях, указывая на то, что наблюдаемые различия с положительными соединениями происходят ввиду нацеливания и отсутствия эффектов перфузии. Соединение 6, как считают, имело наиболее благоприятные кинетические параметры визуализации.

Таблица 2
Соединения по изобретению
Соединение	Краситель	Вектор
1	Cy5(2)	RGD
2	Cy5(2)	neg-RGD
3	Cy5(1)	RGD
4	Cy5**	RGD
5	Cy5*В	RGD
6	Alexa647	RGD
7	Cy5*F	RGD
8	Cy5-PEG	RGD

где:

используемый RGD-пептид дан в Примере 1,

neg-RGD представляет собой скремблированный RGD-пептид, описанный в Примере 1б,

структуры красителя даны в Таблице 3.

Таблица 3
Структуры цианиновых красителей из Примеров
Таблица 3	Название красителя
	Cy5(1)	Cy5(2)	Cy5*В	Cy5*F	Cy5PEG	Cy5**	Alexa647
R11	Н	SO3H	SO3H	4×F	SO3H	SO3H	SO3H
R12	SO3H	SО3H	SO3H	4×F	SO3H	SO3H	SO3H
R13	СН3	СН3	СН3	СН3	СН3	СН3	Rf
R14	СН3	СН3	Re	Re	СН3	СН3	СН3
R15	СН3	СН3	СН3	СН3	СН3	СН3	СН3
R16	СН3	СН3	Re	Re	СН3	Re	СН3
R17	Rf	Rf	Rf	Re	Et	Rf	Rd
R18	СН3	Et	бензил	Rf	Rp	Re	Rd

где: Cy5(1), Cy5(2), Cy5^*В, Cy5^*F и Cy5PEG являются сравнительными примерами,

R^d представляет собой -(СН₂)₃SO₃H, R^e представляет собой -(СН₂)₄SO₃H, и R^f представляет собой -(СН₂)₅CO₂H;

R^p представляет собой -(СН₂)₅CONH(CH₂CH₂O)₃CH₂CH₂NHCOCH₂OCH₂CO₂H.

Сокращения

Использованы общепринятые однобуквенные или 3-буквенные сокращения аминокислот.

Acm:	ацетамидометил
ACN:	ацетонитрил
Boc:	трет-бутилоксикарбонил
DMF:	N,N'-диметилформамид
DMSO:	диметилсульфоксид
Fmoc:	9-флуоренилметоксикарбонил
HCl:	соляная кислота
ВЭЖХ:	высокоэффективная жидкостная хроматография
HSPyU	гексафторфосфат O-(N-сукцинимидил)-N,N,N',N'-тетраметиленурония
Ile:	изолейцин
LC-MS:	жидкостная хроматография - масс-спектрометрия
NHS:	N-гидрокси-сукцинимид
NMM:	N-метилморфолин
NMP:	1-метил-2-пирролидинон
Pbf:	2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил
PBS:	забуференный фосфатом физиологический раствор
PPB:	связывание с белками плазмы
TFA:	трифторуксусная кислота
Trt:	тритил
TSTU:	тетрафторборат O-(N-сукцинимидил)-N,N,N',N'-тетраметилурония

Пример 1а: Синтез конъюгата с красителем RGD-[Cy5(2)] (Соединение 1, сравнительный пример)

RGD-пептид (WO 2005/123768; 24 мг, 0,02 ммоль) добавляли в виде твердого вещества к раствору моно-NHS-эфира Cy5(2) (GE Healthcare, номер по каталогу РА15104; 7,5 мг, 0,01 ммоль) в DMF (2 мл) и затем добавляли NMM (0,01 мл, 0,09 ммоль). Эту реакционную смесь оставляли для протекания реакции в течение ночи, не допуская воздействия света. DMF выпаривали при пониженном давлении, и неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой препаративной хроматографией (колонка Vydac C18, 218ТР1022; растворители: А представляет собой смесь вода/0,1% TFA, и В представляет собой смесь CH₃CN/0,1% TFA; градиент 10-30% В в течение 60 мин; скорость потока 10 мл/мин; детектирование при 254 нм), с получением 6,6 мг (37%) чистого продукта (аналитическая ВЭЖХ: колонка Phenomenex Luna C18, 00G-4252-E0; растворители: А представляет собой смесь вода/0,1% TFA, и В представляет собой смесь CH₃CN/0,1% TFA; градиент 15-35% В в течение 20 мин; скорость потока 1,0 мл/мин; время удерживания 19,5 мин; детектирование при 214 и 254 нм). Дополнительную характеристику осуществляли с использованием масс-спектрометрии с получением значения m/z 949,1 [МН²⁺].

