Способ моделирования дисбактериоза кишечника у лабораторных животных
Владельцы патента RU 2477894:
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "ВЯТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" (ФГБОУ ВПО "ВятГУ" (RU)
Изобретение относится к экспериментальной медицине и микробиологии и может быть использовано при моделировании дисбактериоза кишечника для изучения характера изменений состава и свойств кишечной микрофлоры и обоснования подходов для коррекции нарушений. Для этого воздействуют антибактериальным препаратом гентамицином на кишечную микрофлору лабораторных животных - белых мышей и морских свинок. Определяют количество жизнеспособных микроорганизмов кишечной микрофлоры в начале и конце опыта и сравнивают их численные значения, Введение гентамицина осуществляют перорально 1 раз в сутки в течение 5 дней. Используют дозу, превышающую суточную терапевтическую дозу гентамицина при парентеральном ведении в 4,8 раза у мышей и в 4 раза - у морских свинок. Способ обеспечивает адекватное воспроизведение дисбактериоза, типичного для кишечника, позволяет выявить глубину дисбиотических изменений как на уровне общего содержаний кишечной микрофлоры, так и определенных ее представителей, а также изучать влияние существующих и создаваемых средств и методов лечения дисбактериоза. 3 пр.
Изобретение относится к области медицины и медицинской микробиологии и может быть использовано для изучения характера изменений состава и свойств кишечной микрофлоры и обоснования подходов для коррекции микроэкологических нарушений в кишечнике.
Различные факторы экзогенного и эндогенного характера, влекущие за собой выраженные клинические проявления со стороны макроорганизма либо являющиеся следствием каких-то патологических процессов в организме, сказываются на качественном или количественном состоянии типичного для данного биотопа состава нормальной микрофлоры. Такие качественные и количественные нарушения нормофлоры относят к дисбактериозам (Дисбактериозы - актуальная проблема медицины / А.А.Воробьев [и др.] // Вестник РАМН. - 1997. - №3. - С.4-7).
К наиболее значимым причинам, приводящим к нарушению микробиоценоза кишечника, относят: фактор питания, стрессы различного генеза, острые инфекционные заболевания желудочно-кишечного тракта, снижение иммунного статуса различного генеза, ксенобиотики различного происхождения, нарушения биоритмов, дальние поездки, заболевания внутренних органов, прежде всего органов желудочно-кишечного тракта, нарушения моторики кишечника, ятрогенные воздействия (антибактериальная терапия, гормонотерапия, применение цитостатинов, лучевая терапия, оперативные вмешательства) (Минушкин, О.Н. Дисбактериоз кишечника (понятие, диагностика, принципы лечебной коррекции). Современные возможности пребиотической терапии. Учебно-методическое пособие для врачей и курсантов циклов усовершенствования врачей / О.Н.Минушкин [и др.] // М.: ФГУ «Учебно-методический центр» управления делами Президента Российской Федерации, 2010. - 50 с.).
Очевидно, что любая из причин может привести к изменению состава и свойств кишечной микрофлоры и развитию дисбактериоза. Его проявления разнообразны, что в значительной мере затрудняет жизнь больного и заставляет обращаться за помощью к врачу. Назначая лекарственные препараты, врач исходит из общих принципов воздействия на дисбиотические состояния и руководствуясь отраслевым стандартом (Приказ Минздрава РФ №231 от 2003 г.) «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника». Для более адекватной коррекции дисбиотических нарушений в кишечнике у людей целесообразно в эксперименте на лабораторных животных выявить факторы и условия, способствующие формированию дисбактериоза. Экспериментальный дисбактериоз для изучения характера изменений состава и свойств кишечной микрофлоры у лабораторных животных, а также для обоснования подходов с целью коррекции микроэкологических нарушений, нуждается в определенном обосновании и установлении определенных количественных показателей, свидетельствующих о его становлении и развитии. Это тем более важно, что полученные в эксперименте на лабораторных животных результаты можно в последующем экстраполировать на организм человека как в плане профилактики, так и лечения дисбактериозов.
