Sparc, связывающийся с scfv

Авторы патента:


Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv
Sparc, связывающийся с scfv

 


Владельцы патента RU 2477728:

АБРАКСИС БАЙОСАЙЕНС, ЭлЭлСи (US)

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены варианты анти-SPARC ScFv, а также композиция для лечения состояния, связанного с повышенной экспрессией SPARC с KD, составляющей по меньшей мере 7,8×10-5 М, включающая в эффективном количестве указанное антитело, связанное с терапевтическим средством, а также способ лечения млекопитающего, основанный на использовании указанной композиции. Описана композиция для диагностики состояния, связанного с повышенной экспрессией SPARC на основе анти-SPARC ScFv антитела, связанного с диагностическим средством. Использование изобретения может найти применение в медицине для лечения заболеваний, связанных с повышенной экспрессией SPARC. 4 н. и 5 з.п. ф-лы, 1 табл., 20 ил., 5 пр.

 

Притязание на приоритет

В настоящей заявке испрашивается преимущество предварительной заявки США № 61/120228, поданной 5 декабря 2008 г., и полное содержание этой заявки вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Предшествующий уровень техники

Секреторный кислый белок, богатый цистеином (SPARC), который также известен как остеонектин, представляет собой гликопротеин, состоящий из 303 аминокислот и экспрессирующийся в организме человека. Экспрессия SPARC является стадие-регулируемой, причем SPARC экспрессируется, главным образом, в тканях при их ремоделировании в процессе нормального развития или в ответ на их повреждение. См., например, Lane et al., FASEB J., 8, 163-173 (1994). Так, например, высокий уровень экспрессии белка SPARC наблюдается в костях и в зубах развивающегося организма и, главным образом, в остеобластах, одонтобластах, перихондриальных фибробластах и в дифференцирующихся хондроцитах мышиных, коровьих и человеческих эмбрионов. SPARC также играет важную роль во взаимодействиях клеток с матриксом в процессе ремоделирования ткани, заживления ран, морфогенеза, дифференцировки клеток, миграции и ангиогенеза, включая процессы, ассоциированные с патологическими состояниями. Так, например, SPARC экспрессируется при интерстициальном фиброзе почек и может играть определенную роль в вырабатывании ответа у хозяина на повреждение легких, такое как индуцированный блеомицином фиброз легких.

SPARC дифференциально экспрессируется в опухолях и в окружающей их строме при различных раковых заболеваниях, но не экспрессируется в нормальных тканях, причем характер его экспрессии зависит от типа ракового заболевания. Таким образом, пока не существует унифицированной модели, которая объясняла бы все аспекты функций этого белка и его вклада в развитие и прогрессирование рака. В качестве примера можно отметить, что в литературе сообщалось о повышенной экспрессии SPARC в раковой опухоли молочной железы (Bellahcene and Castronovo, 1995; Jones et al., 2004; Lien et al., 2007; Porter et al., 1995), в меланоме (Ledda et al., 1997a) и в глиобластомах (Rempel et al., 1998). Повышенные уровни экспрессии SPARC играют определенную роль в стимуляции развития опухоли или в прогрессировании указанных раковых заболеваний.

В соответствии с этим сверхэкспрессия SPARC при воспалительных заболеваниях и при некоторых раковых заболеваниях позволяет считать SPARC потенциальной мишенью, которая может быть использована в диагностике и в терапии.

Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям для доставки терапевтического или диагностического средства в пораженную область млекопитающего, а именно для доставки терапевтически или диагностически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей терапевтическое или диагностическое средство, связанное с SPARC-связывающимся пептидом («SBP»), и фармацевтически приемлемый носитель («композиции согласно изобретению»), где указанный SBP содержит одну или несколько последовательностей SEQ ID NO:1-117.

Особенно предпочтительные варианты изобретения включают, например, композиции согласно изобретению, предназначенные для доставки терапевтического средства в пораженную область млекопитающего и включающие один или несколько SBP, где указанное терапевтическое средство представляет собой фрагмент антитела, содержащий функциональный Fc-домен антитела, включая, например, функциональный Fc-домен антитела, содержащий SEQ ID NO:118.

Другими предпочтительными вариантами изобретения являются композиции согласно изобретению, предназначеные для доставки терапевтического или диагностического средства в пораженную область млекопитающего, где SBP, например, включает по меньшей мере 10 следующих друг за другом аминокислот, присутствующих в любой одной или нескольких SEQ ID NO:1-112 и 117. Предпочтительно, SBP может состоять по меньшей мере из 10 смежных аминокислот, присутствующих в любой одной или нескольких SEQ ID NO:1-112 и 117. Другие варианты изобретения включают композиции, например, содержащие два или более отдельных SBP, каждый из которых содержит по меньшей мере 10 смежных аминокислот, присутствующих в любой одной или нескольких SEQ ID NO:1-112 и 117, а предпочтительно, в любой одной или нескольких SEQ ID NO:1-5. Другие варианты изобретения включают композиции, например, содержащие два или более отдельных SBP, каждый из которых состоит из одной или нескольких SEQ ID NO:1-117.

Настоящее изобретение также относится к композициям для доставки терапевтического или диагностического средства в пораженную область млекопитающего, а именно для доставки терапевтически или диагностически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей терапевтическое или диагностическое средство, связанное с SBP, фармацевтически приемлемый носитель, а также фармацевтически приемлемый носитель, дополнительно включающий альбумин-связывающий пептид («ABP»), где ABP содержит SEQ ID NO:119 или SEQ ID NO:120, или обе последовательности SEQ ID NO:119 и 120. Такими композициями являются композиции, в которых SBP и ABP присутствуют в одном и том же полипептиде, и композиции, в которых SBP и ABP присутствуют в различных полипептидах.

Настоящее изобретение также относится к способам доставки терапевтического или диагностического средства в пораженную область млекопитающего, где указанные способы включают доставку терапевтически или диагностически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей терапевтическое или диагностическое средство, связанное с SPARC-связывающимся пептидом, и фармацевтически приемлемый носитель («способы согласно изобретению»), где указанный SBP содержит SEQ ID NO:1-117. Предпочтительные варианты включают способы согласно изобретению, где указанные композиции включают, например, SBP, который содержит по меньшей мере 10 смежных аминокислот, происходящих от любой одной или нескольких SEQ ID NO:1-112 и 117, а более предпочтительно, в любой одной или нескольких SEQ ID NO:1-5 и 117.

Другие предпочтительные варианты включают способы согласно изобретению, например, способы, в которых два или более отдельных SBP состоят из одной или нескольких SEQ ID NO:1-117. Настоящее изобретение также относится к способам согласно изобретению, где указанные два или более отдельных полипептида состоят по меньшей мере из одного SBP, и где указанные SBP содержат по меньшей мере 10 смежных аминокислот, происходящих от любой одной или нескольких SEQ ID NO:1-112.

Особенно предпочтительные способы согласно изобретению включают применение композиций, например, содержащих терапевтическое средство, которое представляет собой фрагмент антитела, содержащий функциональный Fc-домен антитела, где указанный фрагмент антитела содержит SEQ ID NO:118. Такими способами согласно изобретению являются, например, способы, где указанным терапевтическим средством является фрагмент антитела, который опосредует одну или несколько функций, таких как активация комплемента, клеточно-опосредуемая цитотоксичность, индуцирование апоптоза, индуцирование клеточной гибели и опсонизация.

Способы согласно изобретению, описанные в настоящей заявке, также включают применение пептидов, связывающихся с сывороточным альбумином ("ABP"), где указанные пептиды включают последовательности SEQ ID NO:119 или 120, или SEQ ID NO:119 и 120. Способами согласно изобретению также являются способы, где, например, SBP и ABP присутствуют в одном и том же полипептиде, и способы, где SBP и ABP присутствуют в различных полипептидах. Однако SBP может также состоять по меньшей мере из 10 смежных аминокислот, происходящих от любой одной или нескольких SEQ ID NO:1-112.

Могут быть также применены композиции согласно изобретению и способы согласно изобретению, в которых пораженным участком является опухоль, а млекопитающим является человек.

Краткое описание некоторых аспектов графического материала

На фиг. 1 проиллюстрирована общая концепция присоединения связывающегося пептида к терапевтическому или диагностическому средству. В одном из примеров, проиллюстрированных в данном графическом материале, терапевтическим средством является Fc-домен антитела.

На фиг. 2 проиллюстрирована общая стратегия итеративного скрининга библиотеки фагового представления.

На фиг. 3 представлены последовательности, идентифицированные после скрининга пептидной библиотеки фагового представления на связывание с SPARC по числу выделенных последовательностей.

На фиг. 4 представлены последовательности, идентифицированные после скрининга пептидной библиотеки фагового представления на связывание с SPARC по авидности связывания с SPARC (на что указывает OD).

На фиг. 5 проиллюстрировано клонирование любого пептида из пептидов PD15 или PD21 в вектор pFUSE-hIgG1-Fc2 с получением гибридного белка PD15 или PD21-Fc.

На фиг. 6 представлена последовательность ДНК, полученная в результате клонирования последовательностей, кодирующих пептид 15 и пептид 21, в вектор pFUSE-hIgG1-Fc2, кодирующий гибридные белки «пептид-Fc».

На фиг. 7 представлены экспрессированные гибридные белки PD 15-Fc и PD 21-Fc, очищенные с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

На фиг. 8 проиллюстрирован массив Protoarray, используемый для определения нежелательного связывания PD15 и PD21.

На фиг. 9 представлен график, на котором проиллюстрированы ELISA-анализы на связывание путем сравнения авидности связывания SPARC с PD15 и PD21 с авидностью его связывания с анти-SPARC антителом.

На фиг. 10 представлены микрофотографии, полученные в результате иммуногистологических анализов срезов человеческой опухоли, которые продемонстрировали экспрессию опухолевого SPARC в присутствии анти-SPARC антитела (анти-SPARC антитела R&D). Антитело против герцептина, используемое в качестве негативного контроля (только Fc-фрагмент) и гибридный белок «пептид-Fc», связывающийся со стабилином (stab-Fc), не окрашивали опухоль.

На фиг. 11 проиллюстрировано гистологическое окрашивание SPARC-экспрессирующей опухоли, указывающее на связывание PD15 и PD21 со SPARC-экспрессирующими клетками опухоли.

На фиг. 12 показан потенциальный SPARC-связывающий сайт на эластине.

На фиг. 13 проиллюстрирована противоопухолевая активность PD15 и PD21 в моделированной системе «мышь с человеческим раком предстательной железы»/«голая» мышь.

На фиг. 14 проиллюстрирована противоопухолевая активность PD15 и PD21 в моделированной системе «мышь с человеческим раком молочной железы»/«голая» мышь.

На фиг. 15 представлены два полипептида scFv, ScFv 3-1 и ScFv 3-2, обладающие SPARC-связывающей активностью.

На фиг. 16 представлены два полипептида scFv, ScFv 2-1 и ScFv 2-2, обладающие SPARC-связывающей активностью.

На фиг. 17 представлена нуклеотидная последовательность scfv 2-1, 2-2, 3-1 и 3-2. CDR подчеркнуты.

На фиг. 18 проиллюстрировано выделение scfv2-1 из бактерий.

На фиг. 19 проиллюстрировано выделение scfv3-1 из бактерий.

На фиг. 20 проиллюстрировано связывание scfv2-1 с белком SPARC, иммобилизованным на чипе, как было оценено с помощью анализа Biacore. Указаны величины Kd для scfv 2-1, 3-1 и 3-2, связанных с белком SPARC, которые были получены методом Biacore (SPARC HTI, то есть с очищенным тромбоцитарным SPARC, полученным от HTI; и SPARC Abx, то есть с SPARC, выделенным из сконструированных клеток HEK293, поставляемых Abraxis).

Подробное описание настоящего изобретения

SBP и ABP представляют собой «домены пептидного лиганда». Термин «домен пептидного лиганда» означает аминокислотную последовательность, которая может существовать сама по себе и/или присутствовать в более крупной полипептидной последовательности, где указанная аминокислотная последовательность связывается с другой биомолекулой с определенной степенью специфичности. Так, например, в связывании этих биомолекул с сывороточным альбумином участвует главная система транспорта жирных кислот, билирубина, триптофана, кальция, стероидных гормонов и других физиологически важных соединений в кровотоке. Связывание этих биомолекул осуществляется в дискретных сайтах аминокислотных последовательностей альбумина, то есть в доменах пептидных лигандов в сывороточном альбумине.

Настоящее изобретение относится к композициям для доставки терапевтического или диагностического средства в пораженную область млекопитающего, а именно для доставки терапевтически или диагностически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей терапевтическое или диагностическое средство, связанное с SPARC-связывающим пептидом («SBP»), и фармацевтически приемлемый носитель («композиции согласно изобретению» и «способы согласно изобретению»). Настоящее изобретение включает композиции и способы, в которых SBP содержит пептид, имеющий любую одну или несколько последовательностей SEQ ID NO:1-117, а наиболее предпочтительно, любую одну или несколько последовательностей SEQ ID NO:1-5 или один или несколько гомологов любой одной из SEQ ID NO:1-117.

Термин «гомолог» означает полипептид, который, в основном, содержит такую же аминокислотную последовательность, как и исходная последовательность, и обладает релевантными свойствами, которые, по существу, аналогичны свойствам исходной последовательности. Одним из таких репрезентативных свойств является способность модулировать распределение активного агента в ткани, где указанный гомолог SEQ ID NO:1-117 может иметь уровень модуляции, в основном, аналогичный уровню модуляции SEQ ID NO:1-117. В этом контексте, желательно, например, чтобы гомолог SEQ ID NO:1-117, в основном, обладал такой же способностью к модуляции, при которой уровень активного агента в крови был по меньшей мере примерно на 80%, предпочтительно, по меньшей мере примерно на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере примерно на 90%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере примерно на 95% аналогичен уровню, достигаемому с использованием SEQ ID NO:1-117. Альтернативно, термин «гомолог» также означает, например, пептидную последовательность, состоящую по меньшей мере из 6 смежных аминокислот, предпочтительно, по меньшей мере из 7 смежных аминокислот, более предпочтительно, по меньшей мере из 8 смежных аминокислот, еще более предпочтительно, по меньшей мере из 9 смежных аминокислот, еще более предпочтительно, по меньшей мере из 10 смежных аминокислот любой одной из SEQ ID NO:1-112, а наиболее предпочтительно, из любой одной или нескольких SEQ ID NO:1-5.

Композиции и способы согласно изобретению также включают ABP, содержащие SEQ ID NO:119 или 120, либо SEQ ID NO:119 и 120 и их гомологи. Способы согласно изобретению также включают, например, способы, в которых SBP и ABP присутствуют в одном и том же полипептиде и в которых SBP и ABP присутствуют в различных полипептидах.

Что касается изменений в исходной последовательности, то было бы желательно, чтобы гомолог имел последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, предпочтительно, по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере примерно на 95%, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере примерно на 99% была идентична исходной последовательности.

Используемый здесь термин «процент идентичности последовательностей» означает величину, определяемую путем сравнения оптимально двух выровненных последовательностей по «окну» сравнения. Кроме того, часть полипептидной последовательности в «окне» сравнения может содержать добавления или делеции (то есть «пробелы») по сравнению со сравниваемой последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций), используемой для оптимального сопоставления двух последовательностей. Процент вычисляют путем определения числа положений, в которых идентичный аминокислотный остаток присутствует в обеих последовательностях, в результате чего получают ряд соответствующих положений, и число этих положений делят на общее число положений в «окне» сравнения, а затем, полученный результат умножают на 100 и получают процент идентичности данных последовательностей. Предпочтительно, оптимальное выравнивание осуществляют с использованием алгоритма выравнивания для достижения максимальной гомологии Нидлмана и Вюнша (1970) J. Mol. Biol. 48:443 453.

