Способ лабораторной диагностики клещевого риккетсиоза с использованием иммуноферментного анализа для определения антител к антигену rickettsia sibirica


 


Владельцы патента RU 2477860:

Федеральное государственное учреждение науки "Омский научно-исследовательский институт природноочаговых инфекций" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Изобретение относится к области медицины, иммунологии и биотехнологии и касается способа диагностики клещевого риккетсиоза. Способ заключается в определении иммуноглобулинов классов М и G к возбудителю клещевого риккетсиоза (Rickettsia sibirica) в сыворотке крови пациентов методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием в качестве антигена диагностикум риккетсиозный Сибирика сухой для РСК и оценке результатов по оптической плотности. Представленный способ позволяет с высокой точностью выявить антитела к R. sibirica в сыворотке (плазме) крови человеке в ранние сроки заболевания. 2 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, иммунологии и биотехнологии. В настоящее время в качестве серологических тестов для лабораторной диагностики клещевого риккетсиоза (КР), вызываемового Rickettsia sibirica, рекомендованы реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) и реакция связывания комплемента (РСК) (МУ 3.1.1755-03, 2004 г.). Однако для постановки РНИФ необходим корпускулярный антиген, коммерческий выпуск которого отсутствует. Существенным недостатком РНИФ является также возможность осуществлять достоверную диагностику риккетсиоза лишь не ранее 13-15 дня от начала заболевания. Другим (традиционным) методом, применяемым в лабораторной диагностике КР, остается РСК. В настоящее время осуществляется коммерческий выпуск «Диагностикум риккетсиозного Сибирика сухого для РСК». Коммерческие цельнорастворимые антигены для РСК обладают выраженной группоспецифичностью и низкой чувствительностью (выявляют антитела примерно у половины больных с диагнозом «клещевой риккетсиоз»). Кроме того, стандартная методика РСК выявляет суммарные антитела без дифференциации по классам иммуноглобулинов.

Наиболее близким по технической сущности решением (аналогом) к заявленному изобретению по совокупности признаков является способ диагностики клещевого риккетсиоза путем выявления антител к R. sibirica с использованием РСК, основанной на применении «Диагностикума риккетсиозного Сибирика сухого для РСК» (Инструкция по применению утверждена Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 01.07.1999).

Задача изобретения - повышение точности и упрощение технологии лабораторной диагностики КР путем выявления антител методом иммуноферментного анализа, позволяющего с высокой специфичностью и чувствительностью выявлять антитела к R. sibirica в сыворотке (плазме) крови человека в ранние сроки заболевания.

Сущность предлагаемого технического решения состоит в том, что выявление антител в сыворотке (плазме) к возбудителю КР R. sibirica проводят при помощи непрямого иммуноферментного анализа на твердофазном носителе с использованием коммерческого диагностикума риккетсиозного Сибирика сухого для РСК. Данный диагностикум представляет собой лиофилизированные антигенные комплексы, выделенные методом эфирной обработки из R. sibirica, выращенных в желточных мешках развивающихся куриных эмбрионов и инактивированных фенолом. Применение одной схемы ИФА с двумя различными коньюгатами Polyclonal Rabbit Anti-Human IgM/HRP, Dako Denmark A/S Produktionsvei 42 Denmark DK-2600 Glostrup и Polyclonal Rabbit Anti-Human IgG/HRP, Dako Denmark A/S Produktionsvei 42 Denmark DK-2600 Glostrup, представляющими собой поликлональные иммуноглобулины кролика против иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой хрена, позволяет выявлять иммуноглобулины классов М и G, т.е. проводить как раннюю, так и ретроспективную диагностику КР.

Технический результат - использование иммуноферментного анализа на основе коммерческого диагностикума риккетсиозного Сибирика сухого для РСК позволяет почти вдвое, в сравнении с РСК, повысить эффективность верификации диагноза «клещевой риккетсиоз» за счет повышения чувствительности заявляемого теста (91,7% и 52,9% соответственно).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Определение иммуноглобулинов класса М к R. sibirica методом иммуноферментного анализа.