В связи с серьезностью проблемы дисбактериозов предпринимались усилия по оптимизации средств и методов их лечения, включая патогенетическое и этиотропное лечение основного заболевания в сочетании с заместительной терапией пробиотиками, а также иммуностимуляторами различной направленности. Весьма перспективным способом нормализации кишечной микрофлоры является стимуляция собственной индигенной микрофлоры с использованием фруктоолигосахаридов и фруктополисахаридов и содействие приживлению пробиотических микроорганизмов при их энтеральном применении (Захаренко С.М. Инфекции, микробиота кишечника человека и метаболический синдром / С.М.Захаренко, Ю.А.Фоминых, С.Н.Мехтиев // Эффективная фармакотерапия. Гастроэнтерология. - 2011. - №3. - С.14-20). В этой связи весьма ценной будет информация об общем количестве фекальной микрофлоры, а также об отдельных ее представлениях, в частности бифидобактерий, лактобактерий, эшерихий, которые, судя по данным отчета о клинико-лабораторном исследовании (Сравнительная оценка клинико-лабораторной эффективности современных про- и пребиотических препаратов в коррекции дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта: отчет о клинико-лабораторном исследовании / ФГУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского; рук. Грачева Н.М., Ардатская М.Д.; исполн. Аваков А.А., Соловьева А.И. - М.: 2010. - 23 с.), являются своеобразными индикаторами эффективности лечения дисбактериоза различной степени выраженности. В то же время до настоящего времени не решен вопрос о моделировании дисбактериоза кишечника, что позволило бы в эксперименте оценить терапевтическую эффективность новых пробиотических микроорганизмов и создаваемых на их основе пробиотических препаратов (Патент РФ №2246956. Штамм Lactobcillus paracasei CNCM 1-2116 (NCC 2461), обладающий способностью предотвращать заражение эпителиальных клеток кишечника ротавирусами, вызывающими диарею, и средство для лечения и/или профилактики нарушений, ассоциируемых с диареей, вызываемой ротавирусами; патент РФ 2308483. Штамм Bifidobacterium longum infantis для приготовления пробиотика, антимикробный агент и препарат на основе штамма Bifidobacterium longum infantis с иммуномодулирующими свойствами; патент РФ №2310463. Гепатопротекторный пробиотик).
В доступной литературе не отражено описание специальных исследований по воспроизведению дисбактериоза кишечника на лабораторных животных, хотя исследователи при выполнении экспериментов на лабораторных животных и решении конкретных научных задач сталкивались с проявлением дисбактериоза кишечника у животных. Наиболее близкими к заявляемому способу являются постлучевой дисбактериоз, возникающий у белых мышей, облученных γ-квантами в дозе 700 рентген (Изучение влияния препарата из лактобактерий «Салко» на выживаемость и микрофлору кишечника у облучаемых животных / В.Боссарт [и др.] // Журн. микробиол. - 1990. - №11. - С.6-9), а также постинфекционный стафилококковый дисбактериоз кишечника у мышей линии СВА и кроликов породы шиншилла (Коршунов В.М. Влияние подкожной контаминации стафилококками на состояние микрофлоры кишечника у животных / В.М.Коршунов, Е.Д.Радакова, Л.Г.Дугашева // Журн. микробиол. - 1990. - №12. - С.105-1906). Авторы отмечают развитие манифестной формы дисбактериоза у подопытных животных с выраженными изменениями в качественном и количественном составе кишечной микрофлоры как при экспериментальной лучевой болезни, так и при подкожном введении больших доз (2·109 микробных клеток) стафилококков. В обоих случаях облученные и инфицированные стафилококком животные погибали, что не позволило изучать в динамике восстановление нормальной кишечной микрофлоры и оценивать эффективность того или иного подхода в лечении индуцированного дисбактериоза кишечника подопытных животных. Кроме того, работа на установках для облучения лабораторных животных для инициации дисбактериоза кишечника чревата последствиями для самих экспериментаторов.
Задачей изобретения является разработка способа, позволяющего моделировать дисбактериоз кишечника у лабораторных животных. Технический результат, который может быть достигнут при использовании предлагаемого способа, заключается в том, что у лабораторных животных можно определить глубину дисбиотических изменений в кишечнике как на уровне общего содержания кишечной микрофлоры, так и определенных ее представителей, изучить влияние существующих и создаваемых средств и методов восстановления нарушений микробиоценоза кишечника с перспективой использования разработанных подходов для лечения дисбактериозов кишечника у людей.