Пример 1б: Синтез конъюгата с красителем neg-RGD-[Cy5(2)] (Соединение 2, сравнительный пример)

Neg-RGD-пептид, содержащий пептидную последовательность Lys-Cys-Gly-Asp-Phe-Cys-Arg-Cys, получали, как описано для RDG-пептида (WO 2005/123768). Конъюгат с красителем neg-RGD-[Cy5(2)] получали, как описано в Примере 1. Неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой препаративной хроматографией (Phenomenex Luna 5µ C18 (2) 250×21,20 мм; растворители: А представляет собой смесь вода/0,1% TFA, и В представляет собой смесь CH₃CN/0,1% TFA; градиент 20-30% В в течение 40 мин; скорость потока 10 мл/мин; детектирование при 214 нм) с получением 4,1 мг указанного в заголовке соединения (аналитическая ВЭЖХ: колонка Phenomenex Luna 3µ C18 (2) 20×2 мм; растворители: А представляет собой смесь вода/0,1% TFA, и В представляет собой смесь CH₃CN/0,1% TFA; градиент 10-40% В в течение 20 мин; скорость потока 1,0 мл/мин; время удерживания 3,23 мин; детектирование при 214 и 254 нм). Дополнительную характеристику осуществляли с использованием масс-спектрометрии с получением значения m/z 1895,6 [М⁺].

Пример 2: Синтез конъюгата с красителем RGD-Cy5(1) (Соединение 3, сравнительный пример)

NHS-эфир Су5(1) (4,5 мг, 0,008 ммоль) образовали путем обработки Cy5(1) с TSTU (2,1 мг, 0,0076 ммоль) и NMM (0,009 мл, 0,08 ммоль) в DMF (2 мл) в течение 1 часа. Этот раствор затем добавляли к RGD-пептиду (Пример 1; 20 мг, 0,016 ммоль) и реакционную смесь оставляли для протекания реакции в течение ночи, не допуская воздействия света. DMF выпаривали при пониженном давлении и неочищенный продукт очищали обращенно-фазовой препаративной хроматографией (колонка Vydac C18, 218ТР1022; растворители: А представляет собой смесь вода/0,1% TFA, и В представляет собой смесь CH₃CN/0,1% TFA; градиент 20-40% В в течение 60 мин; скорость потока 10 мл/мин; детектирование при 254 нм) с получением 4,9 мг (34%) чистого продукта (аналитическая ВЭЖХ: колонка Phenomenex Luna C18, 00G-4252-E0; растворители: А представляет собой смесь вода/0,1% TFA, и В представляет собой смесь CH₃CN/0,1% TFA; градиент 25-45% В в течение 20 мин; скорость потока 1,0 мл/мин; время удерживания 15,2 мин; детектирование при 214 и 254 нм). Дополнительную характеристику осуществляли с использованием масс-спектрометрии с получением значения m/z 902,1 [МН²⁺].

Пример 3: Синтез цианинового красителя 2-{(1Е,3Е,5Е)-5-[1-(5-карбоксипентил)-3,3-диметил-5-сульфо-1,3-дигидро-2H-индол-2-илиден]-пента-1,3-диенил}-3-метил-1,3-бис(4-сульфобутил)-3Н-индолий-5-сульфоната (Cy5^**)