В том случае, если гомологи не содержат идентичных аминокислот, также может оказаться желательным, чтобы мутации давали только консервативные аминокислотные замены. В соответствии с этим в положениях остатков, которые не являются идентичными, осуществляют замену таких аминокислотых остатков на другие аминокислотые остатки с аналогичными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью), а поэтому функциональные свойства такой молекулы не изменяются. Если последовательности имеют консервативные замены, то процент идентичности последовательностей может быть уточнен путем коррекции на консервативную природу таких замен. Говорят, что последовательности, отличающиеся такими консервативными заменами, представляют собой «аналогичные» последовательности или «подобные» последовательности. Методы осуществления такой коррекции хорошо известны специалистам.

Для лучшего объяснения термина «консервативная аминокислотная замена или модификация», употребляемого в контексте настоящего изобретения, ниже перечислены группы аминокислот A-F. Замена одного члена нижеследующих групп другим членом той же самой группы рассматривается как «консервативная» замена.

Группа A включает лейцин, изолейцин, валин, метионин, фенилаланин, серин, цистеин, треонин и модифицированные аминокислоты, имеющие нижеследующие боковые цепи: этил, изобутил, -CH2CH2OH, -CH2CH2CH2OH, -CH2CHOHCH3 и CH2SCH3.

Группа B включает глицин, аланин, валин, серин, цистеин, треонин и модифицированную аминокислоту, имеющую этильную боковую цепь.

Группа C включает фенилаланин, фенилглицин, тирозин, триптофан, циклогексилметил и модифицированные аминокислотные остатки, имеющие замещенные бензильные или фенильные боковые цепи.

Группа D включает глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, замещенный или незамещенный алифатический, ароматический или бензиловый эфир глутаминовой или аспарагиновой кислоты (например, метиловый, этиловый, н-пропиловый, изопропиловый, циклогексиловый, бензиловый или замещенный бензиловый эфир), глутамин, аспарагин, CO-NH-алкилированный глутамин или аспарагин (например, алкилированный метилом, этилом, н-пропилом и изопропилом) и модифицированные аминокислоты, имеющие боковую цепь -(CH2)3COOH, их сложный эфир (замещенный или незамещенный алифатический, ароматический или бензиловый сложный эфир), амид и замещенный или незамещенный N-алкилированный амид.

Группа Е включает гистидин, лизин, аргинин, N-нитроаргинин, п-циклоаргинин, g-гидроксиаргинин, N-амидиноцитрулин, 2-аминогуанидинобутановую кислоту, гомологи лизина, гомологи аргинина и орнитин.

Группа F включает серин, треонин, цистеин и модифицированные аминокислоты, имеющие прямые или разветвленные алкильные боковые C1-C5-цепи, замещенные -OH или -SH.

Настоящее изобретение также относится к композициям, включающим молекулу-конъюгат, содержащую домен пептидного лиганда, конъюгированный с активным агентом, где указанный домен пептидного лиганда дополнительно содержит примерно 50 аминокислот, предпочтительно, дополнительно примерно 25 аминокислот, более предпочтительно, дополнительно примерно 15 аминокислот, а наиболее предпочтительно, дополнительно примерно 10 аминокислот, присоединенных к амино-концу, или карбокси-концу, или к обоим концам. Полученные полипептиды согласно изобретению включают полипептиды, общая длина которых составляет менее чем 50, менее чем 40, менее чем 30, менее чем 25 или менее чем 20 аминокислот.

Настоящее изобретение также относится к композициям, включающим молекулу-конъюгат, содержащую SBP, конъюгированный с активным агентом, где в указанной композиции присутствуют один или множество SBP, содержащих любую одну из SEQ ID NO:1-117, а наиболее желательно, любую одну или более SEQ ID NO:1, 2 и 117.

Настоящее изобретение также относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность домена, связывающегося с пептидным лигандом, включая последовательности, в которых указанная дополнительная аминокислота присоединена у амино- и/или карбоксиконца.

II. Способы получения пептидов согласно изобретению

Полипептиды, содержащие домен пептидного лиганда и полученные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть синтезированы, детектированы, количественно оценены и очищены известными методами. Так, например, клетки, экспрессирующие экзогенные полипептиды, содержащие домен пептидного лиганда, могут быть получены путем помещения кДНК под контроль сильного промотора/сайта инициации трансляции и в трансфицированный или трансформированный вектор, встраиваемый в подходящие прокариотические или эукариотические клетки для инициации экспрессии полипептидов, содержащих домен пептидного лиганда, методами, хорошо известными среднему специалисту в данной области. Альтернативно, полипептиды, содержащие домен пептидного лиганда, могут быть химически синтезированы методами, хорошо известными среднему специалисту в данной области.

Полипептиды, содержащие домен пептидного лиганда, могут быть получены стандартным методом твердофазного синтеза. Как, в основном, известно специалистам, пептиды требуемой длины могут быть получены с применением коммерчески доступного оборудования и реагентов в соответствии с инструкциями производителей по блокированию интерферирующих групп, защите реакционноспособных аминокислот, связыванию, реакции снятия защиты и кэпированию непрореагировавших остатков. Подходящее оборудование может быть закуплено, например, у Applied BioSystems, Foster City, CA, или Biosearch Corporation in San Raphael, CA.

Так, например, пептиды синтезируют в соответствии со стандартными протоколами автоматизированного твердофазного синтеза, где используются трет-бутоксикарбонил-альфа-аминокислоты с соответствующей защитой боковой цепи. Полноразмерный пептид удаляют с твердофазного носителя путем одновременного снятия защиты боковой цепи стандартным методом с использованием фтористого водорода. Затем, неочищенные пептиды дополнительно очищают с помощью полупрепаративной ВЭЖХ с обращенной фазой (Vydac C18) в градиенте ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте (TFA). После этого пептиды сушат в вакууме для удаления ацетонитрила и лиофилизуют из раствора 0,1% TFA в воде. Чистоту подтверждают с помощью аналитической ОФ-ВЭЖХ. Пептиды могут быть лиофилизованы, а затем солюбилизированы в воде или в 0,01M уксусной кислоте в концентрациях 1-2 мг/мл по массе.

Применение вышеупомянутых методов синтеза необходимо в том случае, если в пептидах присутствуют некодируемые аминокислоты или D-формы аминокислот. Однако в случае пептидов, кодируемых геном, такой синтез может быть также проведен рекомбинантными методами с использованием уже синтезированных последовательностей ДНК в коммерчески доступных системах экспрессии.

В соответствии с этим настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору, содержащему элементы регуляции экспрессии полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий домен пептидного лиганда. Кроме того, настоящее изобретение относится к клеткам, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий домен пептидного лиганда, где указанными клетками являются прокариотические клетки или эукариотические клетки. Методы культивирования микробных и тканевых культур хорошо известны специалистам (см., например, Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001), pp. 16.1-16.54). Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения полипептидов, содержащих домен пептидного лиганда, где указанный способ включает: (a) трансформацию клеток нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид по п.1 формулы изобретения; (b) индуцирование экспрессии полипептида трансформированными клетками; и (c) очистку полипептида.

Экспрессия белка зависит от уровня транскрипции РНК, которая, в свою очередь, регулируется ДНК-сигналами. Аналогичным образом, трансляция мРНК требует, на очень небольшом уровне, присутствия инициирующего кодона AUG, который обычно локализуется в области между нуклеотидами 10 и 100 у 5'-конца матричной РНК. Было показано, что последовательности, фланкирующие инициирующий кодон AUG, влияют на его распознавание. Так, например, для распознавания эукариотическими рибосомами, инициирующие кодоны AUG встраивают в последовательности так, чтобы они точно соответствовали «консенсусной последовательности Козака», что будет приводить к оптимальной трансляции (см., например, Kozak, J. Molec. Biol. 196:947-950 (1987)). Кроме того, для успешной экспрессии экзогенной нуклеиновой кислоты в клетках может потребоваться посттрансляционная модификация полученного белка.

Описанные здесь молекулы нуклеиновой кислоты, предпочтительно, включают кодирующую область, функционально присоединенную к подходящему промотору, например к промотору, который является функциональным в эукариотических клетках. В настоящем изобретении могут быть использованы вирусные промоторы, такие как, но не ограничивающиеся ими, промотор RSV и основной поздний промотор аденовируса. Подходящими не-вирусными промоторами являются, но не ограничиваются ими, промотор фосфоглицерокиназы (PGK) и промотор фактора элонгации 1α. Не-вирусными промоторными, предпочтительно, являются человеческие промоторы. Дополнительные подходящие генетические элементы, многие из которых известны специалистам, могут быть также присоединены к нуклеиновой кислоте согласно изобретению и к ее конструкциям, либо они могут быть встроены в указанную нуклеиновую кислоту и ее конструкции в целях сообщения им дополнительных функций, повышения уровня экспрессии или улучшения характера экспрессии.

Кроме того, описанные здесь молекулы нуклеиновой кислоты могут быть функционально присоединены к энхансерам для облегчения транскрипции. Энхансерами являются цисдействующие элементы ДНК, стимулирующие транскрипцию смежных генов. Примерами энхансеров, которые обеспечивают высокий уровень транскрипции сцепленных генов в ряде клеток различных типов, происходящих от множества видов, являются, но не ограничиваются ими, энхансеры, происходящие от SV40 и RSV-LTR. Такие энхансеры могут быть объединены с другими энхансерами, обладающими клетко-специфическими эффектами, либо может быть использован любой отдельно взятый энхансер.

Для оптимизации продуцирования белка в эукариотических клетках молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может также содержать сайт полиаденилирования, расположенный за кодирующей областью молекулы нуклеиновой кислоты. Кроме того, предпочтительно, чтобы все соответствующие сигналы транскрипции (и сигналы трансляции, если они имеются) были расположены так, чтобы экзогенная нуклеиновая кислота соответствующим образом экспрессировалась в клетках, в которые ее вводят. Если это необходимо, экзогенная нуклеиновая кислота может также включать сайты сплайсинга (то есть акцепторые и донорные сайты сплайсинга) для облегчения продуцирования мРНК, то есть полноразмерного транскрипта, с сохранением рамки считывания. Кроме того, молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут также включать соответствующие последовательности для процессинга, секреции, внутриклеточной локализации и т.п.

Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть встроены в любой подходящий вектор. Подходящими векторами являются, но не ограничиваются ими, вирусные векторы. Подходящими вирусными векторами являются, но не ограничиваются ими, ретровирусные векторы, векторы на основе альфа-вирусов, вируса коровьей оспы, аденовируса, аденоассоциированного вируса, вируса герпеса и вируса оспы домашней птицы. Такие векторы, предпочтительно, обладают природной или сообщенной им способностью трансформировать эукариотические клетки, например клетки CHO-K1. Кроме того, векторами, используемыми в настоящем изобретении, могут быть векторы на основе «оголенной» нуклеиновой кислоты (то есть векторы, имеющие небольшое количество инкапсулированных в них белков, сахаров и/или липидов, или векторы, не содержащие указанных соединений), такие как плазмиды или эписомы, либо указанные векторы могут образовывать комплекс с другими молекулами. Другими молекулами, которые могут быть соответствующим образом объединены с нуклеиновыми кислотами согласно изобретению, являются, но не ограничиваются ими, вирусные оболочки, катионные липиды, липосомы, полиамины, золотые частицы и нацеливающие молекулы, такие как лиганды, рецепторы или антитела, нацеленные на клеточные молекулы.

Описанные здесь молекулы нуклеиновой кислоты могут быть перенесены в любые подходящие клетки, обычно в эукариотические клетки, такие как, например, клетки CHO, HEK293 или BHK, так, чтобы это приводило к экспрессии полипептида, содержащего домен пептидного лиганда, такого как, например, полипептид, содержащий последовательности SEQ ID NO:1-120, или их гомологи, описанные в настоящей заявке. Клетка может быть культивирована так, чтобы она экспрессировала молекулу нуклеиновой кислоты, а поэтому продуцировала полипептид, содержащий домен пептидного лиганда, такой как, например, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1-120, или ее гомологи, описанные в настоящей заявке.

В соответствии с этим настоящее изобретение относится к клетке, трансформированной или трансфицированной описанной здесь молекулой нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Методы трансформации или трансфекции клеток молекулой экзогенной ДНК хорошо известны специалистам. Так, например, молекулу ДНК вводят в клетки стандартными методами трансформации или трансфекции, хорошо известными специалистам, такими как, но не ограничивающимися ими, трансфекция, опосредуемая фосфатом кальция или DEAE-декстраном, слияние протопластов, электропорация, метод с применением липосом и прямая микроинжекция (см., например, Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001), pp. 1.1-1.162, 15.1-15.53, 16.1-16.54).

Другим примером метода трансформации является метод слияния протопластов, в котором протопласты, происходящие от бактерий, несущих большое число копий представляющей интерес плазмиды, смешивают непосредственно с культивированными клетками млекопитающих. После слияния клеточных мембран (обычно посредством полиэтиленгликоля) содержимое бактерий доставляется в цитоплазму клетками млекопитающих, и плазмидная ДНК переносится в ядро.

Электропорация, то есть подача коротких электрических импульсов высокого напряжения на различные клетки млекопитающих и растений, приводит к образованию нанометровых пор в плазматической мембране. ДНК переносится непосредственно в цитоплазму клетки либо через эти поры, либо в результате перераспределения компонентов мембраны, которое сопровождается закрытием этих пор. Электропорация может быть исключительно эффективной и может быть использована для временной экспрессии генов клонов и для получения клеточных линий, несущих интегрированные копии представляющего интерес гена.

Такие методы могут быть применены для стабильной и временной трансформации эукариотических клеток. Для выделения стабильно трансформированных клеток требуется введение селективного маркера в сочетании с трансформацией представляющего интерес гена. Такими селективными маркерами являются гены, сообщающие резистентность к неомицину, а также ген HPRT в HPRT-негативных клетках. При отборе может потребоваться более длительное культивирование в селективной среде, а именно по меньшей мере в течение примерно 2-7 дней, а предпочтительно, по меньшей мере примерно 1-5 недель (см., например, Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001), pp. 16.1-16.54).

Полипептид, содержащий домен пептидного лиганда, может быть экспрессирован в рекомбинантных клетках-хозяевах и выделен из этих клеток. Рекомбинантные клетки-хозяева могут быть прокариотическими или эукариотическими, включая, но не ограничиваясь ими, бактерии, такие как E. coli, клетки грибов, такие как дрожжи, клетки насекомых, включая, но не ограничиваясь ими, клеточные линии, происходящие от дрозофилы и тутового шелкопряда, и клетки и клеточные линии млекопитающих. При экспрессии полипептида, содержащего домен пептидного лиганда, в клетках, например в человеческих клетках, независимо от того, используются ли они in vitro или in vivo, кодоны, отобранные для такого полинуклеотида, кодирующего пептид, могут быть оптимизированы для клеток данного типа (то есть вида). Специалистам известно множество методов оптимизации кодонов (см., например, Jayaraj et al., Nucleic Acids Res. 33(9):3011-6 (2005); Fuglsang et al., Protein Expr. Purif. 31(2):247-9 (2003); Wu et al., The Synthetic Gene Designer: a Flexible Web Platform to Explore Sequence Space of Synthetic Genes for Heterologous Expression, csbw, 2005 IEEE Computational Systems Bioinformatics Conference - Workshops (CSBW'05), pp. 258-259 (2005)).

Факторами, которые следует учитывать для достижения оптимальной экспрессии полипептида в прокариотах, являются конкретно используемые экспрессионные системы, выбор штамма-хозяина, стабильность мРНК, смещение кодонов, образование телец включения и предотвращение их образования; образование гибридного белка и его сайт-специфический протеолиз, а также компартмент-направленная секреция (см. публикацию Sorensen et al., Journal of Biotechnology 115 (2005) 113-128, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки).

Обычно, экспрессия индуцируется с плазмиды, имеющейся в системе, совместимой с фоновым генотипом. Генетическими элементами экспрессионной плазмиды являются ориджин репликации (ori), маркер резистентности к антибиотикам, промоторы транскрипции, области инициации трансляции (TIR), а также терминаторы транскрипции и трансляции.