Поставленная задача достигается тем, что в способе моделирования дисбактериоза кишечника у лабораторных животных воздействуют антибактериальным препаратом гентамицином на кишечную микрофлору и определяют количество жизнеспособных микроорганизмов кишечной микрофлоры в начале и конце опыта, сравнивают их численные значения, при этом создают селективное давление антибактериальным препаратом гентамицином при пероральном его введении лабораторным животным 1 раз в сутки в течение 5 дней в дозах, превышающих его суточную терапевтическую дозу при парентеральном ведении более чем в 4,8 раза у мышей и в 4 раза - у морских свинок.
Среди многих причин, приводящих к формированию и развитию дисбактериозов кишечника, антибактериальная терапия относится к одной из ведущих причин, вызывающих качественные и количественные нарушения нормальной микрофлоры в кишечнике. Как известно, антибиотики и химиотерапевтические препараты являются основными средствами борьбы с инфекционными заболеваниями бактериальной природы (Современное состояние и перспективы решения проблемы повышения эффективности экстренной профилактики и лечения системных бактериальных инфекций / Т.А.Бондарева [и др.] // Молекулярная медицина. - 2009. - №5. - С.21-25; Шевелева М.А. Современные представления о применении различных групп пробиотических средств при антибиотикотерапии / М.А.Шевелева, Г.В.Раменская // Антибиотики и химиотерапия. - 2009. - Т. 54, №3-4. - С.61-68). Часто вследствие бесконтрольного их использования отмечается гибель не только патогенных микроорганизмов в естественных биотопах, но и представителей нормальной микрофлоры человека (Шендеров Б.А. Нормальная микрофлора и некоторые вопросы микроэкологической токсикологии / Б.А.Шендеров // Антибиот. и мед. биотехнол. - 1987. -Т. 32, №2. - С.18-24; Шевяков М.А. Антибиотик - ассоциированная диарея и кандидоз кишечника: возможность лечения и профилактики / М.А.Шевяков // Антибиотики и химиотерапия. - 2004. - Т.49, №10. - С.25-29; Бельмер С.В. Дисбактериоз кишечника как осложнение антибактериальной терапии / С. В. Бельмер // Детские инфекции. - 2007. - Т.6, №2. - С.44-48). Таким образом, для селективного подавления кишечной микрофлоры у экспериментальных животных можно использовать такой антибактериальный препарат, который бы при пероральном введении угнетал жизнедеятельность микроорганизмов, вызывая микроэкологические нарушения в кишечнике. Судя по описанию фармакологического действия, приведенному в инструкции по применению (Гентамицин-К. Инструкция, применение, описание лекарственного действия, синонимы, аналоги и цена препарата Гентамицин-К (международное название Гентамицин). http://www.ros-med.info), такой характеристикой обладает гентамицин. Абсорбция антибиотика при приеме внутрь незначительная - он практически не всасывается в желудочно-кишечном тракте и оказывает местное действие. Данное обстоятельство предопределило использование гентамицина для формирования экспериментального антибиотико-ассоциированного дисбактериоза у лабораторных животных - белых мышей и морских свинок. По нашим данным, токсичность гентамицина при внутрибрюшинном введении составляет 6,85: ×1,2 мг. Это значение явилось ориентировочным при выборе дозы препарата для перорального введения лабораторным животным.
