Штамм гибридных клеток животных mus musculus 5g6 - продуцент моноклональных антител, специфичных к v антигену yersinia pestis
Владельцы патента RU 2478703:
Российская Федерация, от имени которой выступает Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения моноклональных антител (МКА) к V антигену Yersinia pestis. Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 5G6 получают путем иммунизации мышей линии BALB/c. Мышей иммунизируют 4-х кратным введением рекомбинантного V антигена в дозе 100 мкг/мышь. На третьи сутки после последней иммунизации проводят гибридизацию спленоцитов иммунных мышей (1×108 клеток) с клетками мышиной миеломы Р3-Х63 Ag/8-653 (1×107 клеток). В качестве агента для слияния применяют полиэтиленгликоль (Sigma, США). После гибридизации проводят селекцию, скрининг, клонирование и криоконсервацию гибридомы. Штамм депонирован в государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур («ГКПМ-Оболенск») под номером Н-19. Штамм гибридных культивируемых клеток, продуцирующий моноклональные антитела, специфичные к V антигену Y.pestis, пригоден для конструирования на их основе тест-систем для выявления возбудителя чумы. 8 ил., 3 табл., 7 пр.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения моноклональных антител (МКА) к V антигену Yersinia pestis.
Возбудитель чумы, Yersinia pestis, является одним из наиболее вирулентных микроорганизмов и относится к грамотрицательным бактериям рода Yersinia [Хоулт Дж. с соавт., 1997].
После событий 11 сентября 2001 года в Нью-Йорке составлен список наиболее вероятных и опасных патогенов. В одном ряду с возбудителями оспы, сибирской язвы, вирусами Эбола и Марбурга отмечен чумной микроб. Восприимчивость человека к чуме чрезвычайно велика. В организм человека возбудитель попадает при укусе инфицированной блохи или через поврежденные кожные покровы. В этих случаях развивается бубонная или септическая форма чумы, которые при своевременной антибиотикотерапии и отсутствии осложнений в виде вторичной легочной пневмонии не представляют большой эпидемической опасности.
Чума до настоящего времени остается серьезной проблемой для эндемичных районов, а так же для мирового здравоохранения в целом. Ежегодно регистрируется около 2000 случаев заражения людей. Острое природно-очаговое особо опасное инфекционное заболевание, несколько пандемий которого унесли жизни миллионов людей, признано "возрождающейся инфекцией" и является одним из потенциальных агентов биотерроризма [Gage et al., 2005, Inglesby et al, 2000]. Крупные вспышки чумы, регистрируемые в течение последних лет, диктуют актуальность проведения научных исследований по совершенствованию диагностических и профилактических препаратов, направленных на предотвращение распространения и ликвидацию этих инфекций.
Все чаще традиционные, а порой и казавшиеся недавно перспективными методы диагностики оказываются недостаточными и принципиально неприемлемыми, что заставляет вести поиск новых и унифицировать имеющиеся методы выявления и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний, обладающих экспрессностью, надежностью, высокой специфичностью.
Ранняя лабораторная диагностика, своевременное выявление источника инфекции занимают основное место в системе противоинфекционных мероприятий. В связи с этим возникает необходимость в развитии и совершенствовании иммунобиологических методов, конструировании новых экспрессных методов диагностики и индикации, направленных на сокращение времени проведения анализа, его упрощение при одновременном увеличении надежности и легкости интерпретации полученных результатов при высокой чувствительности и специфичности. Такими преимуществами обладают диагностикумы, приготовленные на основе моноклональных антител (МКА), поскольку направлены на выявление одного антигена.
Задача изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела, специфичные к V антигену Y.pestis и пригодные для конструирования на их основе тест-систем для выявления возбудителя чумы.
Поставленная задача решается тем, что предложен новый штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 5G6 - продуцент высокоспецифичных моноклональных антител к V антигену Y.pestis.
Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 5G6 депонирован в государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур Федерального бюджетного учреждения науки Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ МПБ), коллекционный номер - Н19.
Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 5G6 получают путем иммунизации мышей линии BALB/c. Мышей иммунизируют 4-х кратным введением рекомбинантного V антигена в дозе 100 мкг/мышь. На третьи сутки после последней иммунизации проводят гибридизацию спленоцитов иммунных мышей (1×108 клеток) с клетками мышиной миеломы Р3-Х63 Ag/8-653 (1×107 клеток). В качестве агента для слияния применяют полиэтиленгликоль (Sigma, США). После гибридизации проводят селекцию, скрининг, клонирование и криоконсервацию гибридомы.
Характеристика штамма гибридных клеток животных Mus musculus 5G6.
Морфологическая характеристика. Культура гибридных клеток состоит из слабо прикрепленных к подложке округлых клеток размером с исходную миеломную клетку.
Культуральные свойства. Культивирование штамма гибридных клеток животных Mus musculus 5G6 ведут при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда RPMI - 1640, содержащая 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ/L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина. Клетки культивируют в виде стационарной суспензии в пластиковых матрацах "Costar". Пассирование клеток гибридомы 5G6 проводят 2 раза в неделю с кратностью разведения 1:2-1:3. Посевная концентрация клеток составляет 1×105 в 1 мл среды. Максимальная концентрация гибридных клеток при культивировании составляет 1×105 на 1 мл среды. Гибридный клон не теряет способности синтеза антител при 10 пассажах in vitro (срок наблюдения).
Культивирование гибридомы 5G6 в организме животного.
Мышей линии BALB/c 20-ти недельного возраста обрабатывают пристаном (Sigma, США) по 0,5 мл внутрибрюшинно и через 2-3 недели интраперитонеально вводят по 1×1010 гибридных клеток. Появление иммуноасцитов регистрируют на 7-15 сутки, отбор иммуноасцитической (ИАЖ) жидкости производят на 10-21 сутки. Синтез иммуноглобулина, продуцируемого гибридомой, определяют методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) [Егоров A.M. с соавт., 1997].
Характеристика полезного продукта. Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 5G6 продуцирует специфичные моноклональные антитела к V антигену Y. pestis, титр которых составляет в культуральной жидкости (КЖ) 1:640000, в ИАЖ 1:1000000. Моноклональные антитела из КЖ и ИАЖ выделяли путем аффинной хроматографии на колонке с белком G-сефарозой (Protein G Sepharose 4 Fast Flow). Чистоту полученных иммуноглобулиновых фракций оценивали в SDS-PAGE-электрофорезе в денатурирующих условиях. Концентрацию иммуноглобулинов определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм (спектрофотометр Smart Spec Plus, BIO RAD, США).
Продуктивность штамма гибридных клеток животных Mus musculus 5G6. Продукция МКА в среде культивирования составляет 20-50 мкг/мл, в асцитической жидкости - 5-10 мг/мл. Продукция МКА в культуральной жидкости сохраняется на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения) и 5 пассажей при культивировании в виде асцитных опухолей на мышах (срок наблюдения).
Контаминация штамма гибридных клеток животных Mus musculus 5G6. Контаминанты гибридной линии, включая бактерии, дрожжи, грибы, не выявлены. Микоплазмы не определяли.
Криоконсервация. Среда замораживания содержит эмбриональной телячьей сыворотки 90%, диметилсульфоксида 10%.
Режим криоконсервации и отогрева. Гибридные клетки вносят в криопробирки, помещают в контейнер из пенопласта с толщиной стенок не менее 1 см и оставляют на 16-24 часа в кельвинаторе при температуре - 70°С и затем опускают в жидкий азот.
Размораживание проводят быстро на водяной бане при температуре 37°С.
Ампулы содержат 1,0 мл криозащитной среды с концентрацией гибридных клеток 1×106. Жизнеспособность восстанавливаемых гибридом после криоконсервации составляет 75-85%.
Свойства полезного продукта. Гибридома продуцирует моноклональные антитела, относящиеся к lgG2в подклассу иммуноглобулинов мыши.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.
Фиг.1 Дот-блот с МКА 5G6. Определение неспецифической активности в отношении микробных клеток других микроорганизмов.
Фиг.2 Дот-блот с МКА 5G6. Определение специфической активности в отношении представителей рода Yersinia.
Фиг.3 Дот-блот с МКА 5G6. Определение специфической активности к V антигену Y. pestis.