При этом может быть использована любая подходящая экспрессионная система, такая как, например, клетки Escherichia coli, которые благодаря их относительной простоте облегчают экспрессию белка; культуры высокой плотности; хорошо известные генетические элементы и большое число совместимых материалов, включая ряд доступных плазмид, рекомбинантные партнеры по слиянию и мутантные штаммы, подходящие для экспрессии полипептида. Особенно подходящими для рекомбинантной экспрессии являются штамм E. coli или фоновый генотип. Экспрессионные штаммы должны быть дефицитными по многим природным протеазам с нежелательным действием, а также должны поддерживать стабильную экспрессию плазмиды и содержать генетические элементы, соответствующие данной экспрессионной системе (например, DE3).

Число плазмидных копий регулируется ориджином репликации, который, предпочтительно, инициирует репликацию в нестрогих условиях (Baneyx, 1999). Репликон ColE1, присутствующий в современных экспрессионных плазмидах, происходит от семейства плазмид pBR322 (число копий 15-20) или pUC (число копий 500-700), а репликон p15A происходит от pACYC184 (число копий 10-12). Наиболее известные маркеры резистентности к лекарственным средствам, присутствующие в рекомбинантных экспрессионных плазмидах, сообщают резистентность к ампициллину, канамицину, хлорамфениколу или тетрациклину.

Экспрессионными системами E. coli являются экспрессионная система pET на основе T7 (поставляемая в продажу Novagen), промотор PL лямбда/репрессор cI (например, Invitrogen pLEX), промотор Trc (например, Amersham Biosciences pTrc), промотор Tac (например, Amersham Biosciences pGEX) и гибрид lac/T5 (например, Qiagen pQE), а также промотор BAD (например, pBAD Invitrogen).

Для инициации трансляции из области инициации трансляции (TIR) транскрибированной матричной РНК требуется присутствие сайта связывания с рибосомой (RBS), включая последовательность Шайна-Дальгарно (SD) и кодон инициации трансляции. Последовательность Шайна-Дальгарно представляет собой последовательность из 7±2 нуклеотидов, расположенных выше инициирующего кодона, который является каноническим AUG в эффективных рекомбинантных экспрессионных системах. Оптимальная инициация трансляции достигается из мРНК с использованием последовательности SD, такой как UAAGGAGG.

Частота встречаемости кодонов в E. coli зависит от уровня когнатных амино-ацилированных тРНК, присутствующих в цитоплазме. Большинство кодонов присутствует в генах, экспрессируемых на высоком уровне, а небольшое число кодонов или редко встречающиеся кодоны обычно встречаются в генах, экспрессируемых на низком уровне. Редко встречающиеся кодоны в E. coli часто в избытке присутствуют в гетерологичных генах, происходящих от таких источников, как эукариоты, архебактерии и другие отдаленно родственные организмы, в которых преимущественно встречаются другие кодоны (Kane, 1995). Экспрессия генов, содержащих редко встречающиеся кодоны, может приводить к ошибочной трансляции в результате рибосомного блокирования в положениях, требующих включения аминокислот, связанных с тРНК с минорными кодонами (McNulty et al., 2003). Проблемы, связанные со смещением кодонов, особенно часто возникают в рекомбинантных экспрессионных системах, в случае если транскрипты содержат редко встречающиеся кодоны в кластерах, таких как дублеты и триплеты, которые аккумулируются там в больших количествах.

Для активности белка требуется его строгая укладка с образованием трехмерных структур. Стрессовая ситуация, такая как тепловой шок, оказывает негативное влияние на укладку in vivo, а укладка с образованием промежуточных структур приводит к образованию аморфных белковых гранул, называемых тельцами включения.

Тельца включения представляют собой набор агрегатов со сложной структурой, которые часто могут образовываться в ответ на стрессовые условия, в случае когда рекомбинантный белок экспрессируется на высоком уровне. Макромолекулярные скопления белков при концентрации 200-300 мг/мл в цитоплазме E. coli позволяют предположить о наличии очень неблагоприятных условий для укладки белка, а в частности в процессе рекомбинантной экспрессии на высоком уровне (van den Berg et al., 1999). При этом неизвестно, образуются ли тельца включения в результате пассивных событий, происходящих при гидрофобном взаимодействии между «пэтчами», присутствующими на неуложенных цепях, или в результате специфических механизмов кластеризации (Villaverde and Carrio, 2003). Очищенные агрегаты могут быть солюбилизированы с использованием детергентов, таких как мочевина и гидрохлорид гуадиния. Нативный белок может быть получен путем in vitro рефолдинга из солюбилизированных телец включения методами разведения, диализа или рефолдинга на колонке (Middelberg, 2002; Sørensen et al., 2003a).

Стратегии рефолдинга могут быть усовершенствованы путем включения молекулярных шаперонов (Mogk et al., 2002). Однако для оптимизации процедуры рефолдинга данного белка требуются большие затраты времени, и это не всегда дает высокий выход продукта. Стратегией предупреждения образования телец включения может быть ко-сверхэкспрессия молекулярных шаперонов.

Для упрощения очистки и экспрессии рекомбинантных белков были получены партнеры по слиянию белков широкого ряда (Stevens, 2000). Гибридные белки или химерные белки обычно включают партнера или «метку», связанную с белком-«пассажиром» или белком-мишенью посредством сайта распознавания специфической протеазой. Большинство партнеров по слиянию используются для специфических стратегий аффинной очистки. Партнеры по слиянию также предпочтительно использовать in vivo, поскольку они могут защищать белки-«пассажиры» от внутриклеточного протеолиза (Jacquet et al., 1999; Martinez et al., 1995) и повышать растворимость (Davis et al., 1999; Kapust and Waugh, 1999; Sørensen et al., 2003b), либо они могут быть использованы в качестве специфических экспрессионных репортеров (Waldo et al., 1999). Высокие уровни экспрессии могут часто передаваться от N-концевого партнера по слиянию слабо экспрессирующемуся белку-«пассажиру», что, вероятно, обусловлено, главным образом, стабилизацией мРНК (Arechaga et al., 2003). Наиболее распространенными аффинными метками являются полигистидиновая метка (His-метка), которая является подходящей для проведения аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованным металлом (IMAC), и глутатион-S-трансферазная метка (GST), используемая для очистки на смолах, полученных на основе глутатиона. Существуют и многие другие аффинные метки, подробно описанные в литературе (Terpe, 2003).

В принципе, рекомбинантно экспрессируемые белки могут быть направлены в три различных участка, а именно в цитоплазму, в периплазму или в культуральную среду. Доставка рекомбинантного белка в специфический клеточный компартмент имеет ряд преимуществ и недостатков. Обычно, предпочтительной является экспрессия в цитоплазме, поскольку, в данном случае, она дает достаточно высокие выходы продукта. Образование дисульфидных связей сегрегируется в E. coli и активно катализируется в периплазме системой Dsb (Rietsch and Beckwith, 1998). Восстановление цистеинов в цитоплазме достигается посредством тиоредоксина и глутаредоксина. Тиоредоксин восстанавливается тиоредоксин-редуктазой, а глутаредоксин - глутатионом. Низкомолекулярный глутатион восстанавливается глутатион-редуктазой. Дизрупция генов trxB и gor, кодирующих эти две редуктазы, приводит к образованию дисульфидных связей в цитоплазме E. coli.

Клеточная система экспрессии имеет тот недостаток, что она не дает нужного количества и качества белков и не всегда является высокопродуктивной. Многие из этих недостатков можно обойти путем использования бесклеточных систем экспрессии.

Бесклеточные системы для экспрессии генов in vitro и для синтеза белка описаны для многих различных прокариотических и эукариотических систем (см. Endo & Sawasaki Current Opinion in Biotechnology 2006, 17:373-380). Эукариотические бесклеточные системы, такие как лизат кроличьих ретикулоцитов и экстракт пшеничных проростков, получают из неочищенного экстракта, содержащего все компоненты, необходимые для трансляции in vitro транскрибированных РНК-матриц. В эукариотических бесклеточных системах используется выделенная РНК, синтезированная in vivo или in vitro в качестве матрицы для реакции трансляции (например, системы лизата кроличьих ретикулоцитов или системы экстрактов пшеничных проростков). Связанные эукариотические бесклеточные системы объединяют РНК-полимеразу прокариотического фага с эукариотическими экстрактами и используют экзогенную ДНК или ПЦР-генерированные матрицы с фаговым промотором для синтеза белка in vitro (например, лизат ретикулоцитов, TNT®).

Белки, транслированные с использованием связанных систем TNT®, могут быть использованы в функциональных исследованиях многих типов. Реакции транскрипции/трансляции связанных систем TNT® обычно используют для подтверждения открытых рамок считывания, мутаций исследуемых белков и получения белков in vitro для исследования на связывание белок-ДНК, для анализов на активность белка или для исследований на взаимодействие «белок-белок». Недавно, белки, экспрессированные с применением связанных систем TNT®, были также использованы в анализах для подтверждения взаимодействий двухкомпонентной дрожжевой системы, для осуществления экспрессионного клонирования in vitro (IVEC) и для получения белков-субстратов для анализов на ферментативную активность или модификацию белка. Обзор сопряженных систем TNT®, недавно упоминаемых в различных заявках, можно найти на сайте: www.promega.com/citations/.

Транскрипция и трансляция в прокариотических системах обычно является сопряженной, то есть эти системы содержат эндогенную или фаговую РНК-полимеразу, транскрибирующую мРНК из экзогенной матричной ДНК. Эту РНК затем используют в качестве матрицы для трансляции. Матричной ДНК может быть либо ген, клонированный в плазмидный вектор (кДНК), либо ПЦР(а)-генерированная матрица. Для матриц, транслируемых в прокариотических системах, требуется сайт связывания с рибосомой (RBS). В процессе транскрипции, 5'-конец мРНК становится доступным для связывания с рибосомой и инициации трансляции, что приводит к одновременному осуществлению реакции транскрипции и трансляции. Существуют также прокариотические системы, в которых используются матричные ДНК, содержащие либо прокариотические промоторы (такие как lac или tac; система экстрактов E. coli S30 для кольцевой и линейной ДНК), либо фаговый промотор РНК-полимеразы (система экстрактов E. coli S30 для кольцевой ДНК). Растворимость очищенного полипептида, содержащего домен пептидного лиганда, может быть улучшена методами, известными специалистам. Так, например, для повышения растворимости экспрессируемого белка (например, в E. coli) можно снизить скорость синтеза белка, а именно путем снижения температуры культивирования, путем использования слабого промотора, путем использования низкокопийной плазмиды, путем снижения концентрации индуктора и путем замены культуральной среды, как описано Georgiou & Valax (Current Opinion Biotechnol. 7:190-197(1996)). Такое снижение скорости синтеза белка обычно приводит к получению белка с лучшей растворимостью. Могут быть также добавлены простетические группы или ко-факторы, которые играют важную роль в правильной укладке белка или в повышении стабильности белка, либо может быть добавлен буфер для регуляции изменений рН в среде в процессе культивирования, либо может быть добавлена 1% глюкоза для подавления индуцирования промотора lac лактозой, которая присутствует в наиболее обогащенной среде (такой как LB, 2 x YT). В среду могут быть также добавлены полиолы (например, сорбит) и сахароза, поскольку повышение осмотического давления, вызываемое такими добавлениями, приводит к аккумуляции осмопротектантов в клетке, что обеспечивает стабилизацию структуры нативного белка. Могут быть добавлены этанол, низкомолекулярные тиолы и дисульфиды, и NaCl. Кроме того, с нужным полипептидом могут также ко-экспрессироваться шапероны и/или фолдазы. Молекулярные шапероны стимулируют правильную изомеризацию и нацеливание на клетки посредством временного взаимодействия с промежуточными соединениями, ответственными за укладку. Системами шаперонов E. coli являются, но не ограничиваются ими, GroES-GroEL, DnaK-DnaJ-GrpE, CIpB.

Фолдазы ускоряют прохождение скорость-ограничивающих стадий на протяжении всего процесса укладки. Важную роль обычно играют фолдазы трех типов: пептидилпролил-цис/транс-изомеразы (PPI), дисульфид-оксидоредуктаза (DsbA) и дисульфид-изомераза (DsbC), протеин-дисульфид-изомераза (PDI), которая представляет собой эукариотический белок, катализирующий окисление цистеина белка и изомеризацию дисульфидных связей. Ко-экспрессия одного или нескольких из этих белков с белком-мишенью может давать более высокие уровни растворимого белка-мишени.

Полипептид, содержащий домен пептидного лиганда, может быть получен в виде гибридного белка в целях улучшения его растворимости и продуцирования. Такой гибридный белок включает полипептид, содержащий домен пептидного лиганда, и второй полипептид, присоединенные друг к другу с сохранением рамки считывания. Вторым полипептидом может быть партнер по связыванию, который, как известно специалистам, способствует улучшению растворимости полипептида, с которым он связан, и таким полипептидом является, например, NusA, бактериоферритин (BFR), GrpE, тиоредоксин (TRX) и глутатион-S-трансфераза (GST). Компания Novagen Inc. (Madison, WI) выпускает вектор pET серии 43.1, который стимулирует образование гибрида NusA-мишень. Также известно, что DsbA и DsbC оказывают позитивное влияние на уровни экспрессии при их использовании в качестве партнера по связыванию, а поэтому они могут быть использованы для присоединения к домену пептидного лиганда в целях повышения растворимости.

В одном из аспектов таких гибридных белков, экспрессированный полипептид, содержащий домен пептидного лиганда, включает линкерный полипептид, который имеет сайт расщепления протеазой, включающий пептидную связь, гидролизуемую протеазой. В результате этого, после экспрессии, домен пептидного лиганда в полипептиде может быть отделен от остального полипептида посредством протеолиза. Линкер может включать одну или несколько дополнительных аминокислот на обеих сторонах связи, которая также связывает каталитический сайт протеазы (см., например, Schecter & Berger, Biochem. Biophys. Res. Commun. 27,157-62 (1967)). Альтернативно, сайт расщепления линкера может быть отделен от сайта распознавания протеазы, а два сайта расщепления и сайт распознавания могут быть отделены друг от друга одной или несколькими (например, 2-4) аминокислотами. В одном из аспектов изобретения линкер содержит по меньшей мере примерно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, примерно 10, примерно 20, примерно 30, примерно 40, примерно 50 или более аминокислот. Более предпочтительный линкер имеет длину примерно от 5 до 25 аминокислот, а наиболее предпочтительно, примерно от 8 до 15 аминокислот.

Некоторые протеазы, используемые в соответствии с настоящим изобретением, обсуждаются в нижеследующих работах: Hooper et al., Biochem. J. 321:265-279 (1997); Werb, Cell 91:439-442 (1997); Wolfsberg et al., J. Cell Biol. 131:275-278 (1995); Murakami & Etlinger, Biochem. Biophys. Res. Comm. 146:1249-1259 (1987); Berg et al., Biochem. J. 307:313-326 (1995); Smyth and Trapani, Immunology Today 16:202-206 (1995); Talanian et al., J. Biol. Chem. 272:9677-9682 (1997); и Thornberry et al., J. Biol. Chem. 272:17907-17911 (1997). Протеазы клеточной поверхности могут быть также использованы в комбинации с расщепляемыми линкерами согласно изобретению, и такими протеазами являются, но не ограничиваются ими: аминопептидаза N; восприимчивая к пуромицину аминопептидаза; ангиотензин-конвертирующий фермент; пироглутамилпептидаза II; дипептидил-пептидаза IV; двухосновная N-аргинин-конвертаза; эндопептидаза 24.15; эндопептидаза 24.16; секретаза белка-предшественника амилоида-альфа, -бета и -гамма; ангиотензин-конвертирующий фермент секретаза; TGF-альфа-секретаза; TNF-альфа-секретаза; FAS-лиганд-секретаза; секретазы рецептора TNF I и II; секретаза CD30; секретазы KL1 и KL2; секретаза рецептора IL6; секретаза CD43, CD44; секретазы CD16-I и CD16-II; секретаза L-селектина; секретаза фолатного рецептора; MMP 1,2, 3,7, 8,9, 10,11, 12,13, 14 и 15; урокиназный активатор плазминогена; тканевый активатор плазминогена; плазмин; тромбин; BMP-1 (проколлаген C-пептидаза); ADAM 1,2, 3,4, 5,6, 7,8, 9,10 и 11; и ферменты гранзимы A, B, C, D, E, F, G и H.