Cy5**

(3а) 5-Метил-6-оксопентан-1-сульфоновая кислота

К суспензии гидрида натрия (12,0 г, 60% NaH в минеральном масле) в DMF (100 мл) добавляли по каплям этил-2-метилацетоацетат (50 г) в DMF (25 мл) при охлаждении на ледяной бане в течение 1 часа (внутренняя температура 0-4°С). Эту смесь оставляли нагреваться до температуры окружающей среды в течение 45 мин при перемешивании, а затем снова охлаждали. Затем добавляли по каплям в течение 15 минут раствор 1,4-бутансультона (45 г) в DMF (25 мл). Конечную смесь нагревали при 60°С в течение 18 часов. Растворитель удаляли выпариванием на роторном испарителе и остаток распределяли между водой и диэтиловым эфиром. Водный слой собирали, промывали свежей порцией диэтилового эфира и подвергали роторному испарению с получением клейкой пены. Это промежуточное вещество растворяли в воде (100 мл) и добавляли гидроксид натрия (17,8 г) в течение 15 минут при перемешивании. Эту смесь нагревали при 90°С в течение 18 часов. Значение pH охлажденной реакционной смеси доводили до ~pH 2 добавлением концентрированной соляной кислоты (~40 мл). Раствор подвергали упариванию на роторном испарителе и сушили в вакууме. Желтое твердое вещество промывали этанолом, содержащим 2% соляной кислоты (3×150 мл). Этанольный раствор фильтровали, упаривали на роторном испарителе и сушили в вакууме с получением желтого твердого вещества. Выход 70 г.

(3б) Дикалиевая соль 2,3-диметил-3-(4-сульфобутил)-3Н-индол-5-сульфоновой кислоты

4-Гидразинобензолсульфоновую кислоту (40 г), 5-метил-6-оксогептан-1-сульфоновую кислоту (из 3а; 60 г) и уксусную кислоту (500 мл) смешивали и кипятили с обратным холодильником в течение 6 часов. Растворитель отфильтровывали, выпаривали на роторном испарителе и сушили в вакууме. Твердое вещество растворяли в метаноле (1 л). К нему добавляли 2М метанольный гидроксид калия (300 мл). Эту смесь перемешивали в течение 3 часов и затем объем растворителя сокращали на 50%, используя роторное испарение. Полученный осадок отфильтровывали, промывали метанолом и сушили в вакууме. Выход 60 г. MS (LCMS): МН⁺ 362. Acc. Mass: Обнаружено 362,0729. MH⁺=C₁₄H₂₀NO₆S₂ требует m/z 362,0732 (-0,8 млн^-1).

(3в) Дикалиевая соль 2,3-диметил-1,3-бис(4-сульфобутил)-3Н-индолий-5-сульфоната

2,3-Диметил-3-(4-сульфобутил)-3H-индол-5-сульфоновую кислоту (из 3б; 60 г) нагревали с 1,4-бутансультоном (180 г) и тетраметиленсульфоном (146 мл) при 140°С в течение 16 часов. Полученное красное твердое вещество промывали диэтиловым эфиром, растирали в порошок и сушили в вакууме. Выход 60 г.

(3 г) Cy5^** в виде TFA соли

K⁺-соль 1-(5'-карбоксипентил)-2,3,3-триметил-индолийбромид-5-сульфоновой кислоты (2,7 г), моногидрохлорид бис(фенилимин)малонового альдегида (960 мг), уксусный ангидрид (36 мл) и уксусную кислоту (18 мл) нагревали при 120°С в течение 1 часа с получением темно-коричнево-красного раствора. Эту реакционную смесь охлаждали до температуры окружающей среды. К этой смеси добавляли 2,3-диметил-1,3-бис(4-сульфобутил)-3Н-индолий-5-сульфонат (из 3в; 8,1 г) и ацетат калия (4,5 г) и перемешивали в течение 18 часов при температуре окружающей среды. Полученный синий раствор осаждали с использованием этилацетата и сушили в вакууме. Неочищенный краситель очищали посредством жидкостной хроматографии (RPC₁₈. градиент вода + 0,1% TFA/MeCN + 0,1% TFA). Фракции, содержащие основной пик красителя, собирали, объединяли и упаривали в вакууме с получением указанного в заголовке красителя, 2 г. УФ/Vis (вода + 0,1% TFA): 650 нм. MS (времяпролетная масс-спектрометрия с ионизацией методом лазерной десорбции из матрицы (MALDI-TOF)): MH+887,1. MH⁺=C₃₈H₅₀N₂O₁₄S₄ требует m/z 887,1.