Для постановки ИФА используют следующее.

1. «Диагностикум риккетсиозный Сибирика сухой для РСК» (серия 6 К 1299) ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ, г.Пермь.

2. Раствор хлорида натрия 0,9% для разведения диагностикума риккетсиозного Сибирика.

3. Сыворотка лошадиная нормальная.

4. В качестве коньюгата - поликлональные иммуноглобулины кролика против иммуноглобулинов М человека, меченные пероксидазой хрена (Polyclonal Rabbit Anti-Human IgM/HRP, Dako Denmark A/S Produktionsvei 42 Denmark DK-2600 Glostrup).

5. Субстратный буферный раствор - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин - в качестве хромогена, прозрачная бесцветная жидкость.

6. Фосфатно-солевой pH 7,3 (или карбонатно-бикарбонатный pH 9,6) буферный раствор для разведения образцов.

7. Фосфатно-солевой буферный раствор с твином 20 для отмывки.

8. Стоп-реагент - раствор серной кислоты 0,75 моль/л, прозрачная бесцветная жидкость.

9. Исследуемая сыворотка (плазма) крови.

10. Положительный контрольный образец, инактивированный, слегка опалесцирующая жидкость, полученная путем смешивания 5 положительных в РСК сывороток больных клещевым риккетсиозом людей.

11. Отрицательный контрольный образец, инактивированный, слегка опалесцирующая жидкость, полученная путем смешивания 10 сывороток здоровых людей (доноров).

Процедура выполнения ИФА.

Для сенсибилизации полистерола поверхностей лунок планшета используют диагностикум риккетсиозный Сибирика сухой для РСК в разведении 1:4 в объеме 50 мкл в каждую лунку. Закрытый крышкой планшет выдерживают в течение 18 часов при температуре +4°C или в условиях влажной камеры в течение 2 часов при температуре 37°C. Содержимое лунок удаляют без промывания планшета. Затем в лунки планшета вносят исследуемые сыворотки в объеме 50 мкл в разведениях от 1:10 до 1:50, приготовленных на 0,05 М фосфатно-солевом буфере (ФСБ) pH 7,3, содержащем 10% цельной лошадиной сыворотки. После внесения разведений сывороток закрытый крышкой планшет выдерживают в течение 1 часа при температуре 37°C. Далее содержимое лунок удаляют в емкость для сбора инфицированного материала и лунки планшета промывают 3 раза рабочим промывочным раствором (фосфатно-солевой буфер) в объеме 350 мкл. Во все лунки планшета вносят по 50 мкл конъюгата - Polyclonal Rabbit Anti-Human лунки планшета вносят по 50 мкл конъюгата - Polyclonal Rabbit Anti-Human IgM/HRP, Dako Denmark A/S Produktionsvei 42 Denmark DK-2600 Glostrup в разведении 1:1000. Для получения нужного разведения конъюгата используют 0,05М ФСБ pH 7,3, содержащий 10% цельной лошадиной сыворотки. После внесения конъюгата закрытый крышкой планшет выдерживают в течение 1 часа при температуре 37°C. Далее, содержимое лунок удаляют в емкость для сбора инфицированного материала и лунки планшета промывают 5 раз рабочим промывочным раствором (фосфатно-солевой буфер) в объеме 350 мкл. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл субстратного буферного раствора (раствор тетраметилбензидина) и выдерживают 15 мин в защищенном от света месте при температуре 20°±2°C. Реакцию останавливают добавлением во все лунки планшета по 50 мкл стоп-реагента (0,75 моль/л раствор серной кислоты).

Учет результатов проводят спектрофотометрически при длине волны 450 нм с настройкой прибора «по воздуху». Интерпретацию результатов проводят следующим образом: значение оптической плотности каждой исследуемой сыворотки делят на произведение среднего арифметического значения показателей оптических плотностей позитивного и негативного контроля. Проба считается положительной, если оптическая плотность анализируемой сыворотки выше значения (cut off), рассчитанного по формуле (ОПкк+ОПок)/2+0,2, где 0,2 - коэффициент, определяемый методом статистической обработки, ОПкк - оптическая плотность контроля конъюгата, ОПок - оптическая плотность отрицательного контроля.