Гентамицин, относящийся к классу аминогликозидов, как и другие представители этого класса (канамицин, стрептомицин), длительное время являлся наиболее эффективным, а зачастую и единственным средством купирования инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями. Введенный перорально лабораторным животным в соответствующих дозах, гентамицин будет оказывать местное действие на пристеночную и просветную микрофлору и с течением времени вызовет дисбиотическое состояние кишечника животных. Это состояние может быть зафиксировано как на уровне определения общего содержания микрофлоры в пересчете на 1 г фекалий, так и содержания отдельных ее представителей, в частности бифидо- и лактобактерий, эшерихий. Суточная терапевтическая доза гентамицина при парентеральном введении составляет 240 мг. Соответствующие дозы препарата для белых мышей и морских свинок в пересчете на единицу поверхности тела составляют 0,6 мг и 7,5 мг соответственно. Проведенные исследования показали, что при пероральном введении гентамицина в указанных концентрациях действительно происходит некоторое снижение общего количества фекальной микрофлоры, что тем не менее не позволяло говорить о воспроизведении у животных экспериментального дисбактериоза. Ввиду того, что гентамицин перорально не вводят, в качестве ориентира использовали утвержденные суточные дозы аминогликозидов - канамицина и стрептомицина при пероральном введении (Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 3 т. Том 1: Микрофлора человека и животных и ее функции / Б.А. Шендеров. - М.: Издательство ГРАНТЪ, 1998. - 288 с.), при которых в 1 г фекалий достижима доза указанных препаратов, равная 1000 мкг, белым мышам и морским свинкам вводили per os 2,9 и 30 мг гентамицина в пересчете на единицу поверхности тела. Гентамицин в указанной дозировке вводили 1 раз в сутки в течение 5 дней с ежедневным отбором фекалий для определения общего количества фекальной микрофлоры в 1 г фекалий животных, а также отдельных ее представителей.
Для количественного определения микроорганизмов суспензию фекалий белых мышей и морских свинок высевали на рекомендованные питательные среды (Совершенствование методов диагностики дисбактериоза толстого кишечника / В.П. Иванов [и др.] // Информационное письмо. - СПб.: ФГУ «Центр госсанэпиднадзора», 2002. - 31 с.; Лихачева А.Ю. Современное состояние вопроса таксономии бактерий рода Lactobacillus / А.Ю. Лихачева, В.М. Бондаренко, К.Я. Соколова // Журн. микробиол. - 1992. - №9-10. - С.74-78) и выращивали в соответствующих условиях при температуре 37°С.
Пример 1.
Готовят раствор гентамицина на изотоническом растворе хлорида натрия, в 1 мл которого содержится 29 мг препарата гентамицина. Берут расчетное количество прошедших акклиматизацию белых мышей массой 18-20 г, рассаживают их в индивидуальные кюветы с крышками. Отбирают от каждого животного фекальные массы, взвешивают их, после чего суспендируют в 1,0 мл изотонического раствора хлорида натрия и высевают на плотные питательные среды в чашках Петри, которые инкубируют при температуре 37°С (в течение 48 часов), после чего подсчитывают количество выросших колоний. С учетом массы фекалий от каждого животного и числа выросших колоний делают перерасчет общего числа микроорганизмов, а также бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий на 1 г фекалий (КОЕ·г-1). Вводят по 0,1 мл раствора гентамицина (2,9 мл препарата) с помощью туберкулинового шприца с иглой и канюлей на конце перорально каждому животному. Через 24 часа повторяют отбор фекалий для количественного определения фекальной микрофлоры и отдельных ее представителей, повторно вводят перорально раствор гентамицина (2,9 мг препарата). Ежедневно, начиная со 2 суток, в кюветах с животными меняют подстилку для облегчения отбора свежих фекальных масс. Отбор фекалий для определения общего числа микроорганизмов фекальной микрофлоры и отдельных ее представителей, а также однократное в сутки пероральное введение животным раствора гентамицина (2,9 мл препарата), превышающего суточную терапевтическую дозу более чем в 4,8 раза, повторяют в течение 5 суток, после чего определяют общее количество фекальной микрофлоры, отдельных ее представителей и судят о глубине дисбиотических изменений в кишечнике.
Результаты определения.
Начало эксперимента:
| общее количество микроорганизмов | (6,2±0,6)·109 КОЕ·г-1 |
| бифидобактерии | (6,1±0,6)·106 КОЕ·г-1 |
| лактобактерии | (1,8±0,8)·108 КОЕ·г-1 |
| эшерихии | (1,5±0,6)·104 КОЕ·г-1 |
Через 5 суток на фоне введения раствора гентамицина:
| общее количество микроорганизмов | (2,2±0,6)·106 КОЕ·г-1 |
| бифидобактерии | (1,2±0,6)·103 КОЕ·г-1 |
| лактобактерии | (1,4±0,7)·105 КОЕ·г-1 |
| эшерихии | (1,2±0,8)·102 КОЕ·г-1 |
Через 2 суток после прекращения введения раствора гентамицина:
| общее количество микроорганизмов | (2,2±0,6)·105 КОЕ·г-1 |
| бифидобактерии | (1,6±0,7)·102 КОЕ·г-1 |
| лактобактерии | (1,2±0,6)·104 КОЕ·г-1 |
| эшерихии | (1,0±0,5)·101 КОЕ·г-1 |
Полученные результаты свидетельствуют о развитии у белых мышей при пероральном введении гентамицина антибиотико-ассоциированного дисбактериоза кишечника, а также о микроэкологическом изменении фекальной микрофлоры после введения животным антибиотика.