В качестве альтернативы клеточно-ассоциированным протеазам может служить саморасщепляющийся линкер. Так, например, в качестве линкера может служить протеаза вируса ящура (FMDV) 2A. Такая протеаза представляет собой короткий полипептид из 17 аминокислот, который расщепляет полипротеин FMDV на стыке 2A/2B. Последовательность полипептида FMDV 2A представляет собой NFDLLKLAGDVESNPGP. Расщепление происходит на C-конце пептида в паре концевых аминокислот глицин-пролин, и такое расщепление не зависит от присутствия других последовательностей FMDV и происходит даже в присутствии гетерологичных последовательностей.

Для очистки полипептидов, содержащих домен пептидного лиганда, может быть использована аффинная хроматография отдельно или в сочетании с ионообменной хроматографией, эксклюзионной хроматографией или ВЭЖХ. Такие хроматографические методы могут быть проведены с использованием колоночной или ступенчатой хроматографии. Методы хроматографической очистки хорошо известны специалистам.

Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенным нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептиды, содержащие пептидый лиганд с одной или несколькими аминокислотными заменами и инсерциями или делециями примерно от 1 до 5 аминокислот, предпочтительно, примерно от 1 до 3 аминокислот, а более предпочтительно, 1 аминокислоту в последовательностях SEQ ID NO:1-117, и имеющие релевантные свойства, которые, по существу, аналогичны свойствам исходных последовательностей.

Мутагенез может быть осуществлен любыми методами, известными специалистам. Обычно мутагенез осуществляют путем клонирования последовательности нуклеиновой кислоты в плазмиду или в некоторые другие векторы для облегчения модификаций данной последовательности. Затем уникальный рестрикционный сайт, в нуклеотидную последовательность которого могут быть добавлены дополнительные нуклеиновые кислоты, идентифицируют или встраивают в последовательность нуклеиновой кислоты. Двухцепочечный синтетический олигонуклеотид обычно получают из перекрывающихся синтетических одноцепочечных смысловых и антисмысловых олигонуклеотидов так, чтобы двухцепочечный олигонуклеотид был включен в рестрикционные сайты, фланкирующие последовательность-мишень, и этот олигонуклеотид может быть использован, например, для включения ДНК-замены. Палазмиду и другой вектор расщепляют рестриктирующим ферментом и олигонуклеотидную последовательность, имеющую соответствующие липкие концы, лигируют в плазмиду или в другой вектор для замены исходной ДНК.

Специалистам известны и другие способы осуществления сайт-направленного мутагенеза in vitro, и такой мутагенез может быть, в частности, осуществлен с помощью полимеразной цепной реакции с перекрывающимся удлинением (ПЦР), см., например, Parikh & Guengerich, Biotechniques 24:428-431 (1998)). Комплементарные праймеры, перекрывающиеся с сайтом замены, могут быть использованы для ПЦР-амплификации целой плазмиды в смеси, содержащей 500 мM dNTP, 2 единицы полимеразы Pfu, 250 нг каждого смыслового и антисмыслового праймера и 200 нг плазмидной ДНК, содержащей последовательность, кодирующую полипептид, содержащий домен пептидного лиганда. Желательно, чтобы ПЦР включала 18 циклов с временем удлинения 2,5 минуты для каждых т.п.н. ДНК. ПЦР-продукты могут быть обработаны ферментом DpnI (который гидролизует только метилированную по аденину плазмидную ДНК) и перенесены в клетки Escherichia coli DH5α. Трансформанты могут быть скринированы путем гидролиза рестриктирующим ферментом на включение замен, которые затем могут быть подтверждены с помощью анализа последовательности ДНК.

Подходящими методами детектирования белка и количественной оценки полипептидов, содержащих домен пептидного лиганда, являются вестерн-блот-анализ, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), окрашивание серебром, анализ BCA (см., например, Smith et al., Anal. Biochem., 150,76-85 (1985)), анализ белка Лаури (описанный, например, в публикации Lowry et al., J. Biol. Chem., 193, 265-275 (1951)), который представляет собой колориметрический анализ на основе комплексов «белок-медь», и анализ белка Брэдфорда (описанный, например, в публикации Bradford et al., Anal. Biochem., 72, 248 (1976)), в основе которого лежит зависимость от изменения оптической плотности кумасси синего G-250 после связывания с белком. После экспрессии, полипептиды, содержащие домен пептидного лиганда, могут быть очищены традиционными методами очистки, такими как ионообменная хроматография, эксклюзионная хроматография или хроматография на C18.

III. Методы связывания доменов пептидного лиганда

Методы «связывания» (или «конъюгирования» или «перекрестного связывания») подходящих активных агентов, таких как, например, терапевтические средства, химиотерапевтические средства, радионуклиды, полипептиды и т.п., с полипептидом, содержащим домен пептидного лиганда, хорошо известны специалистам. При получении описанных здесь конъюгатов, активный агент непосредственно или опосредованно связывают с доменом пептидного лиганда любым методом, известным специалистам в области присединения двух молекул, при условии, что такое присоединение конъюгированных или связанных молекул к домену пептидного лиганда, в основном, не будет оказывать негативного влияния на функцию домена пептидного лиганда или на функцию активного агента. Такое присоединение может быть осуществлено любыми подходящими средствами, включая, но не ограничиваясь ими, связывание посредством ионных и ковалентных связей и любой другой достаточно стабильной ассоциацией, посредством которой будет модулироваться распределение доставляемого агента.

Различные гетеробифункциональные перекрестно-связывающие реагенты, используемые для образования ковалентных связей между аминогруппами и тиоловыми группами и для введения тиоловых групп в белки, хорошо известны специалистам в данной области (см., например, Cumber et al. (1992) Bioconjugate Chem. 3':397 401; Thorpe et al. (1987) Cancer Res. 47:5924 5931; Gordon et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:308 312; Walden et al. (1986) J. Mol. Cell Immunol. 2:191 197; Carlsson et al. (1978) Biochem. J. 173:723 737; Mahan et al. (1987) Anal. Biochem. 162:163 170; Wawryznaczak et al. (1992) Br. J. Cancer 66:361 366; Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60:584 589). Эти реагенты могут быть использованы для образования ковалентных связей между доменом пептидного лиганда или полипептидом, содержащим домен пептидного лиганда, и любыми описанными здесь активными агентами. Такими реагентами являются, но не ограничиваются ими, N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP; дисульфидный линкер); сульфосукцинимидил-6-[3-(2-пиридилдитио)пропионамидо]гексаноат (сульфо-LC-SPDP); сукцинимидилоксикарбонил-α-метилбензилтиосульфат (SMBT, дисульфатный линкер со стерически затрудненной конформацией); сукцинимидил-6-[3-(2-пиридилдитио)пропионамидо]гексаноат (LC-SPDP); сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC); сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)бутират (SPDB; дисульфидный линкер со стерически затрудненными связями); сульфосукцинимидил-2-(7-азидо-4-метилкумарин-3-ацетамид)этил-1,3-дитиопропионат (SAED); сульфо-сукцинимидил-7-азидо-4-метилкумарин-3-ацетат (SAMCA); сульфосукцинимидил-6-[альфа-метил-альфа-(2-пиридиидитио)толуамидо]гексаноат (сульфо-LC-SMPT); 1,4-ди-[3'-(2'-пиридиидитио)пропионамидо]бутан (DPDPB); 4-сукцинимидилоксикарбонил-α-метил-α.-(2-пиридилтио)толуол (SMPT, дисульфатный линкер со стерически затрудненной конформацией); сульфосукцинимидил-6-[α.-метил-α.-(2-пиридилдитио)толуамидо]гексаноат (сульфо-LC-SMPT); м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидоэфир (MBS); м-малеимидобензоил-N-гидроксисульфосукцинимидоэфир (сульфо-MBS); N-сукцинимидил(4-иодацетил)аминобензоат (SIAB; тиоэфирный линкер); сульфосукцинимидил(4-иодацетил)аминобензоат (сульфо-SIAB); сукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират (SMPB); сульфосукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират (сульфо-SMPB); азидобензоилгидразид (ABH).

Другими гетеробифункциональными расщепляемыми связывающими агентами являются N-сукцинимидил-(4-иодацетил)аминобензоат; сульфосукцинимидил-(4-иодацетил)аминобензоат; 4-сукцинимидил-оксикарбонил-a-(2-пиридилдитио)толуол; сульфосукцинимидил-6-[a-метил-a-(пиридилдитиол)толуамидо]гексаноат; N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат; сукцинимидил-6[3(-(-2-пиридилдитио)пропионамидо]гексаноат; сульфосукцинимидил-6[3(-(-2-пиридилдитио)пропионамидо]гексаноат; 3-(2-пиридиидитио)пропионилгидразид, реагент Элмана, дихлортриазиновая кислота, S-(2-тиопиридил)-L-цистеин. Другие репрезентативные бифункциональные связывающие соединения описаны в патентах США №№ 5349066, 5618528, 4569789, 4952394 и 5137877.

Альтернативно, для конъюгирования могут быть использованы, например, полипептидные сульфгидрильные группы. Кроме того, сахарные группы, связанные с гликопротеинами, например антитела могут быть окислены с образованием альдегидных групп, используемых в ряде способов конъюгирования, известных специалистам. Конъюгаты, образованные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть стабильными in vivo или нестабильными, например, они могут иметь ферментативно гидролизуемые тетрапептидные связи или неустойчивые к действию кислоты цис-аконитильные или гидразоновые связи.

Полипептид, содержащий домен пептидого лиганда, может быть, но необязательно, связан с активным агентом посредством одного или нескольких линкеров. Линкерную часть выбирают в зависимости от желаемых свойств. Так, например, длина линкерной части может быть выбрана в целях оптимизации кинетики и специфичности связывания с лигандом, включая любые конформационные изменения, индуцированные связыванием лиганда с рецептором-мишенью. Линкерная часть должна быть достаточно длинной и достаточно гибкой, чтобы это позволяло свободно взаимодействовать с молекулой полипептидного лиганда и с рецептором клетки-мишени. Если линкер является слишком коротким или слишком жестким, то между молекулой полипептидного лиганда и клеточным токсином могут образовываться стерически затрудненные связи. Если молекула линкера является слишком длинной, то активный агент может разлагаться в процессе продуцирования, либо он может не оказывать желаемое воздействие на клетку-мишень.

В настоящем изобретении может быть использован любой подходящий линкер, известный специалистам. Вообще говоря, в конъюгатах, которые представляют собой гибридные белки, состоящие из линкеров химически продуцируемых конъюгатов, могут быть использованы различные наборы линкеров. Линкерами и связями, которые могут быть использованы для получения химически связанных конъюгатов, являются, но не ограничиваются ими, дисульфидные связи, тиоэфирные связи, стерически затрудненные дисульфидные связи и ковалентные связи, расположенные между свободными реакционноспособными группами, такими как аминогруппы и тиоловые группы. Эти связи получают с использованием гетеробифункциональных реагентов для продуцирования реакционноспособных тиоловых групп на одном или обоих полипептидах, а затем тиоловые группы на одном полипептиде подвергают реакции взаимодействия с реакционноспособными тиоловыми группами или аминогруппами, к которым могут быть присоединены реакционноспособные малеимидо-группы или тиоловые группы, присутствующие на другом полипептиде. Другими линкерами являются расщепляемые кислотой линкеры, такие как бисмалеимидоэтоксипропан, конъюгаты «неустойчивая к действию кислоты группа - трансферрин» и диигидразид адипиновой кислоты, которые расщепляются в более кислотных внутриклеточных компартментах; перекрестно-сшивающие линкеры, которые расщепляются под воздействием УФ-излучения или видимого света, и другие линкеры. В некоторых вариантах изобретения для того, чтобы воспользоваться нужными свойствами каждого линкера, в молекулу может быть включено несколько линкеров. Химические линкеры и пептидные линкеры могут быть встроены путем ковалентного связывания линкера с полипептидом, содержащим домен пептидого лиганда, и с агентом для доставки. Гетеробифункциональные агенты, описанные ниже, могут быть использованы для осуществления такого ковалентного связывания. Пептидные линкеры могут быть также присоединены путем экспрессии ДНК, кодирующей линкер и домен пептидного лиганда, линкер и активный агент, или домен пептидного лиганда, линкер и активный агент в виде гибридного белка. Также рассматривается применение гибких линкеров и линкеров, повышающих растворимость конъюгатов, которые также используются либо отдельно, либо в комбинации с другими линкерами.

В соответствии с этим линкерами могут быть, но не ограничиваются ими, пептидные связи, аминокислотные и пептидные связи, обычно содержащие от одной до примерно 30 аминокислот, а более предпочтительно, примерно от 10 до 30 аминокислот. Альтернативно, химическими линкерами, такими как гетеробифункциональные расщепляемые перекрестно-сшивающие линкеры, являются, но не ограничиваются ими, N-сукцинимидил-(4-иодацетил)аминобензоат, сульфосукцинимидил(4-иодацетил)-аминобензоат, 4-сукцинимидил-оксикарбонил-a-(2-пиридилдитио)толуол, сульфосукцинимидил-6-a-метил-a- (пиридилдитиол)толуамидо)гексаноат, N-сукцинимидил-3-(-2-пиридилдитио)проприонат, сукцинимидил-6(3(-(-2-пиридилдитио)-проприонамидо)гексаноат, сульфосукцинимидил-6(3-(-(-2- пиридиидитио)пропионамидо)гексаноат, 3-(2-пиридилдитио)-пропионилгидразид, реагент Элмана, дихлортриазиновая кислота и S-(2-тиопиридил)-L-цистеин.

Другими линкерами являются тритильные линкеры, а в частности дериватизированные тритильные группы, используемые для получения конъюгатов различных типов, обеспечивающих высвобождение терапевтических средств с различной степенью кислотности или основности. Таким образом, нужная гибкость, может быть достигнута благодаря предварительному выбору значений рН в пределах, при которых может высвобождаться терапевтическое средство, что позволяет проводить отбор линкера на основе известных физиологических различий между тканями, в которые необходимо доставить терапевтическое средство (см., например, патент США № 5612474). Так, например, кислотность опухолевых тканей, очевидно, ниже кислотности нормальных тканей.

Могут быть также использованы линкеры, расщепляемые под действием кислоты, фоточувствительные и термочувствительные линкеры, особенно в тех случаях, когда они необходимы для расщепления направленного на мишень агента, что делает их более доступными для реакции. Линкерами, расщепляемыми под действием кислоты, являются, но не ограничиваются ими, бисмалеимидоэтоксипропан, линкеры на основе дигидразида адипиновой кислоты (см., например, Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60:584 589) и неустойчивые к действию кислоты трансферриновые конъюгаты, которые содержат достаточное количество трансферрина для обеспечения его участия в пути циклизации внутриклеточного трансферрина (см., например, Welhoner et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:4309 4314). Фоторасщепляемыми линкерами являются линкеры, которые расщепляются под действием света (см., например, Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3:104 107, и которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки), а поэтому эти линкеры обеспечивают высвобождение направленного на мишень агента под действием света. Фоторасщепляемые линкеры, которые расщепляются под действием света, известны специалистам (см., например, публикацию Hazum et al. (1981) in Pept., Proc. Eur. Pept. Symp., 16th, Brunfeldt, K (Ed), pp. 105 110, в которой описано использование нитробензильной группы в качестве фоторасщепляемой защитной группы для цистеина; публикацию Yen et al. (1989) Makromol. Chem. 190:69 82, в которой описаны водорастворимые фоторасщепляемые сополимеры, включая гидроксипропилметакриламидный сополимер, глициновый сополимер, флуоресцеиновый сополимер и метилродаминовый сополимер; публикацию Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3:104 107, в которой описан перекрестно-сшивающий линкер и реагент, который подвергается фотолитическому расщеплению под действием света в ближнем УФ-диапазоне (350 нм); и публикацию Senter et al. (1985) Photochem. Photobiol 42:231 237, в которой описаны нитробензилоксикарбонилхлоридные перекрестно-сшивающие реагенты, образующие фоторасщепляемые связи), а поэтому эти линкеры обладают способностью высвобождать нацеленный на мишень агент под действием света. Такие линкеры, в частности, могут быть использованы для лечения кожных или глазных болезней путем облучения светом с применением волоконной оптики. После введения конъюгата глаза или кожа или другие части тела могут быть подвергнуты действию света, что будет приводить к высвобождению нацеленной на мишень молекулы из указанного конъюгата. Такие фоторасщепляемые линкеры могут быть использованы в комбинации с протоколами диагностики, где желательно удаление нацеливающего агента для его быстрого выведения из организма животного.