Пример 2. Определение иммуноглобулинов класса G к R. sibirica методом иммуноферментного анализа.

Для выполнения ИФА используют следующее.

1. «Диагностикум риккетсиозный Сибирика сухой для РСК» (серия 6 К 1299) ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ, г.Пермь.

2. Раствор хлорида натрия 0,9% для разведения диагностикума риккетсиозного Сибирика.

3. Сыворотка лошадиная нормальная.

4. В качестве конъюгата - поликлональные иммуноглобулины кролика против иммуноглобулинов G человека, меченные пероксидазой хрена (Polyclonal Rabbit Anti-Human IgG/HRP, Dako Denmark A/S Produktionsvei 42 Denmark DK-2600 Glostrup).

5. Субстратный буферный раствор - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин - в качестве хромогена, прозрачная бесцветная жидкость.

6. Фосфатно-солевой буферный раствор pH 7,3 для разведения образцов.

7. Фосфатно-солевой буферный раствор с твином 20 для отмывки.

8. Стоп-реагент - раствор серной кислоты 0,75 моль/л, прозрачная бесцветная жидкость.

9. Исследуемая сыворотка (плазма) крови.

10. Положительный контрольный образец, инактивированный, слегка опалесцирующая жидкость, полученная путем смешивания 5 положительных в РСК сывороток больных клещевым риккетсиозом людей.

11. Отрицательный контрольный образец, инактивированный, слегка опалесцирующая жидкость, полученная путем смешивания 10 сывороток здоровых людей (доноров).

Процедура выполнения ИФА.

Для сенсибилизации полистерола поверхностей лунок планшета используют диагностикум риккетсиозный Сибирика сухой для РСК в разведении 1:4 в объеме 50 мкл в каждую лунку. Закрытый крышкой планшет выдерживают в течение 18 часов при температуре +4°C или в условиях влажной камеры в течение 2 часов при температуре 37°C. Содержимое лунок удаляют без промывания планшета. Затем в лунки планшета вносят исследуемые сыворотки в объеме 50 мкл в разведениях от 1:10 до 1:50, приготовленных на 0,05М ФСБ pH 7,3, содержащем 10% цельной лошадиной сыворотки. После внесения разведений сывороток закрытый крышкой планшет выдерживают в течение 1 часа при температуре 37°C. Далее содержимое лунок удаляют в емкость для сбора инфицированного материала и лунки планшета промывают 3 раза рабочим промывочным раствором (фосфатно-солевой буфер) в объеме 350 мкл. Во все лунки планшета вносят по 50 мкл конъюгата - Polyclonal Rabbit Anti-Human IgG/HRP, Dako Denmark A/S Produktionsvei 42 Denmark DK-2600 Glostrup в разведении 1:1000. Для получения нужного разведения конъюгата используют 0,05М ФСБ pH 7,3, содержащий 10% цельной лошадиной сыворотки. После внесения конъюгата закрытый крышкой планшет выдерживают в течение 1 часа при температуре 37°C. Далее, содержимое лунок удаляют в емкость для сбора инфицированного материала и лунки планшета промывают 5 раз рабочим промывочным раствором (фосфатно-солевой буфер) в объеме 350 мкл. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл субстратного буферного раствора (раствор тетраметилбензидина) и выдерживают 15 мин в защищенном от света месте при температуре 20°±2°C. Реакцию останавливают добавлением во все лунки планшета по 50 мкл стоп-реагента (0,75 моль/л раствор серной кислоты).

Учет результатов проводят спектрофотометрически при длине волны 450 нм с настройкой прибора «по воздуху». Интерпретацию результатов проводят следующим образом: значение оптической плотности каждой исследуемой сыворотки делят на произведение среднего арифметического значения показателей оптических плотностей позитивного и негативного контроля. Проба считается положительной, если оптическая плотность анализируемой сыворотки выше значения (cut off), рассчитанного по формуле (ОПкк+ОПок)/2+0,2, где 0,2 - коэффициент, определяемый методом статистической обработки, ОПкк - оптическая плотность контроля конъюгата, ОПок - оптическая плотность отрицательного контроля.