Пример 2.
Готовят раствор гентамицина на изотоническом растворе хлорида натрия, в 1,0 мл которого содержится 150 мг препарата гентамицина. Берут расчетное количество прошедших акклиматизацию морских свинок массой 250-300 г, рассаживают их в индивидуальные кюветы с крышками. Отбирают от каждого животного фекальные массы, взвешивают их, после чего суспендируют в 4,0 мл изотонического раствора хлорида натрия и высевают на плотные питательные среды в чашках Петри, которые инкубируют при температуре 37°С в течение 48 часов, после чего подсчитывают количество выросших колоний. С учетом массы фекалий от каждого животного и числа выросших колоний делают перерасчет общего числа микроорганизмов, а также бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий на 1 г фекалий (КОЕ·г-1). Вводят по 0,2 мл раствора гентамицина (30 мг препарата), превышающих суточную терапевтическую дозу в 4 раза, с помощью туберкулинового шприца с иглой и канюлей на конце перорально каждому животному. Через 24 часа повторяют отбор фекалий для количественного определения фекальной микрофлоры и отдельных ее представителей, повторно вводят перорально раствор гентамицина (30 мг препарата). Ежедневно, начиная со 2 суток, в кюветах с животными меняют подстилку для облегчения отбора свежих фекальных масс. Отбор фекалий для определения общего числа микроорганизмов фекальной микрофлоры и отдельных ее представителей, а также однократное в сутки пероральное введение животным раствора гентамицина (30 мл препарата), повторяют в течение 5 суток, после чего определяют общее количество фекальной микрофлоры, отдельных ее представителей и судят о глубине дисбиотических изменений в кишечнике.
Результаты определения.
Начало эксперимента:
| общее количество микроорганизмов | (7,6±0,5)·108 КОЕ·г-1 |
| бифидобактерии | (1,0±0,4)·107 КОЕ·г-1 |
| лактобактерии | (9,0±0,6)·106 КОЕ·г-1 |
| эшерихии | (1,0±0,4)·106 KOE·г-1 |
Через 5 суток на фоне введения раствора гентамицина:
| общее количество микроорганизмов | (1,0±0,5)·106 КОЕ·г-1 |
| бифидобактерии | (9,0±0,3)·104 КОЕ·г-1 |
| лактобактерии | (6,0±0,5)·104 КОЕ·г-1 |
| эшерихии | (1,2±0,6)·102 KOE·г-1 |
Через 2 суток после прекращения введения раствора гентамицина:
| общее количество микроорганизмов | (3,4±0,4)·103 КОЕ·г-1 |
| бифидобактерии | (1,2±0,3)·102 КОЕ·г-1 |
| лактобактерии | (6,2±0,5)·101 КОЕ·г-1 |
| эшерихии | (1,1±0,6)·101 КОЕ·г1 |
Полученные результаты свидетельствуют о развитии у морских свинок при пероральном введении гентамицина антибиотико-ассоциированного дисбактериоза кишечника. При этом дисбиотические изменения в кишечнике морских свинок более выражены, чем у белых мышей.
Пример 3.