Пример 4: Синтез диизопропилэтиламинной соли 2-[(1Е,3Е,5Е)-5-(1-{6-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-3,3-диметил-5-сульфо-1,3-дигидро-2H-индол-2-илиден)пента-1,3-диенил]-3-метил-1,3-бис(4-сульфобутил)-3H-индолий-5-сульфоната (NHS сложный эфир Cy5**)

Cy5** (Пример 3; 10 мг) растворяли в безводном DMSO (3 мл); к нему добавляли HSPyU (20 мг) и N,N'-диизопропилэтиламин (80 мкл). Полученный раствор перемешивали в течение 3 часов, по окончании которых TLC (RPC18 вода/MeCN) выявила завершение реакции. Краситель выделяли путем осаждения в этилацетате/диэтиловом эфире, отфильтровывали, промывали этилацетатом и сушили в вакууме. УФ/Vis (вода) 650 нм. MS (MALDI-TOF) MH+983,5. MH⁺=C₄₂H₅₃N₃O₁₆S₄ требует m/z 984,16.

Пример 5: Синтез конъюгата с красителем RGD-Cy5** (Соединение 4)

Раствор NHS эфира Cy5** (2 мг, из Примера 4) и сим-коллидина (2 мкл), растворенного в NMP (1 мл), добавляли по каплям к раствору RGD-пептида (из Примера 1, 6,4 мг) и сим-коллидина (2 мкл), растворенного в DMF (1 мл), и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Эту смесь затем разбавляли смесью 10% ACN/вода/0,1% TFA (6 мл), и продукт очищали с использованием препаративной ВЭЖХ (колонка Phenomenex Luna 5µ C18 (2) 250×21,20 мм; растворители: А представляет собой смесь вода/0,1% TFA, и В представляет собой смесь CH₃CN/0,1% TFA; градиент 10-20% В в течение 40 мин; скорость потока 10 мл/мин; детектирование при 214 нм) с получением 2,3 мг (72%) чистого продукта (аналитическая ВЭЖХ: колонка Phenomenex Luna 3µ C18 (2) 20×2 мм; растворители: А представляет собой смесь вода/0,1% TFA, и В представляет собой смесь CH₃CN/0,1% TFA; градиент 10-40% В в течение 5 мин; скорость потока 0,6 мл/мин; время удерживания 2,28 мин; детектирование при 214 и 254 нм). Дополнительную характеристику осуществляли с использованием масс-спектрометрии с получением значения m/z 1064,5 [МН²⁺].

Пример 6: Синтез конъюгата с красителем RGD-Alexa 647 (Соединение 6)

Раствор NHS эфира Alexa Fluor 647 (2 мг, Molecular Probes A20106) и сим-коллидина (3,2 мкл), растворенного в NMP (1,4 мл), добавляли по каплям к раствору RGD-пептида (Пример 1, 15 мг) и сим-коллидина (3,2 мкл), растворенного в DMF (1 мл), и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Эту смесь затем разбавляли смесью вода/0,1% TFA (6 мл) и продукт очищали с использованием препаративной ВЭЖХ (колонка Phenomenex Luna 5µ С18 (2) 250×21,20 мм; растворители: А представляет собой вода/0,1% TFA, и В представляет собой CH₃CN/0,1% TFA; градиент 10-25% В в течение 40 мин; скорость потока 10 мл/мин; детектирование при 214 нм) с получением 2,7 мг (53%) чистого продукта (аналитическая ВЭЖХ: колонка Phenomenex Luna 3µ С18 (2) 20×2 мм; растворители: А представляет собой смесь вода/0,1% TFA, и В представляет собой смесь CH₃CN/0,1% TFA; градиент 10-40% В в течение 5 мин; скорость потока 0,6 мл/мин; время удерживания 1,99 мин; детектирование при 214 и 254 нм). Дополнительную характеристику осуществляли с использованием масс-спектрометрии с получением значения m/z 1050,4 [MH²⁺].

Пример 7: Стабильность Соединений 1-8 в плазме крови

Плазму крови мышей (нестерильную) получили от Rockland, PA, США. Эту плазму стабилизировали гепарином натрия. Вещество растворяли в PBS и плазме соответственно в концентрациях 0,1/0,2 мг/мл. Контрольные образцы (растворитель без пептида) пептида, растворенного в плазме/PBS, инкубировали при 37°С в течение 4 часов. После инкубации белки отделяли путем ультрафильтрации с использованием нестерильных Ultrafree®-MC центрифужных флаконов с вставленным фильтром Millipore Co. (Amicon). Предел отсечения фильтров составлял 30000 NMWL. Перед центрифугированием образцы плазмы разбавляли водой в соотношении 1:1. Образцы анализировали посредством ВЭЖХ с использованием визуального детектирования.