Пример 3. Оценка эффективности предлагаемого способа определения антител к R. sibirica.

Для оценки эффективности серологической верификации диагноза «клещевой риккетсиоз» с использованием различных алгоритмов применения ИФА были рассчитаны с использованием метода четырехпольной таблицы (Флетчер Р., Флетчер С., Вагнер Э. Клиническая эпидемиология. Основы доказательной медицины. - М.: Медиа Сфера, 1998. - 352 с.) показатели, рекомендуемые для характеристики лабораторных тестов:

- чувствительность = а/(а+с);

- специфичность = d/(b+d);

- прогностическая ценность позитивного результата ПЦП+=а/(а+b);

- прогностическая ценность негативного результата ПЦН-=d/(с+d),

где 'а' - число положительных проб сывороток крови в группе лиц с клиническим диагнозом «клещевой риккетсиоз»;

'b' - число положительных проб сывороток крови в группе клинически здоровых лиц;

'с' - число отрицательных проб сывороток крови в группе лиц с клиническим диагнозом «клещевой риккетсиоз»;

'd' - число отрицательных проб сывороток крови в группе клинически здоровых лиц.

Таблица 1.
Эффективность различных алгоритмов применения ИФА с антигеном R. sibirica для серологической верификации диагноза «клещевой риккетсиоз»
Алгоритм применения ИФА Больные (n=36) Здоровые (n=80) Характеристики теста
«+» ИФА (a) «-» ИФА (c) «+» ИФА (b) «-» ИФА (d) Чувствительность, % а/(а+с) Специфичность, % d/(b+d) ПЦП+, % a/(a+b) ПЦН-, % d/(c+d)
ИФА-IgM (1-я проба) 28 8 1 79 77,8±6,9 98,8±1,2 96,6±3,4 90,8±3,1
ИФА-IgM (парные пробы) 33 3 1 79 91,7±4,6 98,8±1,2 97,1±2,9 97,5±1,7
ИФА-IgM (парные пробы) + ИФА-IgG (парные пробы) 36 0 1 79 100 98,8±1,2 97,3±2,7 100
Примечание: Больные - группа лиц с характерной клинической картиной клещевого риккетсиоза, проживающих на территории эндемичной по КР.
Здоровые - группа клинически здоровых лиц, проживающих на территории неэндемичной по КР.

Показано, что у большинства больных (77,8%) для подтверждения диагноза КР достаточно исследовать в ИФА только первую сыворотку крови на наличие IgM к R. sibirica. Исследование парных сывороток на наличие IgM и IgG повышает подтверждаемость диагноза до 100%.

Пример 4. Сравнение эффективности РСК и ИФА для лабораторного подтверждения диагноза «клещевой риккетсиоз».

С целью сравнения эффективности РСК и ИФА в качестве лабораторных тестов, подтверждающих диагноз «клещевой риккетсиоз», параллельно двумя методами исследованы сыворотки крови от больных КР.

Таблица 2.
Сравнительная характеристика ИФА и РСК для обнаружения антител к R. sibirica у больных с клиническим диагнозом «клещевой риккетсиоз»
Метод Больные Здоровые (n=80) Характеристики теста
«+» (a) «-» (c) «+» (b) «-» (d) Чувствительность, % а/(а+с) Специфичность, % d/(b+d) ПЦП+, % а/(а+b) ПЦН-, % d/(c+d)
ИФА (исследование первой сыворотки) (n=36) 28 10 1 79 72,2±8,8 98,8±1,2 96,3±3,2 88,8±5,6
ИФА (исследование парных сывороток) (n=36) 33 3 1 79 91,7±4,6 98,8±1,2 97,1±2,9 97,5±1,1
РСК (исследование парных сывороток) (n=17) 9 8 0 80 52,9±17,1 100 100 90,9±7,5

Сравнительная оценка РСК и ИФА показывает, что оба метода обладают высокой специфичностью, однако, РСК значительно уступает ИФА в чувствительности, особенно при исследовании парных сывороток (52,9% и 91,7% соответственно), что имеет важное диагностическое значение.