Берут расчетное количество морских свинок с выраженными изменениями состава кишечной микрофлоры как последствием антибиотико-ассоциированного дисбактериоза. Морских свинок рассаживают в индивидуальные кюветы. Отбирают от каждого животного фекальные массы, взвешивают их, после чего суспендируют в 4,0 мл изотонического раствора хлорида натрия и высевают на плотные питательные среды в чашках Петри, которые инкубируют при температуре 37°С в течение 48 часов, после чего подсчитывают количество выросших колоний. С учетом массы фекалий от каждого животного и числа выросших колоний делают перерасчет общего числа микроорганизмов, а также бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий на 1 г фекалий (КОЕ·г-1). Готовят суспензию пробиотика Биоспорин на изотоническом растворе хлорида натрия, в 1,0 мл которого содержится 1,4·108 пробиотических микроорганизмов. Готовят суспензию пребиотика Стимбифид на изотоническом растворе хлорида натрия, в 1,0 мл которого содержится 655 мг препарата. Животных делят на две группы. Одной группе животных вводят перорально только суспензию пробиотика Биоспорин ежедневно однократно в течение 7 суток в дозе 2,8·107 пробиотических микроорганизмов в объеме 0,2 мл. Другой группе животных водят совместно суспензию пробиотика Биоспорин в дозе 2,8·107 пробиотических микроорганизмов в объеме 0,2 мл и суспензию пребиотика Стимбифид в дозе 131 мг в объеме 0,2 мл ежедневно однократно в течение 7 суток. У животных обеих групп в начале эксперимента и на 7 сутки введения препаратов Биоспорин и совместного введения препаратов Биоспорин и Стимбифид отбирают фекальные массы для определения общего количества фекальной микрофлоры, а также бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий на 1 г фекалий (КОЕ·г-1), после чего судят об изменении кишечной микрофлоры у животных обеих групп.
Результаты определения.
Начало эксперимента (среднее значение по двум группам животных):
| общее количество микроорганизмов | (2,6±0,7)·103 КОЕ·г-1 |
| бациллы пробиотика Биоспорин | отсутствуют |
| бифидобактерии | (1,5±0,6)·102 КОЕ·г-1 |
| лактобактерии | (4,7±0,4)·101 КОЕ·г-1 |
| эшерихии | (1,3±0,5)·101 KOE·г-1 |
Через 7 суток эксперимента на фоне перорального введения суспензии пробиотика Биоспорин:
| общее количество микроорганизмов | (9,0±0,5)·107 КОЕ·г-1 |
| бациллы пробиотика Биоспорин | (2,5±0,6)·106 КОЕ·г-1 |
| бифидобактерии | (2,2±0,7)·106 КОЕ·г-1 |
| лактобактерии | (8,2±0,6)·105 КОЕ·г-1 |
| эшерихии | (2,6±0,5)·105 KOE·г-1 |
Через 7 суток эксперимента на фоне перорального введения суспензии пробиотика Биоспорин и пребиотика Стимбифид:
| общее количество микроорганизмов | (5,1±0,4)·109 КОЕ·г-1 |
| бациллы пробиотика Биоспорин | (2,2±0,5)·107 КОЕ·г-1 |
| бифидобактерии | (2,4±0,5)·106 КОЕ·г-1 |
| лактобактерии | (3,4±0,6)·105 КОЕ·г-1 |
| эшерихии | (1,4±0,3)·105 КОЕ·г-1 |
Полученные результаты свидетельствуют о восстановлении нормальной микрофлоры кишечника у морских свинок с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом как при пероральном ведении только пробиотика Биоспорин, так и совместно пробиотика Биоспорин с пребиотиком Стимбифид. В последнем случае отмечается более значительное восстановление кишечной микрофлоры у морских свинок, дополненной бациллами пробиотика Биоспорин (B.subtilis 3 и B.licheniformis 21).
Заявленный способ позволяет воспроизводить дисбактериоз кишечника у лабораторных животных, изучать возможность коррекции дисбактериоза кишечника с использованием заместительной терапии существующими и разрабатываемыми пробиотическими и пребиотическими препаратами, а также прогнозировать сроки восстановления нормальной микрофлоры при дисбактериозах кишечника.
Способ моделирования дисбактериоза кишечника у лабораторных животных, заключающийся в том, что воздействуют антибактериальным препаратом гентамицином на кишечную микрофлору, и определяют количество жизнеспособных микроорганизмов кишечной микрофлоры в начале и конце опыта, и сравнивают их численные значения, при этом создают селективное давление антибактериальным препаратом гентамицином при пероральном его введении лабораторным животным 1 раз в сутки в течение 5 дней в дозах, превышающих его суточную терапевтическую дозу при парентеральном введении в 4,8 раза у мышей и в 4 раза - у морских свинок.