IV. Настоящее изобретение относится к множеству активных агентов

В различных аспектах настоящего изобретения предусматривается, что полипептид, содержащий домен пептидного лиганда, связан с активным агентом, то есть терапевтическим или диагностическим средством.

Используемый здесь термин «терапевтический агент» означает биологическую макромолекулу или экстракт, полученный из биологических материалов, таких как клетки или ткани бактерий, растений, грибов или животных (в частности, млекопитающих), которые, как предполагается, обладают терапевтическими свойствами, например химиотерапевтическое средство или радиотерапевтическое средство. Используемый здесь термин «терапевтический» относится к ослаблению симптомов заболевания, а также к лечению или предупреждению (то есть предупреждению развития или снижения риска развития рассматриваемого заболевания, например, рака или другого пролиферативного заболевания), заболевания или родственного состояния, которым страдает данное млекопитающее. «Лечебная терапия» направлена на ослабление, в целом или частично, симптомов уже существующего заболевания или состояния у млекопитающего.

Указанное средство может быть очищенным, по существу, очищенным или частично очищенным. Кроме того, такое терапевтическое средство может быть включено в липосому или иммунолипосому, либо оно может быть ассоциировано с ними, и конъюгирование может быть осуществлено непосредственно с указанным средством или с липосомой/иммунолипосомой. Термин «липосома» означает небольшую везикулу, состоящую из различных липидов, фосфолипидов и/или поверхностно-активных веществ, которые могут быть использованы для доставки лекарственного средства (например, лекарственных средств, антител, токсинов). Компоненты липосомы обычно локализуются в виде бислоя, аналогично липидной структуре биологических мембран.

Репрезентативными терапевтическими средствами, которые могут быть связаны с полипептидом, содержащим домен пептидного лиганда, способом, рассматриваемым в настоящем изобретении, являются, но не ограничиваются ими, химиотерапевтические средства (например, доцетаксел, паклитаксел, таксаны и соединения платины), антифолаты, антиметаболиты, антимитотические средства, ДНК-разлагающие агенты, проапоптотические средства, агенты, индуцирующие дифференцировку, антиангиогенные агенты, антибиотики, гормоны, пептиды, антитела, ингибиторы тирозинкиназы, биологически активные агенты, биологические молекулы, радионуклиды, адриамицин, анзамициновые антибиотики, аспарагиназа, блеомицин, бусульфан, цисплатин, карбоплатин, кармустин, капецитабин, хлорамбуцил, цитарабин, циклофосфамид, камптотецин, дакарбазин, дактиномицин, даунорубицин, дексразоксан, доцетаксел, доксорубицин, этопозид, эпотилоны, флоксуридин, флударабин, фторурацил, гемцитабин, гидроксимочевина, идарубицин, ифосфамид, иринотекан, ломустин, мехлоретамин, меркаптопурин, мелфалан, метотрексат, рапамицин (сиролимус), митомицин, митотан, митоксантрон, нитрозомочевина, паклитаксел, памидронат, пентостатин, пликамицин, прокарбазин, ритуксимаб, стрептозоцин, тенипозид, тиогуанин, тиотепа, таксаны, винбластин, винкристин, винорелбин, таксол, комбретастатины, дискодермолиды, трансплатинум, ингибиторы тирозинкиназы (генистеин) и другие химиотерапевтические средства.

Используемый здесь термин «химиотерапевтическое средство» означает средство, обладающее активностью, направленной против ракового заболевания, новообразований и/или пролиферативных заболеваний. Предпочтительными химиотерапевтическими средствами являются доцетаксел и паклитаксел, используемые в виде частиц, содержащих альбумин, где более чем 50% химиотерапевтического средства присутствует в форме наночастиц. Наиболее предпочтительное химиотерапевтическое средство включает частицы связанного с альбумином паклитаксела, например Abraxane®.

Подходящими терапевтическими средствами также являются, например, биологически активные агенты (TNF, от tTF); радионуклиды (131I, 90Y, 111In, 211At, 32P и другие известные терапевтические радионуклиды); антиангиогенные агенты (ингибиторы ангиогенеза, например, INF-альфа, фумагилин, ангиостатин, эндостатин, талидомид и т.п.); другие биологически активные полипептиды; средства, повышающие чувствительность к терапии; антитела; лектины и токсины.

Заболеваниями, на лечение которых направлено применение настоящего изобретения, являются злокачественные и предзлокачественные состояния, а также пролиферативные заболевания, включая, но не ограничиваясь ими, такие пролиферативные заболевания, как, например, доброкачественная гиперплазия предстательной железы, эндометриоз, гиперплазия эндометрия, атеросклероз, псориаз, иммунологическое пролиферативное заболевание или пролиферативная гломерулопатия почек.

Термин «терапевтически эффективное количество» означает количество, которое обеспечивает восстановление, частично или полностью, физиологических или биохимических параметров, ассоциированных с заболеванием или состоянием, или индуцированных таким заболеванием или состоянием. Врач-клиницист может самостоятельно определить количество фармацевтической композиции, которое является терапевтически эффективным для лечения конкретного заболевания или состояния. Так, например, в соответствии с предпочтительным вариантом изобретения указанным терапевтическим средством является паклитаксел, который может быть введен в дозе в пределах примерно от 30 мг/м2 до 1000 мг/м2 примерно с интервалами в 3 недели (то есть эту дозу паклитаксела вводят один раз приблизительно через каждые три недели), желательно примерно от 50 мг/м2 до 800 мг/м2, предпочтительно, примерно от 80 мг/м2 до 700 мг/м2, а наиболее предпочтительно, примерно от 250 мг/м2 до 300 мг/м2 примерно с интервалами в 3 недели, предпочтительно, примерно в 2 недели, а более предпочтительно, еженедельно.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение также относится к способу диагностики. Так, например, диагностическим агентом может быть меченое вещество или метка, включая, но не ограничиваясь ими, радиоактивные вещества, контрастные вещества для МРТ, контрастные вещества для рентгенографии, контрастные вещества для ультразвуковой диагностики и контрастные вещества для ПЭТ. В этом аспекте настоящего изобретения также рассматривается взаимодействие этих веществ с описанными терапевтическими средствами. Кроме того, термин «диагностически эффективное количество» означает количество фармацевтической композиции, которое в соответствующих клинических условиях позволяет достаточно точно установить наличие и/или степень аномальной пролиферативной активности, гиперплазиии, ремоделирования и воспалительной активности в тканях и органах. Так, например, состоянием, «диагностированным» в соответствии с настоящим изобретением, может быть доброкачественная или злокачественная опухоль.

Описанными здесь диагностическими средствами являются полипептиды, такие как антитела, которые могут быть помечены путем ковалентного или нековалентного связывания с веществом, передающим детектируемый сигнал. Специалистам известен широкий ряд меток и методов конъюгирования, подробно описанных в научной и патентной литературе. Подходящми метками являются радионуклиды, ферменты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, флуоресцентные молекулы, хемилюминесцентные молекулы, магнитные частицы и т.п. Патентами, в которых описано использование таких меток, являются патенты США № 3817837; 3850752; 3939350; 3996345; 4277437; 4275149 и 4366241. Могут быть также продуцированы рекомбинантные иммуноглобулины, см., Cabilly, патент США № 4816567; Moore, et al., патент США № 4642334; и Queen, et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033.

Может быть проведен мониторинг доставки терапевтических или диагностических средств в участок опухоли или в другой участок поражения с использованием композиций согласно изобретению и с применением способов согласно изобретению, и такая доставка может быть оценена любым подходящим методом, включая, например, введение в данную композицию радиоактивной метки или рентгеноконтрастной метки и ее визуализацию, если это необходимо, и методы такой доставки хорошо известны среднему специалисту в данной области. Мониторинг секвестрации композиций в жидкостном пространстве плазмы может быть проведен любым подходящим методом, включая, например, венепункцию.

В других и в родственных своих аспектах настоящее изобретение относится к способу предсказания или оценки ответа опухоли на химиотерапевтическое средство, а также к способу предсказания или оценки ответа пролиферативного заболевания на действие химиотерапевтического средства или к способу лечения пролиферативного заболевания, включая, но не ограничиваясь ими, такие пролиферативные заболевания, как, например, доброкачественная гиперплазия предстательной железы, эндометриоз, гиперплазия эндометрия, атеросклероз, псориаз, иммунологическое пролиферативное заболевание или пролиферативная гломерулопатия почек.

V. Настоящее изобретение относится к гибридным белкам, в которых домены пептидного лиганда связаны с полипептидными активными агентами

В настоящем изобретении также рассматривается присоединение доменов пептидного лиганда к полипептидным активным агентам с образованием гибридных белков. В качестве неограничивающего примера можно отметить, что последовательности доменов пептидного лиганда могут быть присоединены в положениях выше или ниже от диагностически ценных доменов белков (таких как гаптен, GFP); веществ, повышающих чувствительность к терапии; активных доменов белков (например, таких как, но не ограничивающихся ими, tTF, TNF, пептид р44, происходящий от Smarl, интерферон, TRAIL, Smac, VHL, прокаспаза, каспаза и IL-2); или токсина (например, такого как, но не ограничивающегося ими, рицин, PAP, дифтерийный токсин, экзотоксин Pseudomonas).

Термины «гибридный белок» и «гибридный полипептид» означают полипептид, имеющий по меньшей мере две части, ковалентно связанные друг с другом, где каждая из этих частей представляет собой полипептид, обладающий отличающимся свойством. Таким свойством может быть биологическое свойство, например активность in vitro или in vivo. Указанным свойством может быть также простое химическое или физическое свойство, такое как способность связываться с молекулой-мишенью, катализ реакции и т.п. Части могут быть связаны непосредственно простой пептидной связью или посредством пептидного линкера, содержащего один или несколько аминокислотных остатков. Вообще говоря, указанные части и линкер могут быть связаны друг с другом с сохранением рамки считывания.

VI. Антитело или активные агенты фрагмента антитела

В конкретном аспекте изобретения, терапевтическим средством может быть антитело или фрагмент антитела, которые опосредуют одну или несколько функций, таких как активация комплемента, клеточно-опосредуемая цитотоксичность, апоптоз, гибель некрозирующих клеток и опсонизация.

Используемый здесь термин «антитело» включает, но не ограничивается ими, моноклональные антитела, поликлональные антитела, димеры, мультимеры, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела). Антителами могут быть мышиные, человеческие, гуманизованные, химерные антитела или антитела, происходящие от организмов других видов. Антителом является белок, продуцируемый иммунной системой, обладающей способностью распознавать специфический антиген и связываться с ним. Антиген-мишень, в основном, имеет множество сайтов связывания, также называемых эпитопами, которые распознаются CDR, присутствующими на многих антителах. Каждое антитело, специфически связывающееся с другим эпитопом, имеет отличающуюся структуру. Так, например, один антиген может связываться с более чем одним соответствующим антителом. Антитело представляет собой полноразмерную молекулу иммуноглобулина или иммунологически активную часть полноразмерной молекулы иммуноглобулина, то есть молекулы, содержащей антигенсвязывающий сайт, который иммуноспецифически связывается с антигеном представляющей интерес мишени или его части, где такими мишенями являются, но не ограничиваются ими, раковые клетки или клетки, продуцирующие аутоиммунные антитела, ассоциированные с аутоиммунным заболеванием. Описанные здесь молекулы иммуноглобулина могут принадлежать к любому классу (например, IgG, IgE, IgM, IgD и IgA) или подклассу (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2). Иммуноглобулины могут происходить от организмов любых видов.

«Фрагменты антитела» представляют собой часть полноразмерного антитела, которая сохраняет нужную биологическую активность. В большинстве случаев «фрагментами антитела» являются антигенсвязывающие части или их вариабельные области. Примерами фрагментов антител являются Fab-, Fab'-, F(ab')2- и Fv-фрагменты; диантитела; линейные антитела; фрагменты, продуцируемые экспрессионной библиотекой Fab, антиидиотипические (анти-Id) антитела, CDR (комплементарность-определяющая область) и эпитоп-связывающие фрагменты любого из вышеупомянутых антител, которые иммуноспецифически связываются с антигенами раковых клеток, с вирусными антигенами или с микробными антигенами; молекулы одноцепочечного антитела и мультиспецифические антитела, образованные фрагментами антител. Однако определяемыми здесь «фрагментами антител» могут быть и другие, не связывающиеся с антигеном части антител, например такие, как, но не ограничивающиеся ими, «фрагменты антитела», которые могут представлять собой полноразмерные или неполные Fc-домены.

Описанными здесь моноклональными антителами, в частности, являются «химерные антитела», в которых часть тяжелой цепи и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, происходящих от конкретных видов или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, а остальная часть цепи(ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, происходящих от других видов или принадлежащих к антителам другого класса или подкласса, а также фрагменты таких антител, при условии, что они обладают нужной биологической активностью (патент США № 4816567). Представляющими интерес химерными антителами согласно изобретению являются «приматизированные» антитела, содержащие антигенсвязывающие последовательности вариабельного домена, происходящие от примата, не являющегося человеком (например, мартышки или человекообразной обезьяны), и последовательности константной области человеческого антитела.

Термины «антитело-зависимая клеточно-опосредуемая цитотоксичность» и «ADCC» означают клеточно-опосредуемую реакцию, в которой неспецифические цитотоксические клетки, экспрессирующие Fc-рецепторы (FcR) (например, природные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на клетках-мишенях, что впоследствии приводит к лизису клеток-мишеней. Первичные клетки, опосредующие ADCC, NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, а моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Для оценки ADCC-активности представляющей интерес молекулы может быть проведен анализ на ADCC in vitro (патент США № 55003621; патент США № 5821337). Эффекторными клетками, используемыми в таких анализах, являются мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и природные клетки-киллеры (NK). Альтернативно или дополнительно, ADCC-активность представляющей интерес молекулы может быть оценена in vivo, например, у животного-модели, описанной в публикации Clynes et al. PNAS (USA), 95:652-656 (1998).

Антитело, «индуцирующее клеточную гибель», представляет собой антитело, которое жизнеспособную клетку делает нежизнеспособной. Для того чтобы дифференцировать гибель глеток, индуцированную антитело-зависимой клеточно-опосредуемой цитотоксичностью (ADCC) или комплемент-зависимой цитотоксичностью (CDC), такая гибель клеток может быть определена in vitro в отсутствии комплемента и иммунных эффекторных клеток. Таким образом, анализ на клеточную гибель может быть осуществлен с использованием термоинактивированной сыворотки (то есть в отсутствии комплемента) и в отсутствии иммунных эффекторных клеток. Для того чтобы определить, может ли данное антитело индуцировать гибель клеток, может быть оценено нарушение целостности мембраны по поглощению иодида пропидия (PI), трипанового синего или 7AAD по сравнению с необработанными клетками. Антителами, индуцирующими гибель клеток, являются антитела, индуцирующие поглощение PI в анализе на поглощение PI в клетках BT474.