Вещество растворяли в PBS, концентрация 0,1 мг/мл. Интенсивность флуоресценции ультрацентрифугированных образцов измеряли с использованием Fluoroskan Ascent® FL, оборудованного планшет-ридером (Thermo Labsystems Oy, Finland). Длина волны возбуждения составляла 646 нм, длина волны испускания составляла 678 нм, измерения осуществляли при двух разных концентрациях вещества: 6,5 мкг/мл и 23 мкг/мл плазмы.

В данном исследовании применяли жидкостной хроматограф Ultimate 3000 micro, оборудованный УФ-Vis детектором. Раствор имеет интенсивный голубоватый цвет и хорошо поглощает при 650 нм.

Хроматографию осуществляли на колонке X-Terra RP18 2,1×150 мм, частицы 3,5 мкм, от Waters с использованием градиента элюции ацетонитрила (ACN) и фосфатного буфера (20 мМ, pH 7,1); детектирование при 650 нм; скорость потока 0,1 мл/мин; объем впрыскивания: 5 мкл. Градиент: начинали при 22% ACN в буфере с линейным возрастанием до 50% ACN в течение 12 мин; быстрым линейным возрастанием градиента до 90% ACN в течение последующих 2 мин; затем уравновешивание до исходной смеси. Общее время анализа составило 20 мин при времени удерживания для основного пика ~9 мин. Разложение/примеси наблюдались в виде изменений в чистоте основного пика. Результаты представлены в Таблице 4.

Таблица 4
Стабильность Соединений 1-8 в плазме крови
Соединение	% площади основного пика (после 4-часовой инкубации в мышиной плазме)
1	Не измеряли
2	Не измеряли
3	Не измеряли
4	100
5	46
6	100
7	70
8	93

Пример 8: Анализ поляризации флуоресценции связывания Соединений 1-8 с белками плазмы

Соединения 1-8 тестировали в анализе поляризации флуоресценции связывания с белками плазмы с использованием человеческой плазмы и буфера для анализа (PBS/0,05% Tween). 40 мкл пептида (~5 мкМ) инкубировали в 40 мкл PBS или человеческой плазмы. Поляризацию флуоресценции измеряли в планшет-ридере Tecan Safire (возб. 635/испуск. 678) и данные представляли в виде % увеличения показателя поляризации при добавлении плазмы.

Результаты представлены в Таблице 5:

Таблица 5
Обзор показателей поляризации (возб. 635 нм, испуск. 678 нм, ~2,5мкМ вещества) для Соединений 1-8
Соединение	Буфер для анализа (mP)	Плазма (mP)	Увеличение показателей поляризации (%)
1	184	218	18
2	178	217	21
3	219	298	36
4	183	209	14
5	187	227	22
6	178	199	12
7	179	232	29
8	184	215	17

Пример 9: Анализ связывания Соединений 1-8 с коллагеном

Использовали имеющиеся в продаже покрытые коллагеном 96-луночные планшеты (BD Biocoat, Art. код BDAA 356649, Becton, Dickinson Biosciences, Two Oak Park, Bedford, MA 01730). Для каждого тестируемого соединения готовили лунки в трех повторностях при 30 нМ, 100 нМ или 300 нМ (1000 нМ включали в некоторых случаях), и планшеты инкубировали в планшет-ридере в течение одного часа при 37°С при встряхивании через каждую минуту* (*Соединение 3 инкубировали при 37°С в камере нагрева при встряхивании каждые 5 минут (микропланшет с крышкой)). Объем в каждой лунке составлял 200 мкл. По окончании инкубации 150 мкл супернатанта переносили в необработанный 96-луночный планшет и считывали флуоресценцию при длинах волн возбуждения 646 нм и испускания 678 нм.

Для расчета степени связывания флуоресценцию от супернатантов сравнивали с флуоресценцией от аликвот 150 мкл с теми же самыми исходными концентрациями. Во всех случаях использовали средние значения от 3 лунок. Результаты приведены в Таблице 6.