Фиг.4 SDS-PAGE электрофорез МКА 5G6.
Фиг.5 Определение подклассовой принадлежности МКА 5G6.
Фиг.6 Иммуноблотинг МКА 5G6 с V антигеном Y.pestis.
Фиг.7 Обнаружение клеток Y.pestis в реакции латекс-агглютинации с использованием МКА 5G6.
Фиг.8 Определение перекрестной активности в реакции латекс-агглютинации с использованием МКА 5G6.
Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.
Пример 1. Получение штамма гибридных клеток 5G6.
Иммунизация.
Для иммунизации используют мышей линии BALB/c в возрасте 3-4 месяцев. Иммунизацию проводят по следующей схеме:
0 день - 100 мкг антигена в PBS, эмульгированного в ПАФ (0.2 мл) подкожно;
21 день - 100 мкг антигена в PBS, эмульгированного в НАФ (0.2 мл) подкожно;
51 день - 100 мкг антигена в PBS внутривенно;
58 день - 100 мкг антигена в PBS внутривенно;
Кровь у иммунных мышей отбирают на третий день после последней инъекции антигеном в концентрации 100 мкг согласно Animal protocol №Р02-19 стр.7.
Титры специфических антител в сыворотках животных определяют с помощью непрямого твердофазного ИФА.
Гибридизация.
Через 3 суток после последней внутривенной инъекции извлекают селезенку мыши и проводят гибридизацию 1×108 спленоцитов мыши с 1×107 клетками миеломной линии РЗ-Х63 Ag/8-653 в присутствии 1 мл полиэтиленгликоля (SIGMA, США) в течение 1 минуты.
Селекция.
После отмывки полиэтиленгликоля клетки высевают на 96-луночные планшеты на слой перитонеальных макрофагов, взятых у мышей линии BALB/c. Селекцию гибридных клеток проводят на селективной среде с содержанием гипоксантина-аминоптерина-тимидина (HAT). Через 21 сутки из среды убирают аминоптерин. В последующем культивирование проводят на среде RPMI - 1640 "Sigma" с 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ/L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина.
Скрининг гибридных клонов.
Для отбора положительных гибридных клонов, продуцирующих МКА, используют непрямой твердофазный ИФА.
Для проведения непрямого варианта ИФА в лунки 96-луночного полистиролового планшета для иммуноферментного анализа вносят по 1 мкг/лунку V антигена Y.pestis и выдерживают при температуре 37°С в течение 1 часа или при 4°С в течение 18 часов. Три раза отмывают фосфатно-солевым буфером рН 7.4, содержащим 0,5% твин-20 (ФСБ-Т). Далее вносят в лунки по 160 мкл 0,5% раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА), проверенного на отсутствие пероксидазной активности, и инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа. Три раза отмывают ФСБ-Т, вносят в лунки супернатант культуральной жидкости в объеме 100 мкл и инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа. После этого лунки планшета трижды отмывают раствором ФСБ-Т и добавляют в лунки пероксидазный конъюгат к целой молекуле IgG мыши (Sigma, США) в рабочем разведении. Планшет инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа, затем 6 раз отмывают лунки раствором ФСБ-Т. После этого в лунки вносят по 100 мкл субстрат -индикаторного раствора (10 мкл 30% H2O2 и 8 мг ортофенилендиамина на 10 мл фосфатно-цитратного буфера рН 5,0). Положительную реакцию оценивают по появлению желто-коричневого окрашивания раствора. Реакцию останавливают добавлением в лунки по 50 мкл 4N серной кислоты. Учет результатов проводят на фотометре (фотометр Пикон, РФ) для ИФА при длине волны 492 нм.
Клонирование гибридных клеток 5G6 проводят методом лимитирующих разведений в 96-луночных планшетах на слое перитонеальных макрофагов из расчета 1×104 клеток на лунку. Скрининг клонов проводят непрямым твердофазным ИФА, как описано выше.
Культивирование.
Культивирование штамма гибридных клеток 5G6 ведут при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда RPMI - 1640, содержащая 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 MM/L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина.
Криоконсервация.
Клоны гибридомы 5G6 криоконсервируют на среде замораживания, состоящей из эмбриональной телячьей сыворотки - 90% диметилсульфоксида - 10%. Клоны гибридомы хранят в сосудах Дюара с жидким азотом.