Антителом, «индуцирующим апоптоз», является антитело, которое индуцирует запрограммированную гибель клеток, определяемую по связыванию с аннексином V, фрагментации ДНК, сморщиванию клеток, увеличению объема эндоплазматического ретикулума, фрагментации клеток и/или образованию мембранных везикул (называемых апоптотическими тельцами).

VII. Способ модуляции распределения активных агентов

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к свойствам описанных здесь конъюгатов, которые содержат домен пептидного лиганда и которые могут быть использованы для разработки способов модуляции распределения активного агента в ткани животного, где указанные способы включают введение животному композиции, содержащей молекулу-конъюгат, включающую домен пептидного лиганда, конъюгированный с активным агентом, где указанный домен пептидного лиганда содержит пептид SEQ ID NO:1-117 или его гомолог, и где введение указанной композиции животному приводит к распределению активного агента в ткани, которое отличается от распределения в ткани, достигаемого после введения только одного активного агента.

Композиции и способы согласно изобретению могут оказаться желательными для модуляции распределения активного агента в ткани пораженного участка. Такая модуляция, предпочтительно, заключается в изменении концентрации активного агента в пораженном участке и/или в повышении уровня активного агента в крови (или увеличении времени полужизни), то есть в увеличении уровня активного агента по сравнению с уровнем, наблюдаемым при введении животному лишь одного активного агента (в неконъюгированной форме). Такая модуляция может также заключаться в увеличении скорости поглощения конъюгированной пептидной молекулы в ткани, в увеличении времени удерживания молекулы в сайте-мишени, то есть в опухоли; в повышении скорости диффузии конъюгированной пептидной молекулы в ткани, и/или в повышении уровня распределения конъюгированной пептидной молекулы в ткани, и в обеспечении соответствия скорости поглощения конъюгированной пептидной молекулы в ткани и скорости интернализации одного или нескольких тканевых рецепторов. Такие свойства могут быть определены любым подходящим методом, известным специалистам, включая, но не ограничиваясь ими, детектирование, локализацию и относительную количественную оценку соответствующим образом помеченного активного агента, например радиографическими, микроскопическими, химическими, иммунологическими методами или МРТ-методами.

Термин «увеличение скорости» означает увеличение скорости по меньшей мере примерно на 33%, предпочтительно, по меньшей мере примерно на 25%, более предпочтительно, по меньшей мере примерно на 15%, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере примерно на 10%. Термин «более высокая концентрация в пораженном участке» означает, что концентрация активного агента в конъюгате в пораженном участке по меньшей мере примерно на 33%, предпочтительно, по меньшей мере примерно на 25%, более предпочтительно, по меньшей мере примерно на 15%, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере примерно на 10% превышает концентрацию неконъюгированного активного агента в том же пораженном участке.

Подходящими пораженными участками являются, но не ограничиваются ими, участки, в которых наблюдаются аномальная пролиферация, ремоделирование ткани, гиперплазия, аномальное заживление ран в любой ткани организма, включая мягкие ткани, соединительные ткани, кость, твердые органы, кровеносные сосуды и т.п. Более конкретными примерами таких заболеваний являются рак, диабетическая или другая ретинопатия, воспаление, фиброз, артрит, рестеноз кровеносных сосудов или искусственных трансплантатов кровеносных сосудов или внутрисосудистых приспособлений и т.п., катаракта и дегенерация желтого пятна, остеопороз и другие заболевания костей, атеросклероз и другие заболевания, при которых часто наблюдается кальциноз.

В своем предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к способам диагностики и/или лечения опухолей, где указанная опухоль выбрана из группы, состоящей из опухолей ротовой полости, опухолей носоглотки, опухолей пищеварительной системы, опухолей дыхательных путей, опухолей кости, опухолей хряща, метастазов кости, саркомы, кожных опухолей, меланомы, опухолей молочной железы, опухолей половых органов, опухолей мочевыделительной системы, опухолей глаз, опухолей головного мозга и центральной нервной системы, глиомы, опухолей эндокринной системы, опухолей щитовидной железы, опухолей пищевода, опухолей желудка, опухолей тонкого кишечника, опухолей толстой кишки, опухолей прямой кишки, опухолей заднего прохода, опухолей печени, опухолей желчного пузыря, опухолей поджелудочной железы, опухолей ротоглотки, опухолей легких, опухолей бронхов, не-мелкоклеточной карциномы легких, мелкоклеточной карциномы легких, опухолей шейки матки, опухолей тела матки, опухолей яичника, опухолей вульвы, опухолей влагалища, опухолей предстательной железы, карциномы предстательной железы, опухолей яичек, опухолей пениса, опухолей мочевого пузыря, опухолей почек, опухолей почечной лоханки, опухолей мочеточника, опухолей головы и шеи, рака паращитовидной железы, болезни Ходжкина, не-ходжкинской лимфомы, множественной миеломы, лейкоза, острого лимфоцитарного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, острого миелоидного лейкоза и хронического миелоидного лейкоза. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу предсказания или определения ответа опухоли на действие химиотерапевтического средства, к способам лечения опухолевого заболевания и к наборам для предсказания ответа опухоли млекопитающего на действие химиотерапевтического средства, где указанной опухолью является саркома, аденокарцинома, плоскоклеточная карцинома, крупноклеточная карцинома, мелкоклеточная карцинома, базально-клеточная карцинома, почечно-клеточная карцинома, онкоцитома или их комбинации.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к композициям и к способам применения указанных композиций, где введение указанных композиций животному приводит к увеличению уровней активного агента в крови по сравнению с уровнем, наблюдаемым после введения лишь одного активного агента. Уровень активного агента в крови может быть измерен в любых единицах, включая, но не ограничиваясь ими, Cmax, Cmin и AUC. Термин «увеличение уровня в крови по сравнению с уровнем, наблюдаемым после введения лишь одного активного агента» означает увеличение уровня такого агента в крови по меньшей мере примерно на 33%, предпочтительно, по меньшей мере примерно на 25%, более предпочтительно, по меньшей мере примерно на 15%, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере примерно на 10%.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к композициям и к способам применения этих композиций, где введение указанных композиций животному приводит к увеличению времени полужизни активного агента в крови по сравнению с временем полужизни, наблюдаемым после введения лишь одного активного агента. Термин «увеличение времени полужизни активного агента в крови по сравнению с временем полужизни, наблюдаемым после введения лишь одного активного агента» означает увеличение времени полужизни в крови по меньшей мере примерно на 33%, предпочтительно, по меньшей мере примерно на 25%, более предпочтительно, по меньшей мере примерно на 15%, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере примерно на 10%.

VIII. Препараты и введение

Для применения in vivo активный агент, связанный с доменом пептидного лиганда, таким как SEQ ID NO:1-117 и его гомологи, предпочтительно, приготавливают в виде фармацевтической композиции, содержащей физиологически приемлемый носитель. В соответствии с настоящим изобретением может быть использован любой подходящий физиологически приемлемый носитель, в зависимости от способа введения. Специалисту в данной области известны носители, которые могут быть использованы в целях приготовления фармацевтической композиции, подходящей для ее использования в нужном способе введения.

Введение фармацевтических композиций согласно изобретению может быть осуществлено любым подходящим способом, включая, но не ограничиваясь ими, внутривенное введение, подкожное введение, внутримышечное введение, введение в брюшную полость, введение вовнутрь опухоли, пероральное введение, ректальное введение, вагинальное введение, интравезикулярное введение и введение путем ингаляции; причем, наиболее предпочтительными являются внутривенное введение и введение вовнутрь опухоли. Композиция может также включать любые другие подходящие компоненты, а в частности, компоненты, необходимые для повышения стабильности данной композиции и/или необходимые для конечного применения. В соответствии с этим настоящее изобретение включает широкое разнообразие подходящих препаратов, содержащих композицию согласно изобретению. Нижеследующие препараты и способы приводятся лишь в иллюстративных целях и не ограничивают объема изобретения.

Фармацевтические композиции могут также включать, если это необходимо, дополнительные терапевтически или биологически активные вещества. Так, например, в композиции могут присутствовать терапевтические средства, используемые для лечения конкретных заболеваний. Для снижения опухания и воспаления, ассоциированного с введением фармацевтической композиции in vivo и с физиологическим дистрессом, в композицию могут быть включены средства, снижающие воспаление, такие как ибупрофен или стероиды.

Носитель обычно является жидким, но может быть и твердым, либо он может представлять собой комбинацию жидких и твердых компонентов. Предпочтительным носителем является физиологически приемлемый (например, фармацевтически или фармакологически приемлемый) носитель (например, наполнитель или разбавитель). Физиологически приемлемые носители хорошо известны специалистам и являются легко доступными. Выбор носителя может быть осуществлен, по меньшей мере частично, в зависимости от локализации тканей-мишеней и/или клеток-мишеней, и от конкретного способа введения композиции.

Обычно такие композиции могут быть получены в виде препаратов для инъекций, либо в виде жидких растворов или суспензий; в виде твердых форм, подходящих для получения растворов или суспензий после добавления жидкости перед инъекцией, и эти препараты могут быть также эмульгированными. Фармацевтическими препаратами, подходящими для инъекций, являются стерильные водные растворы или дисперсии; препараты, содержащие известные стабилизаторы белка и лиопротектанты; препараты, включающие кунжутное масло, арахисовое масло или водный пропиленгликоль, и стерильные порошки для получения препаратов в виде стерильных растворов или дисперсий для инъекций, предназначенных для немедленного приема. Во всех случаях препарат должен быть стерильным и должен быть жидким до той степени, при которой он легко мог бы быть введен шприцем. Такой препарат должен быть стабильным в условиях его приготовления и хранения и должен быть защищен от контаминирующего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Растворы активных соединений в виде свободного основания или их фармакологически приемлемых солей могут быть приготовлены в воде, соответствующим образом смешанной с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксицеллюлоза. Дисперсии могут быть также приготовлены в глицерине, в жидких полиэтиленгликолях и в их смесях, а также в маслах. Такие препараты, при их хранении и применении в обычных условиях, содержат консервант, предотвращающий рост микроорганизмов.

Конъюгат, содержащий домен пептидного лиганда, может быть включен в композицию в нейтральной или солевой форме. Фармацевтически приемлемыми солями являются кислотно-аддитивные соли (образованные свободными аминогруппами белка) и соли, образованные неорганическими кислотами, такими как, например, соляная или фосфорная кислоты, или органическими кислотами, такими как уксусная, щавелевая, винная, миндальная кислота и т.п. Соли, образованные свободными карбоксильными группами, могут также происходить от неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа(III), и органических оснований, таких как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и т.п.

Препаратами, подходящими для парентерального введения, являются водные и безводные изотонические стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворенные вещества, сообщающие данному препарату изотоничность с кровью данного реципиента, и водные и безводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты, солюбилизаторы, загустители, стабилизаторы и консерванты. Указанные препараты могут содержаться в запаянных контейнерах, таких как ампулы и флаконы, в виде унифицированной дозы или доз для многократного приема, и могут храниться в виде осушенной вымораживанием (лиофилизованной) композиции, в которую, непосредственно перед ее использованием, необходимо добавить лишь стерильный жидкий наполнитель, например воду для инъекций. Инъецируемые растворы и суспензии для немедленного приема могут быть приготовлены из стерильных порошков, гранул и таблеток описанных ранее типов. В предпочтительном варианте изобретения конъюгат, содержащий домен пептидного лиганда, приготавливают в форме для инъекций (например, для парентерального введения). В этой связи желательно, чтобы данный препарат мог быть использован для введения вовнутрь опухоли, однако такой препарат может быть приготовлен в форме, подходящей для внутривенной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, подкожной инъекции и т.п.

Настоящее изобретение, если это необходимо, также относится к вариантам, в которых конъюгат, содержащий домен пептидного лиганда (то есть полипептид, содержащий домен пептидного лиганда и конъюгированный с активным агентом), также конъюгирован с полиэтиленгликолем (ПЭГ). Конъюгирование с ПЭГ может способствовать увеличению времени полужизни этих полипептидов в кровотоке, снижению иммуногенности и антигенности полипептида и улучшению их биологической активности. При этом может быть применен любой метод конъюгирования с ПЭГ, если он используется, включая, но не ограничиваясь им, реакцию взаимодействия метокси-ПЭГ с доступной(ыми) аминогруппой(ами) пептида или с другими реакционноспособными молекулами, такими как, например, гистидины или цистеины. Кроме того, для присоединения аминокислот с ПЭГ-реактивными группами к конъюгату, содержащему домен пептидного лиганда, могут быть применены методы рекомбинантных ДНК. Кроме того, в соответствии с некоторыми аспектами настоящего изобретения могут быть применены стратегии ПЭГилирования с высвобождением и с образованием гибридов, такие как ПЭГилирование полипептида, где молекулы ПЭГ, добавляемые в некоторые сайты молекулы-конъюгата, содержащего домен пептидного лиганда, высвобождаются in vivo. Примеры методов конъюгирования с ПЭГ известны специалистам. См., например, Greenwald et al., Adv. Drug Delivery Rev. 55:217-250 (2003).

Препаратами, подходящими для введения путем ингаляции, являются аэрозольные препараты. Аэрозольные препараты могут быть внесены в подходящие пропелленты под давлением, такие как дихлордифторметан, пропан, азот и т.п. Такие композиции могут быть также получены в не-герметичных сосудах для доставки с помощью аэрозольного ингалятора или распылителя.

Препараты, подходящие для ректального введения, могут быть приготовлены в виде суппозиториев путем смешивания активного ингредиента с различными основами, такими как эмульгирующиеся основы или водорастворимые основы. Препараты, подходящие для вагинального введения, могут быть приготовлены в виде пессариев, тампонов, кремов, гелей, паст, пен или спреев, содержащих, помимо активного ингредиента, соответствующие носители, известные специалистам.

Кроме того, композиция согласно изобретению может содержать дополнительные терапевтически или биологически активные вещества. Так, например, в данной композиции могут присутствовать терапевтические средства, используемые для лечения конкретных заболеваний. Для снижения опухания и воспаления, ассоциированного с введением фармацевтической композиции in vivo и с физиологическим дистрессом, в композицию могут быть включены средства, снижающие воспаление, такие как ибупрофен или стероиды.

В случае ингаляционной терапии фармацевтические композиции согласно изобретению желательно приготавливать в форме аэрозоля. Существуют аэрозольные генераторы и распылители, предназначенные для введения агента в твердой форме. Такие генераторы содержат частицы, которые предназначены для вдыхания или ингаляции, и создают объем аэрозоля, содержащего предварительно отмеренную дозу лекарственного средства, подаваемую со скоростью, подходящей для введения человеку. Примерами таких аэрозольных генераторов и ингаляторов являются известные специалистам ингаляторы и инсуффляторы с дозирующим клапаном. Если фармацевтические композиции согласно изобретению присутствуют в жидкой форме, то они могут быть приготовлены в виде аэрозоля, доставляемого с помощью любого подходящего устройства.

В случае внутривенного введения, внутрибрюшинного введения или введения вовнутрь опухоли фармацевтическая композиция согласно изобретению может быть приготовлена так, чтобы она содержала стерильные, водные и безводные растворы, суспензии или эмульсии активного соединения для инъекций, где указанные препараты, предпочтительно, должны быть изотоничными с кровью данного реципиента. Эти препараты могут содержать одно или несколько веществ, таких как антиоксиданты, буферы, поверхностно-активные вещества, сорастворители, бактериостаты, растворенные вещества, сообщающие данному препарату изотоничность с кровью данного реципиента, и другие компоненты препаратов, известные специалистам. Водные и безводные стерильные суспензии могут включать суспендирующие агенты и загустители. Указанные композиции могут содержаться, например, в запаянных ампулах и флаконах в виде унифицированной дозы или доз для многократного приема.