Таблица 6
Анализ связывания с коллагеном (% связывания), возб. 646 /испуск. 678 нм
Исходная конц. (нМ)	Номер Соединения
1	2	3	4	5	6	7	8
30	94,3	87	80,9	23,7	83,6	15,7	89,7	92,1
100	71,2	81,1	84,6	13,9	96,1	9,4	87,2	85,9
300	70,5	83	77,2	9,6	50,9	12,4	39,7	56,7
1000	np	np	40,3	np	30,4	np	20,0	32,7
np = не проводили

Пример 10: Конкурентный анализ для Соединений 1-8

Классический конкурентный анализ с использованием ¹²⁵I-эхистатина осуществляли для оценки аффинности (K_i) конъюгатов RGD-Cy^D (Соединений 1-8) в отношении мембран, экспрессирующих α_vβ₃-рецептор. K_i определяли в исследованиях конкуренции рецептора с мембранами, полученными из человеческих эндотелиальных клеток. Мембраны из клеточной линии человеческой эндотелиальной аденокарциномы ЕА-Hy926, которая экспрессирует некоторые интегрины, включая α_vβ₃, получали и использовали в качестве источника рецептора. Конкурентное связывание ¹²⁵I-эхистатина, известного субстрата для некоторых интегринов, включая α_vβ₃, осуществляли при варьирующих концентрациях охлажденных соединений. Результаты представлены в Таблице 7.

Таблица 7
Измерения Ki (конкурентный анализ с использованием 125I-эхистатина)
Соединение	Ki (нМ)
1	1,9
2	-
3	2,6
4	1,8
5	1,7
6	1,6
7	7,4
8	2,9

Пример 11: Тестирование Соединений 1-8 in vivo

(а) Животная модель

В данном исследовании использовали самок бестимусных мышей BALB с/А с мутацией по гену nude (Bom). Использование этих животных одобрено местным комитетом по соблюдению этических норм исследования. Так как эти животные имеют ослабленный иммунитет, их содержали в индивидуальных проветриваемых клетках (IVC, Scanbur BK) с фильтруемым через высокоэффективный воздушный фильтр (HEPA) воздухом. Животные имели неограниченный доступ к корму "Rat and Mouse nr. 3 Breeding" (Scanbur BK) и водопроводной воде, подкисленной добавлением HCI до молярной концентрации 1 мМ (pH 3,0). Для защиты животных во время обработок и всех процедур перед процедурой визуализации их обрабатывали в условиях воздуха, ламинарно фильтруемого НЕРА.

Животных оставляли на период акклиматизации в течение по меньшей мере 5 суток перед инъецированием подкожно (s.c.) суспензиями опухолевых клеток НТ-29 в двух местах (плечевая область и левая нижняя боковая область) номинальной дозой 2,5-3×10⁶ клеток на инъекцию объемом 100 мкл. Подкожные инъекции осуществляли под анестезией легким газом. Опухолям давали расти в течение 2-4 недель.

Для иммобилизации во время процедуры оптической визуализации животных анестезировали в коаксиально открытой маске анестезией легкого хирургического уровня изофлураном (как правило, 1,5-2%) с кислородом в качестве газа-носителя. Животным предоставляли внешний обогрев от обогревающей подстилки для поддержания нормальной температуры тела во время проведения визуализации (вплоть до 3 часов). В хвостовую вену помещали катетер Venflon для введения контрастного агента. Каждому животному давали одну инъекцию контрастного агента.

Чтобы избежать артефактов от проб визуализации в коже, кусочек кожи диаметром ~3 мм над опухолью и мышцу удаляли перед визуализацией, в то время как животное находилось под анестезией. В конце эксперимента животных умерщвляли смещением шейных позвонков.

(б) Протокол визуализации

Лазер включали по меньшей мере за 15 минут до начала эксперимента для выхода на стабильный уровень. Небольшую стопку белой бумаги для принтера подвергали визуализации с получением плоскостного изображения, которое использовали для коррекции неоднородностей просвечивания. Для кинетических параметров визуализации животных помещали внутрь темного бокса для визуализации на обогревающую подстилку (BioVet) с температурой 40°С. Дыхание и температуру использовали для мониторинга за глубиной анестезии во время визуализации. Животных подвергали визуализации по одному за раз. Перед инъекцией у всех животных получали изображения с использованием лазерного источника света и с использованием источника белого света. Для обоих источников света были размещены эмиссионные фильтры, эффективно создавая изображение при использовании белого света и изображение при использовании облучения на принимаемых частотах.