Способ лабораторной диагностики клещевого риккетсиоза, заключающийся в определении иммуноглобулинов классов М и G к возбудителю клещевого риккетсиоза (Rickettsia sibirica) в сыворотке крови пациентов методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием диагностического антигена и оценку результатов по оптической плотности, отличающийся тем, что в качестве антигена для сенсибилизации полистирола лунок планшета используют диагностикум риккетсиозный Сибирика сухой для РСК, в случае определения иммуноглобулинов М в качестве конъюгата применяют поликлональные иммуноглобулины кролика против иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой хрена, в случае определения иммуноглобулинов G в качестве конъюгата используют поликлональные иммуноглобулины кролика против иммуноглобулинов G человека, меченные пероксидазой хрена, а расчет результатов проводят спектрофотометрически при длине волны 450 нм, при этом проба считается положительной, если оптическая плотность анализируемой сыворотки выше значения рассчитанного по формуле:
(ОПКК+ОПОК)/2+0,2,
где 0,2 - коэффициент, определяемый методом статистической обработки,
ОПКК - оптическая плотность контроля конъюгата,
ОПОК - оптическая плотность отрицательного контроля.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к способу измерения относительных уровней кариесогенных и аргинолитических бактерий в ротовой полости, например, как части режима стоматологического обслуживания, путем применения композиции, включающей основную аминокислоту в форме свободного соединения или соли.

Изобретение относится к медицине и касается способа скрининга in vitro потенциальных лекарственных средств для лечения туберкулеза путем нарушения биосинтеза арабиногалактана, где указанный способ включает стадию приведения в контакт клеточной культуры Mycobacterium tuberculosis, сверхэкспрессирующей белок, выполняющий превращение декапренил-Р-рибозы в декапренил-Р-арабинозу, и который может кодироваться геном rv3790 или его гомологами, или искусственной открытой рамкой считывания, продукт экспрессии которой идентичен белку Rv3790 или является его гомологом, с потенциальным лекарственным средством, и последующей оценки процента ингибирования, вызываемого потенциальным лекарственным средством, относительно контроля в аналитическом тесте.

Изобретение относится к областям микробиологии и иммунологии. .
Изобретение относится к медицине, в частности к фтизиатрии и гинекологии, и касается способа определения активности туберкулеза женских гениталий. .

Изобретение относится к области медицины и касается способа диагностики качества жизни больных, страдающих генитальными инфекциями. .

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционной иммунологии. .

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается тест-системы ИФА для серологической диагностики парвовирусной инфекции крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения моноклональных антител (МКА) к капсульному F1 антигену Yersinia pestis. .
Изобретение относится к медицине и предназначено для выявления у лиц молодого возраста риска развития кариеса и воспалительных заболеваний пародонта. .

Изобретение относится к области лабораторной диагностики и может быть использовано для оценки состояния больных сахарным диабетом и развитием у них неврологических и сосудистых осложнений.

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для прогнозирования течения нервно-психических заболеваний. .

Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунологии, и может быть использовано для диагностики аутоиммунного процесса. .
Изобретение относится к области медицины, а именно к хирургии и клинической иммунологии, и может быть использовано в практике лечения хирургических больных. .

Изобретение относится к микробиологии, биохимии и иммунологии и может быть использовано для серологической диагностики ботулизма. .

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.
Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и найдет широкое применение в лечении пациенток с маточными кровотечениями в пубертатном периоде жизни. .

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для анализа иммунологических проб. .

Изобретение относится к области медицины, в частности к терапевтической стоматологии, и может быть использовано для оценки биосовместимости полимерных пломбировочных материалов.
Изобретение относится к медицине, в частности к внутренним болезням, и предназначенно для диагностики больных перекрестным синдромом аутоиммунного гепатита и первичного билиарного цирроза.
Наверх