Способы согласно изобретению могут также составлять часть комбинированной терапии. Термин «комбинированная терапия» означает последовательное или одновременное введение терапевтического средства согласно изобретению вместе с другой терапевтической композицией, так, чтобы у млекопитающего, подвергаемого лечению, наболюдались благоприятные эффекты от введения такой комбинации.

XI. Настоящее изобретение может быть применено для лечения многих состояний

Композиции и способы согласно изобретению могут быть применены для диагностики или лечения различных заболеваний, включая, но не ограничиваясь ими, заболевания, при которых пораженными участками являются, но не ограничиваются ими, участки, в которых наблюдаются аномальная пролиферация, ремоделирование ткани, гиперплазия, аномальное заживление ран в любой ткани организма, включая мягкие ткани, соединительные ткани, кость, твердые органы, кровеносные сосуды и т.п. Более конкретными примерами таких заболеваний являются рак, диабетическая или другая ретинопатия, воспаление, фиброз, артрит, рестеноз кровеносных сосудов или искусственных трансплантатов кровеносных сосудов или внутрисосудистых приспособлений и т.п., катаракта и дегенерация желтого пятна, остеопороз и другие заболевания костей, атеросклероз и другие заболевания, при которых часто наблюдается кальциноз.

В своем предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к способам диагностики и/или лечения опухолей, где указанная опухоль выбрана из группы, состоящей из опухолей ротовой полости, опухолей носоглотки, опухолей пищеварительной системы, опухолей дыхательных путей, опухолей кости, опухолей хряща, метастазов кости, саркомы, кожных опухолей, меланомы, опухолей молочной железы, опухолей половых органов, опухолей мочевыделительной системы, опухолей глаз, опухолей головного мозга и центральной нервной системы, глиомы, опухолей эндокринной системы, опухолей щитовидной железы, опухолей пищевода, опухолей желудка, опухолей тонкого кишечника, опухолей толстой кишки, опухолей прямой кишки, опухолей заднего прохода, опухолей печени, опухолей желчного пузыря, опухолей поджелудочной железы, опухолей ротоглотки, опухолей легких, опухолей бронхов, не-мелкоклеточной карциномы легких, мелкоклеточной карциномы легких, опухолей шейки матки, опухолей тела матки, опухолей яичника, опухолей вульвы, опухолей влагалища, опухолей предстательной железы, карциномы предстательной железы, опухолей яичек, опухолей пениса, опухолей мочевого пузыря, опухолей почек, опухолей почечной лоханки, опухолей мочеточника, опухолей головы и шеи, рака паращитовидной железы, болезни Ходжкина, не-ходжкинской лимфомы, множественной миеломы, лейкоза, острого лимфоцитарного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, острого миелоидного лейкоза и хронического миелоидного лейкоза. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу предсказания или определения ответа опухоли на действие химиотерапевтического средства, к способам лечения опухолевого заболевания и к наборам для предсказания ответа опухоли млекопитающего на действие химиотерапевтического средства, где указанной опухолью являются саркома, аденокарцинома, плоскоклеточная карцинома, крупноклеточная карцинома, мелкоклеточная карцинома, базально-клеточная карцинома, почечно-клеточная карцинома, онкоцитома или их комбинации.

Настоящее изобретение относится к вариантам, в которых указанным заболеванием страдает млекопитающее, включая, но не ограничиваясь им, человека.

X. Наборы

Настоящее изобретение относится к наборам для лечения опухолевых заболеваний, включающим фармацевтический препарат и инструкции по его применению для лечения опухолевых заболеваний, где указанный фармацевтический препарат включает молекулу-конъюгат, который содержит домен пептидного лиганда, конъюгированный с активным агентом, а указанный домен пептидного лиганда содержит пептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:1-137, 139 или 140, или 141-143, или их гомолог, где указанный домен пептидного лиганда обладает аффинностью по отношению к альбумину человеческой сыворотки, имеющей константу равновесной диссоциации (Kd), составляющую примерно 700 мкM или менее, и где, но необязательно, указанная молекула-конъюгат также содержит второй домен пептидного лиганда, а также инструкции по применению указанных наборов (например, вкладыши в упаковку с указанием по применению лекарственного средства, разрешенного FDA).

XI. Аффинная очистка

Аффинная хроматография (также называемая аффинной очисткой) предусматривает осуществление специфического взаимодействия между молекулами посредством их связывания. Конкретный лиганд является химически иммобилизованным или «связанным» с твердым носителем таким образом, чтобы при пропускании комплексной смеси через колонку эти молекулы, обладающие специфической аффинностью связывания с лигандом, становились связанными. После отмывки других компонентов образца связанная молекула отделяется от носителя, что позволяет ее выделить из исходного образца.

Для каждой специфической аффинной системы необходим ряд характерных для этой системы условий, и для достижения каждой конкретной цели исследования, специалисты сталкиваются с определенными проблемами. В других статьях, относящихся к методам очистки белков, описаны факторы и условия, ассоциированные с применением конкретных систем очистки (см. пронумерованный список ниже). Тем не менее, общие принципы очистки являются одинаковыми для всех систем связывания лиганда с мишенью, и такие концепции рассматриваются в данном описании.

Аффинная очистка обычно включает следующие стадии:

(1) Инкубирование неочищенного образца с аффинным носителем, позволяющее молекуле-мишени, присутствующей в образце, связываться с иммобилизованным лигандом.

(2) Удаление несвязанных компонентов образца из носителя путем отмывки.

(3) Элюирование (диссоциация и выделение) молекулы-мишени с иммобилизованного лиганда путем замены буфера так, чтобы взаимодействие посредством связывания больше не осуществлялось.

Одно пропускание пробы сыворотки или образца клеточного лизата через аффинную колонку может давать более чем 1000-кратную очистку специфического белка, и при этом будет обнаруживаться только одна полоса, как может быть определено с помощью анализа методом гель-электрофореза (например, в ДСН-ПААГ).

Лиганды, которые связываются с белками основных классов (например, с антителами) или с наиболее распространенными метками в виде гибридных белков (например, 6xHis), являются коммерчески доступными и выпускаются в виде предварительно иммобилизованных форм, готовых для аффинной очистки. Альтернативно, более специализированные лиганды, такие как специфические антитела или представляющие интерес антигены, могут быть иммобилизованы с использованием одного из нескольких коммерчески доступных активированных аффинных носителей, например пептидный антиген может быть иммобилизован на носителе и использован для очистки антител, распознающих данный пептид.

В большинстве случаев, лиганды иммобилизуют на твердом носителе или «присоединяют» непосредственно к твердому носителю посредством образования ковалентных химических связей между конкретными функциональными группами на лиганде (например, такими как первичные амины, сульфгидрилы, карбоновые кислоты, альдегиды) и реакционноспособными группами на носителе (см. родственную статью, озаглавленную «Ковалентная иммобилизация»). Однако могут быть также осуществлены и методы непрямого связывания. Так, например, GST-меченный гибридный белок сначала может быть иммобилизован на глутатионовом носителе посредством аффинного взаимодействия глутатиона-GST, а затем он может быть подвергнут химической реакции перекрестного связывания для его иммобилизации. Затем иммобилизованный GST-меченный гибридный белок может быть использован для аффинной очистки партнера(ов) по связыванию гибридного белка.

В большинстве процедур по аффинной очистке, включающих взаимодействия «белок:лиганд», используются связывающие буферы при физиологических рН и ионной силе, такие как забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS). Это, в частности, относится к случаям, когда за основу аффинной очистки были взяты взаимодействия «антитело:антиген» или «нативный белок:белок». После осуществления взаимодействия посредством связывания носитель промывают дополнительным буфером для удаления несвязанных компонентов образца. Неспецифические (например, простые ионные) взаимодействия посредством связывания могут быть минимизированы путем добавления низких уровней детергента или путем умеренной коррекции концентрации соли в связывающем и/или в промывочном буфере. И наконец, для прекращения взаимодействия посредством связывания и высвобождения молекулы-мишени добавляют элюирующий буфер, а затем собирают продукт в очищенной форме. Элюирующий буфер может вызывать диссоциацию партнеров по связыванию при экстремальных значениях рН (низких или высоких), при высокой концентрации соли (ионной силе), а использование детергентов или хаотропных агентов, которые денатурируют одну или обе этих молекулы, позволяет удалять вещества, связывающиеся или конкурирующие с противолигандом. В большинстве случаев последующий диализ или обессоливание необходимы для замены элюирующего буфера для очищенного белка на более подходящий буфер в целях последующего хранения или проведения анализа данного белка.

Наиболее широко используемым элюирующим буфером для аффинной очистки белков является 0,1M глицин-HCl, pH 2,5-3,0. Этот буфер эффективно диссоциирует большинство комплексов, образующихся при взаимодействии «белок:белок» и «антитело:антиген», но при этом не оказывает какого-либо перманентного влияния на структуру белка. Однако некоторые антитела и белки разрушаются при низких рН, а поэтому элюированные фракции белка должны быть нейтрализованы непосредственно путем добавления 1/10 объема щелочного буфера, такого как 1M трис-ΗCl, pH 8,5. Другими элюирующими буферами, используемыми для аффинной очистки белков, являются буферы:

Системы наиболее часто используемых элюирующих буферов для аффинной очистки белков
Условия Буфер
рН 100 мM глицина-HCl, pH 2,5-3,0
100 мM лимонной кислоты, pH 3,0
50-100 мM триэтиламина или триэтаноламина, pH 11,5
150 мM гидроксид аммония, pH 10,5
Ионная сила и/или хаотропный эффекты 3,5-4,0 M хлорид магния, pH 7,0 в 10 мМ триса
5 М хлорид лития в 10 мМ фосфатном буфере, рН 7,2,
2,5 М иодид натрия, рН 7,5
0,2-3,0 тиоцианат натрия
Денатурирующие агенты 2-6 М гуанидин-HCl
2-8 М мочевина
1% дезоксихолат
1% ДСН
Органические вещества 10% диоксан
50% этиленгликоль, pH 8-11,5
(также хаотропный)
Конкурирующие агенты >0,1 M противолиганда или его аналога

Аффинная очистка включает стадию разделения молекул в растворе (подвижная фаза) на основе различий во взаимодействиях посредством связывания с лигандом, иммобилизованным на стационарной фазе (твердой фазе). Носителем или матрицей для аффинной очистки является любой материал, с которым ковалентно связывается биоспецифический лиганд. Обычно материал, используемый в качестве аффинной матрицы, является нерастворимым в системе, в которой присутствует молекула-мишень. Обычно, но не всегда, нерастворимая матрица является твердой. В литературе описаны сотни веществ, которые могут быть использованы в качестве аффинных матриц.

Подходящими аффинными носителями являются носители, которые имеют высокое отношение площади поверхности к объему, содержат химические группы, которые могут быть легко модифицированы для ковалентного связывания с лигандами, обладают минимальной способностью к неспецифическому связыванию, имеют хорошую текучесть и механическую и химическую стабильность. Вероятно, что при выборе аффинного носителя или аффинной матрицы для любого разделения, важнее всего ответить на вопрос, существует ли надежный коммерчески доступный источник для получения нужного матричного материала в требуемых количествах.

Иммобилизованные лиганды или активированные химические аффинные носители являются доступными для их использования в нескольких различных форматах. Для осуществления процедур колоночной очистки или лабораторной очистки наиболее часто используются перекрестно связанные сферические агарозные или полиакриламидные смолы. Для разделения клеток и для осуществления некоторых автоматизированных процедур очистки особенно подходящими являются магнитные частицы, на которых были иммобилизованы аффинные лиганды. Для очистки партнеров по связыванию, в качестве носителей для иммобилизующих лигандов могут быть даже использованы и полистироловые микропланшеты, которые наиболее часто применяются при проведении анализов.

Наиболее подходящими носителями для аффинной очистки белков обычно являются пористые гелевые носители. Носителями такого типа обычно являются полимерные смолы на основе сахаров или акриламида, которые получают в растворе (то есть в гидратированной форме) в виде сфер диаметром 50-150 мкм. Такой сферический формат позволяет использовать эти смолы в виде сырых взвесей, которые могут быть легко введены для заполнения и «набивки» колонок сферическими смолами любого размера. Эти сферы являются в высокой степени пористыми и достаточно крупными, что позволяет биомолекулам (белкам и т.п.) свободно растекаться по сферам и просачиваться между сферами, то есть они могут находиться между сферами и на поверхности этих сфер. Лиганды могут быть ковалентно связаны со сферическим полимером (на внешних и внутренних поверхностях) различными методами. В результате образуется рыхлая матрица, в которой молекулы образца могут свободно проходить далеко за пределы площади поверхности иммобилизованого лиганда.

В основном, большинство матриц, широко используемых в методах аффинной очистки белков, представляют собой сферическую агарозу с перекрестными связями, плотность которой обычно составляет 4% и 6%. (Это означает, что 1 мл сфер со смолой имеют более чем 90% воды по объему.)

Некоторые методы очистки антител включают процедуры аффинной очистки. Типичная лабораторная процедура получения антител включает использование относительно небольших объемов сыворотки, асцитной жидкости или супернатанта культуры. В зависимости от цели применения антитела в различных анализах и методах детектирования, такое антитело должно быть частично или полностью очищенным. Существуют три уровня специфичности очистки, которая осуществляется следующими способами.

Осаждение сульфатом аммония. Этот простой способ предусматривает грубую очистку полноразмерного иммуноглобулина от других белков сыворотки.

Аффинная очистка с использованием иммобилизованного белка A, G, A/G или L. Эти белки связываются с IgG большинства видов и подклассов, то есть с наиболее часто встречающимися иммуноглобулинами, вырабатываемыми у млекопитающих в ответ на действие иммуногенов. Готовые к применению смолы и наборы для очистки, содержащие эти белки, выпускаются в виде упаковок различных размеров и в различных форматах.

Аффинная очистка с использованием иммобилизованного антигена. Ковалентная иммобилизация очищенного антигена (то есть пептида или гаптена, используемого в качестве иммуногена для стимуляции продуцирования антитела у животного-хозяина) на аффинном носителе позволяет выделять специфическое антитело из неочищенных образцов. Активированные смолы и укомплектованные наборы для получения иммобилизованных антигенов посредством различных химических соединений являются коммерчески доступными. См. также: Seo et al., Characterization of a Bifidobacterium longum BORI dipeptidase belonging to the U34 family, Appl Environ Microbiol. 2007 Sep; 73(17):5598-606; Clonis YD, Affinity chromatography matures as bioinformatic and combinatorial tools develop, J Chromatogr A. 2006 Jan 6; 1101(l-2):l-24; Jmeian Y & El Rassi Z, Liquid-phase-based separation systems for depletion, prefractionation and enrichment of proteins in biological fluids for in-depth proteomics analysis, Electrophoresis. 2009 Jan; 30(1):249-61.

Настоящее изобретение относится к scFv, которые по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 99% идентичны любой одной из последовательностей SEQ ID NO:113-116 и которые имеют KD для белка SPARC, равную по меньшей мере 4×10-7 M, предпочтительно, 4×10-6 M, а более предпочтительно, 7×10-5 M, либо KD для белка SPARC, равную примерно от 3,3×10-7 до 7,8×10-5. Кроме того, настоящее изобретение относится к scFv, которые по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 99% идентичны любой одной из последовательностей SEQ ID NO:113-116 и которые по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 99% идентичны любой одной из последовательностей CDR SEQ ID NO:113-116 и имеют KD для белка SPARC, равную по меньшей мере 4×10-7 M, предпочтительно, 4×10-6 M, а более предпочтительно, 7×10-5 M, либо KD для белка SPARC, равную примерно от 3,3×10-7 М до 7,8×10-5 М.

Для лучшей иллюстрации настоящего изобретения приводятся нижеследующие примеры, которые не должны рассматриваться как ограничение его объема.

ПРИМЕР 1

В этом примере продемонстрированы идентификация SPARC-связывающих пептидов, проводимая с применением технологии фагового представления, и введение таких SPARC-связывающих пептидов в молекулы, используемые для лечения опухолевых заболеваний.