Тестируемое вещество инъецировали внутривенно (iv) через Venflon с последующим вливанием 0,2 мл физиологического раствора. Временные ряды изображений получали от начала инъекции с каждым новым изображением каждые 30 секунд. Изображения сохраняли на месте перед их переносом на сервер.

Анализ изображений осуществляли с использованием пользовательского записанного программного обеспечения MATLAB. Представляющие интерес участки очерчивали часть опухоли и мышцы, не покрытые кожей. Третий участок помещали над частью кожи, где не было опухоли или нижележащей почечной ткани, дающей помехи сигнала. Рассчитывали средний сигнал интенсивностей пикселей внутри каждого участка. Рассчитывали средний сигнал и стандартное отклонение пикселей.

(в) Результаты

Результаты in vivo для соединений 1, 2, 4 и 6 представлены, основываясь на данных in vitro из примеров 7-10. Опухолевое усиление сигнала количественно выражали в виде соотношения мишень:фон (TBR), определяемого как отношение средней интенсивности опухолевого участка, деленной на среднюю интенсивность мышечного участка.

Соединение 2 (neg-RGD скремблированный пептид) дало TBR, равное 1,14. Соединение 1 [Cy5(2)-RGD] дало соотношение, равное 1,43. Соединения 4 и 6 проявляют ожидаемое улучшение, давая соотношения 1,72 и 1,98 соответственно. Результаты приведены на Фиг.1.

1. Агент визуализации, подходящий для оптической визуализации организма млекопитающего in vivo, включающий конъюгат формулы I
,
где ВТМ представляет собой биологическую группировку-мишень,
выбранную из 3-100-мерного RGD-пептида;
Су^D представляет собой цианиновый краситель формулы II

где Y¹ и Y² независимо представляют собой -CR⁷R⁸-;
R¹ и R² независимо представляют собой Н, -SO₃M¹ или R^a, где М¹ представляет собой Н или В^с и В^с представляет собой биосовместимый катион;
R⁴ и R⁵ независимо представляют собой С_1-5алкил, С_1-6карбоксиалкил или R^a;
R⁷ представляет собой Н или С_1-3алкил;
R⁸ представляет собой R^a или С_1-6карбоксиалкил;
R^a представляет собой С_1-4сульфоалкил;
L представляет собой синтетическую линкерную группу формулы -(А)_m-,
где каждый А независимо представляет собой -CR₂-, -NRCO- или -CONR-;
каждый R независимо выбран из Н, С_1-4алкила, С_2-4алкенила, С_2-4алкинила, С_1-4алкоксиалкила или С_1-4гидроксиалкила;
m равен целому числу от 1 до 20;
n равен целому числу 0 или 1;
при условиях, что:
(1) цианиновый краситель содержит по меньшей мере одну группу R^a и суммарно от 3 до 6 сульфоново-кислотных заместителей из групп R¹, R² и R^a;
(2) агент визуализации не содержит гаситель флуоресценции.

2. Агент визуализации по п.1, где R⁷ представляет собой СН₃.

3. Агент визуализации по п.1, где Су^D имеет суммарно 4 сульфоново-кислотных заместителя, выбранных из групп R¹, R² и R^a.

4. Агент визуализации по п.1, где группы R^a независимо представлены формулой
-(СН₂)_kSО₃М¹, где М¹ является таким, как определено в п.1, и k равен целому числу от 1 до 4.

5. Агент визуализации по п.4, где k равен 3 или 4.

6. Агент визуализации по п.1, где R¹ и R² оба представляют собой SO₃M¹.

7. Агент визуализации по п.6, где заместители SO₃M¹ находятся в положении 5 индольного/индоленинового колец.

8. Агент визуализации по п.1, где Су^D представлен формулой III
,
где R^b независимо представляет собой группу R^a или С_1-6карбоксиалкил;
R⁹-R¹² независимо представляют собой С_1-5алкил или группу R^b и выбраны таким образом, что
либо R⁹ и R¹⁰ оба представляют собой R^c, либо R¹¹ и R¹² оба представляют собой R^c, где R^c представляет собой С_1-2алкил;
R^a и М¹ являются такими, как определено в п.1.

9. Агент визуализации по п.1, который представлен формулами IVa или IVb:


где Z¹ присоединен к N-концу ВТМ-пептида и представляет собой Н или М^IG;
Z² присоединен к С-концу ВТМ-пептида и представляет собой ОН, ОВ^с или M^IG,
где В^с является таким, как определено в п.1, и
M^IG представляет собой группу, ингибирующую метаболизм, которая представляет собой биосовместимую группу, ингибирующую или подавляющую ферментативный метаболизм ВТМ-пептида.