Более конкретно, главной целью изобретения является получение молекулы, содержащей SPARC-связывающий пептид, конъюгированный с терапевтическим или диагностическим средством. В частности, целью изобретения является получение гибридного белка «SPARC-связывающий пептид - Fc» (фиг.1), где Fc-домен антитела действует как терапевтическое средство посредством стимуляции иммунных функций, таких как, например, антитело-зависимая цитотоксичность (ADC) или клеточно-зависимая цитотоксичность (CDC).

Основным принципом технологии фагового представления является связывание лиганда (пептида, белка) с геном, кодирующим этот лиганд (см. фиг.2). В методе фагового представления это может быть достигнуто путем сцепления гена лиганда с геном, кодирующим оболочечный белок нитчатого фага. Затем рекомбинантный фаговый геном вводят в Escherichia coli, где гибридный белок экспрессируется вместе со всеми другими фаговыми белками. После этого гибридный белок вводят в фаговую оболочку, содержащую фаговый геном (включающий ген лиганда). Секретированная фаговая частица, представляющая лиганд, может быть отобрана на иммобилизованной мишени, а все несвязанные фаги удаляют путем промывки. После проведения стадии элюирования выделенный фаг используют для инфицирования E. coli, что позволяет проводить амплификацию этого фага для нового раунда отбора и, в конечном счете, для проведения анализа на связывание.

В соответствии с этим коммерчески доступную пептидную библиотеку фагового представления (12-мерные пептиды в М13) скринировали на пептиды, связывающиеся с SPARC. Мишень, то есть SPARC, представляет собой кислый гликопротеин с PI=4,6. Пептидную библиотеку Ph.D.-12 скринировали в четырех раундах отбора связывающихся пептидов с применением метода фагового представления, который проводили путем иммобилизации на 96-луночных планшетах с буфером для нанесения покрытий, pH 9,6. В частности, связанные фаги элюировали кислотным элюирующим раствором в 1-м раунде скрининга. Затем жесткость скрининга постепенно увеличивали путем снижения концентрации белка-мишени и увеличения процента твина-20 в промывочном буфере. Одновременно с этим для повышения специфичности скрининга осуществляли конкурентное элюирование избыточным количеством мишени. И наконец, после проведения четырех раундов скрининга, оцДНК отобранных клонов подвергали ДНК-секвенированию. Одновременно с этим связывание позитивных фагов с белком-мишенью подтверждали с помощью ELISA фага.

Результаты такого скрининга пептидной библиотеки фагового представления на наличие SPARC-связывающих пептидов приводятся на фиг. 3 и 4. Связывание с SPARC может быть количественно оценено по числу выделенных фаговых клонов, кодирующих пептиды с той же самой последовательностью (фиг. 3), или по авидности SPARC-связывания, оцененной по связыванию пептид-экспрессирующего фага с лунками микротитрационного планшета, покрытыми SPARC (фиг. 4). Были дополнительно охарактеризованы два пептида, идентифицированные методом фагового представления, PD15 (SEQ ID NO:1) и PD21 (SEQ ID NO:2).

Затем PD15 и PD21 клонировали в экспрессионный вектор pFUSE-hIg1-Fc2 (фиг. 5) с получением плазмид, кодирующих гибридные белки PD15-Fc и PD21-Fc (фиг. 6). Эти гибридные белки экспрессировали и последовательно очищали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (фиг. 7).

Анализ микромассивов белков (см. фиг. 8) PD15 и PD21 указывал лишь на минимальную перекрестную реактивность с белками, не являющимися SPARC, где анализируемый массив включал 5000 белков (Invitrogen, ProtoArray v.3).

ELISA-анализы на связывание в зависимости от концентрации, иллюстрирующие связывание PD15 и PD21 с SPARC, показали, что такое связывание было лишь несколько слабее, чем связывание с анти-SPARC антителом (фиг. 9). Kd для SPARC-связывающего PD15 составляет 4,1±0,6×10-8 M, а Kd для PD21 составляет 1,0±0,7×10-7 M. (Протестированное анти-SPARC антитело имеет Kd для связывания с SPARC, равную 6,2±3,4×10-9 M, то есть это означает, что данное антитело связывается с SPARC лишь с несколько большей авидностью.)

На фиг. 10 и 11 показаны со-локализация SPARC (на что указывало иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание анти-SPARC антителом) и связывание PD15 и PD21 в срезах опухолей человеческого головного мозга (которые имели эпитоп, помеченный для ИГХ-окрашивания). Как указано на фигуре 10, приводимые в литературе данные по связыванию стабилина 1 со SPARC не были подтверждены, поскольку stab-Fc не связывался с опухолевой тканью, а PD15 и PD21 связывались с этой тканью (фиг. 11).

Анализ гомологии последовательностей SPARC-связывающих пептидов, выделенных методом фагового представления, продемонстрировал, что ряд выделенных последовательностей SPARC-связывающих пептидов были идентичны последовательностям области эластина, представленной на фиг. 12.

Таким образом, в этом примере продемонстрировано, что SPARC-связывающие пептиды могут быть идентифицированы методом фагового представления, а также описаны другие методы характеризации идентифицированных пептидов. Из двух рабочих клонов PD15 и PD21, PD15 обладал более высокой аффинностью по отношению к SPARC, чем PD21, на что указывали ELISA- и ИГХ-эксперименты.

ПРИМЕР 2

Гибридные белки PD15 и PD21 - Fc анализировали на противоопухолевую активность на мышах с моделью человеческого ксенотрансплантата карциномы предстательной железы PC3. Оба этих гибридных белка PD15 и PD21 - Fc продемонстрировали статистически значимое ингибирование роста опухоли (фиг. 13). PD15 обнаруживал более высокую противоопухолевую активность, чем PD21 в отношении ксенотрансплантата PC3. У мышей с моделью человеческого ксенотранспланта HT29 толстой кишки PD21 обладал более высокой противоопухолевой активностью, чем PD15, причем такая активность была почти эквивалентна активности абраксана (фиг. 14).

ПРИМЕР 3

В этом примере продемонстрирована потенциальная иммуногенность SPARC-связывающих пептидов.

Программа ProPred представляет собой графический web-инструмент для предсказания связывающих областей MHC класса II в последовательностях антигенного белка (см. Singh et al.: ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. Bioinformatics 2001, 17(12):1236-7). Алгоритм предсказания на основе серверной матрицы, в котором используется таблица коэффициентов аминокислот/положений, был взят из литературы. Предсказанные связующие вещества могут быть визуализированы как пики в графическом интерфейсе или как окрашенные остатки в интерфейсе HTML. Этот сервер может быть полезным инструментом в определении локализации беспорядочно расположенных связывающих областей, которые могут связываться с несколькими аллелями HLA-DR.

Результаты ProPred-анализа SPARC-связывающих пептидов, идентифицированных методом фагового представления, включая PD21 и PD15, показали, что лишь несколько молекул HLA-DR представляют эти пептиды, и эти результаты позволяют предположить, что такие пептиды имеют невысокую иммуногенность.

Любой из описанных здесь пептидов, включая, например, SEQ ID:1-112 или 117, обладающий высокой аффинностью, может быть аналогичным образом проанализирован на низкую иммуногенность или на отсутствие иммуногенности.

ПРИМЕР 4

Фрагменты антител могут быть также представлены на фагах в различных форматах. Одноцепочечный фрагмент вариабельной области (scFv) представляет собой гибрид вариабельных областей тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, связанных друг с другом посредством короткого (обычно серинового, глицинового) линкера. Такая химерная молекула сохраняет специфичность исходного иммуноглобулина несмотря на отсутствие константных областей и введение линкерного пептида. Наиболее распространенные форматы метода фагового представления антитела включают использование библиотек scFv. Таким образом, большие наборы вариантов антител могут быть скринированы на присутствие антиген-связывающего клона.

Общая стратегия заключается в предварительном скрининге библиотек фагового представления человеческих антител с помощью ELISA с использованием SPARC в качестве антигена.

Сначала, HuScL-3® скринировали в четыре раунда (три раунда - с элюированием кислотой, и один раунд - с конкурентным элюированием), и 17 позитивных клонов отбирали с помощью ELISA фага. ДНК-секвенирование этих клонов выявило две уникальных последовательности антитела, из которых 1-я последовательность имела общие 15 позитивных клонов, а 2-я последовательность имела общие остальные два позитивных клона. После этого специфичность связывания двух уникальных антител подтверждали с помощью ELISA растворимого scFv.

Затем, HuScL-2® скринировали в три раунда (два раунда - с элюированием трипсиновым гидролизатом, и один раунд - с конкурентным элюированием). По окончании эксперимента было отобрано 30 позитивных клонов с помощью ELISA фага. В соответствии с результатами секвенирования было установлено, что 29 клонов имели одну общую последовательность антитела, а один клон кодировал другое уникальное антитело. После этого специфичность связывания этих двух антител также подтверждали с помощью ELISA растворимого scFv.

Были идентифицированы четыре уникальных ScFv против SPARC, а именно ScFv 3-1, ScFv 3-2, ScFv 2-1 и ScFv 2-2 (SEQ ID NO:113-116). На фиг. 17 показаны последовательности ScFv 3-1, ScFv 3-2, ScFv 2-1 и ScFv 2-2 (SEQ ID NO:113-116), где антигенсвязывающие CDR подчеркнуты.

ПРИМЕР 5

В этом примере описана очистка репрезентативных SPARC-связывающих ScFv.

На фиг. 18 проиллюстрирована очистка на колонке с никелем и характеризация ScFv2.1 путем секвенирования концевых аминокислот и электрофореза в ДСН-ПААГ scfv2.1, выделенных из бактерий (A, экспрессированная последовательность; B, аффинная хроматография; C, ДСН-ПААГ; D, данные N-концевой аминокислотой последовательности).

На фиг. 19 проиллюстрирована очистка и характеризация ScFv2.1 путем секвенирования концевых аминокислот и электрофореза в ДСН-ПААГ scfv3.1, выделенных из бактерий (A, экспрессированная последовательность; B, аффинная хроматография; C, ДСН-ПААГ; D, данные N-концевой аминокислотой последовательности).

На фиг. 20 проиллюстрировано определение KD очищенных ScFv2.1, scFv3.1 и scFv3.2 для связывания с SPARC. A, сенсорограммы типичного эксперимента Biacore, проводимого с использованием SPARC-иммобилизованного чипа, и ScFv2.1 в качестве проходящего через колонку фрагмента; B, KD для ScFv2-1, ScFV3-1 и ScFV3-2 против SPARC (HTI SPARC представляет собой тромбоцитарный SPARC, полученный от HTI; Abx SPARC представляет собой SPARC, выделенный из сконструированных клеток HEK293 и поставляемый в виде очищенного препарата от Abraxis).

Все документы, включая публикации, патентные заявки и патенты, цитируемые в настоящей заявке, во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки, так, как если бы каждый из перечисленных документов был отдельно и конкретно введен в настоящее описание посредством ссылки.

При употреблении артиклей «а», «an» и «the» и аналогичных грамматических элементов в контексте описания настоящего изобретения (а в частности, в контексте нижеследующей формулы изобретения) подразумевается, что существительные, с которыми употребляются эти артикли и элементы, могут присутствовать как в единственном числе, так и во множественном числе, если это явно не противоречит контексту изобретения. Термины «составляющий», «имеющий», «включающий» и «содержащий» имеют неограничивающий смысл (то есть означают «включающий, но не ограничивающийся ими»), если это не оговорено особо. Указание интервалов рассматриваемых здесь величин приводится лишь для краткости изложения, которое относится к каждой отдельной величине, входящей в данный интервал, если это не оговорено особо, и такая каждая отдельная величина входит в объем описания изобретения, как если бы она была указана отдельно. Все описанные здесь методы могут быть осуществлены в любом порядке, если это не оговорено особо, и если это явно не противоречит контексту изобретения. Любой используемый здесь пример, или все примеры, или любое типичное словосочетание (например, «такой как») приводятся лишь для лучшего понимания изобретения и не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения, если это не выходит за рамки формулы изобретения. Ни одно словосочетание, употребляемое в описании настоящего изобретения, не должно быть сформулировано так, чтобы оно указывало на какой-либо незаявленный элемент как на элемент, играющий главную роль в практическом осуществлении настоящего изобретения.

В настоящей заявке описаны предпочтительные варианты настоящего изобретения, которые, по мнению авторов, включают наилучший способ осуществления изобретения. В указанные предпочтительные варианты могут быть внесены модификации, которые будут очевидными для среднего специалиста в данной области после прочтения им описания изобретения, представленного выше. Авторы настоящего изобретения надеются, что специалист в данной области может использовать такие варианты, если он сочтет это необходимым; при этом авторы, в принципе, не исключают, что способ осуществления настоящего изобретения может отличаться от конкретно описанного здесь способа. В соответствии с этим настоящее изобретение включает все модификации и эквиваленты рассматриваемого объекта, заявленного в прилагаемой формуле изобретения, если это позволяют применяемые правовые нормы. Кроме того, в объем настоящего изобретения входит любая комбинация вышеописанных элементов во всех возможных их вариантах, если это не оговорено особо, и если это явно не противоречит контексту изобретения.

1. Композиция для лечения состояния, связанного с повышенной экспрессией SPARC, включающая антитело в формате ScFv в эффективном количестве, связанное с терапевтическим средством, где ScFv имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115 или SEQ ID NO:116, и связывается с белком SPARC с KD, составляющей по меньшей мере 7,8·10-5 М.

2. Композиция по п.1, где указанным терапевтическим средством является фрагмент антитела, содержащий функциональный Fc-домен антитела.

3. Композиция по п.2, где указанный функциональный Fc-домен антитела содержит последовательность SEQ ID NO:118.

4. Композиция по любому из пп.1-3, дополнительно включающая фармацевтический носитель.

5. Способ лечения млекопитающего, страдающего пролиферативным заболеванием с повышенной экспрессией SPARC, включающий введение терапевтически эффективного количества композиции по любому из пп.1-4.

6. Способ по п.5, где указанное заболевание представляет собой рак.

7. Способ по любому из пп.5 или 6, где указанное млекопитающее представляет собой человека.

8. Композиция для диагностики состояния, связанного с повышенной экспрессией SPARC, включающая антитело в формате ScFv в эффективном количестве, связанное с диагностическим средством, где ScFv имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115 или SEQ ID NO:116, и связывается с белком SPARC с KD, составляющей по меньшей мере 7,8·10-5 М.

9. Анти-SPARC ScFv, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:113-116.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области кристаллизации антител. .

Изобретение относится к биохимии и представляет собой варианты антител, связывающих IL-22 человека. .

Изобретение относится к биохимии и представляет собой человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с GM-CSF приматов и нейтрализуют его.

Изобретение относится к биохимии и представляет собой изолированное человеческое или гуманизированное антитело или его функциональный фрагмент, которое является специфическим в отношении человеческого GM-CSF.

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к биофармацевтической промышленности, а именно к биопрепарату актопротекторного, адаптогенного действия. .
Изобретение относится к медицине и фармакологической промышленности, касается создания фармацевтической композиции (ФК), разработанной на основе действующих веществ, выделенных из растений.

Изобретение относится к области кристаллизации антител. .

Изобретение относится к новому комплексному соединению 5-гидрокси-6-метилурацила с сукцинатом натрия (5-гидрокси-6-метилурацил сукцинату) формулы: проявляющему антигипоксическую активность.

Изобретение относится к новым N, S-замещенным производным изотиомочевин общей формулы (I): где R=(CH3)2CH; C 2H5, обладающим NOS-ингибирующим, вазоконстрикторным и радиозащитным действием.
Изобретение относится к медицине, а именно к сосудистой хирургии и анестезиологии, и может быть использовано при хирургическом лечении варикозной болезни нижних конечностей с использованием эндовазальной лазерной коагуляции вен.

Изобретение относится к медицине, в частности к профилактическому геропротекторному средству. .

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к средству, повышающему работоспособность, переносимость экстремальных нагрузок, адаптируемость к экстремальным условиям.
Наверх