10. Агент визуализации по п.9, где Z¹ и Z² оба представляют собой М^IG.

11. Фармацевтическая композиция, содержащая агент визуализации по любому из пп.1-10 вместе с биосовместимым носителем, в форме, подходящей для введения млекопитающему.

12. Фармацевтическая композиция по п.11 в дозировке, подходящей для индивидуального пациента, предложенная в подходящем шприце или контейнере.

13. Набор для приготовления фармацевтической композиции по п.11 или 12, содержащий агент визуализации по любому из пп.1-10 в стерильной твердой форме, так чтобы после разведения стерильной добавкой биосовместимого носителя произошло растворение с получением желаемой фармацевтической композиции.

14. Набор по п.13, где стерильная твердая форма представляет собой лиофилизированное твердое вещество.

15. Конъюгат формулы Iа
,
где ВТМ, L и n являются такими, как определено в п.1, и Су^D представлен формулой IIIа

где R⁹-R¹² независимо представляют собой группы R^b или R^c и выбраны таким образом, что
один из R⁹-R¹² представляет собой группу R^a, а каждый другой представляет собой группы R^c, где R^c представляет собой С_1-2алкил;
R^a, R^b и М¹ являются такими, как определено в п.8.

16. Цианиновый краситель формулы IIIа, как она определена в п.15, полезный в получении конъюгата по п.15.

17. Цианиновый краситель по п.16, дополнительно содержащий группу Q^a, где Q^a представляет собой реакционно-способную функциональную группу, подходящую для конъюгации с ВТМ.

18. Цианиновый краситель по п.16 или 17, где R^b независимо представляет собой -(CH₂)_kSO₃M¹, где k равен целому числу от 1 до 4.

19. Способ оптической визуализации организма млекопитающего in vivo, включающий использование агента визуализации по любому из пп.1-10 или фармацевтической композиции по п.11 или 12 с получением изображений сайтов локализации ВТМ in vivo.

20. Способ по п.19, при котором агент визуализации по любому из пп.1-10 или фармацевтическую композицию по п.11 или 12 предварительно вводили в организм указанного млекопитающего.

21. Способ по п.20, включающий стадии, на которых:
(1) поверхность интересующей ткани в организме млекопитающего просвечивают возбуждающим светом;
(2) используя детектор флуоресценции, детектируют флуоресценцию от агента визуализации, генерируемую путем возбуждения Су^D;
(3) свет, детектируемый детектором флуоресценции, возможно фильтруют для отделения флуоресцентного компонента;
(4) из флуоресцентного свечения на стадии (2) или (3) формируют изображение указанной поверхности интересующей ткани.

22. Способ по п.21, где возбуждающий свет на стадии (1) представляет собой незатухающую волну (CW) по природе.

23. Способ по п.20, при котором:
(а) светорассеивающую биологическую ткань указанного организма млекопитающего, имеющую гетерогенный состав, подвергают воздействию света от источника света с заранее установленной варьируемой по времени интенсивностью для возбуждения агента визуализации, при котором наблюдают многократное рассеяние возбуждающего света в указанной ткани;
(б) детектируют многократно рассеянное световое излучение от ткани в ответ на указанное воздействие;
(в) проводят количественное определение параметра флуоресценции по всей ткани на основании этого излучения путем установления ряда показателей с использованием процессора, где каждый из показателей соответствует уровню параметра флуоресценции в различных положениях в пределах этой ткани, и где данный уровень параметра флуоресценции варьирует согласно гетерогенному составу этой ткани; и
(г) генерируют изображение этой ткани путем построения изображения гетерогенного состава ткани в соответствии с показателями стадии (в).

24. Способ по п.19, где способ оптической визуализации включает флуоресцентную эндоскопию.

25. Способ по любому из пп.19-24, где оптическую визуализацию in vivo используют при проведении детектирования, определении стадии заболевания, диагностике, мониторинге прогрессирования заболевания или мониторинге лечения болезненного состояния организма млекопитающего.

26. Способ мониторинга лечения болезненного состояния организма млекопитающего, включающий способ оптической визуализации in vivo по любому из пп.19-25.