Пример 2. Определение неспецифической активности в отношении микробных клеток других микроорганизмов методом дот-блот анализа.
Для проведения данного исследования использовали панель из 31 микроорганизма различных видов. В качестве положительного контроля использовали V антиген Y.pestis. На нитроцеллюлозную мембрану (GE Water & Process Technologies, США) с помощью прибора BIO-DOT (BIO RAD, США) сорбировали инактивированные микробные клетки в концентрациях 1×106 клеток/мл. Штаммы микроорганизмов были получены из коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ МПБ. Далее мембраны блокировали раствором инертного белка и последовательно инкубировали с МКА 5G6 и пероксидазным конъюгатом к целой молекуле IgG мыши (Sigma, США). Визуализацию реакции проводили раствором субстратной смеси на основе диаминобензидина (0.05% диаминобензидина (Sigma, США), 0.015% Н2O2, 0.01 М фосфатно-солевой буфер, рН - 7.4). Реакцию останавливали промывкой дистиллированной водой.
Как показал проведенный анализ, МКА 5G6 специфически взаимодействовали с V антигеном Y.pestis и не давали перекрестных реакций с микробными клетками других микроорганизмов (фиг.1).
Пример 3. Определение специфической активности в отношении представителей рода Yersinia.
Проверку специфической активности МКА 5G6 в отношении различных штаммов Y.pestis проводили методом дот-блот анализа. На нитроцеллюлозный фильтр с помощью прибора Bio-Dot («Bio-Rad», США) сорбировали микробные клетки различных штаммов рода Yersinia в концентрации 1×107 клеток/мл, 1×106 клеток/мл. Штаммы микроорганизмов были получены из коллекции микроорганизмов ФГУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока. Далее мембраны блокировали раствором инертного белка и последовательно инкубировали с МКА 5G6 и пероксидазным конъюгатом к целой молекуле IgG мыши (Sigma, США). Визуализацию реакции проводили раствором субстратной смеси на основе диаминобензидина (0.05% диаминобензидина (Sigma, США), 0.015% H2O2 0.01 М фосфатно-солевой буфер, рН - 7.4). Реакцию останавливали промывкой дистиллированной водой.
В результате проведенного анализа было установлено, что МКА 5G6 взаимодействуют с микробными клетками Y.pestis в концентрации 1×10 клеток/мл и не обладают перекрестной активностью в отношении других близкородственных иерсиний (фиг.2).
Проверка специфичности МКА 5G6.
Пример 4. Определение специфической активности к V антигену Y.pestis.
Была проведена проверка специфической активности КЖ гибридом 5G6 в отношении V антигена Y.pestis методом дот-блот анализа. На нитроцеллюлозный фильтр с помощью прибора Bio-Dot («Bio-Rad», США) сорбировали V антиген с начальной концентрацией 0,25 мкг/мл и титровали двукратным шагом до конечной концентрации 0,002 мкг/мл. Далее мембрану блокировали раствором инертного белка и последовательно инкубировали с КЖ гибридом 5G6 и пероксидазным конъюгатом к целой молекуле IgG мыши (Sigma, США). Визуализацию реакции проводили раствором субстратной смеси на основе диаминобензидина (0.05% диаминобензидина (Sigma, США), 0.015% H2O2 0.01 М фосфатно-солевой буфер, рН - 7.4). Реакцию останавливали промывкой дистиллированной водой.
В результате проведенного анализа было установлено, что МКА 5G6 выявляют до 7 нг/мл V антигена (фиг.3).
Пример 5. Выделение и очистка МКА 5G6.
Выделение МКА из асцитической жидкости проводят путем аффинной хроматографии на колонке с белком G-сефарозой (Protein G Sepharose 4 Fast Flow). Клеточные компоненты из культуральной и асцитической жидкостей удаляют центрифугированием (2000 g × 20 мин), рН культуральной жидкости доводят до 8.6 при помощи 1 N раствора NaOH, асцитическую жидкость разводят 1:1 посадочным буфером (0.05 М трис, 0.15 М NaCl, 0.02% NaN3, pH 8.6). Колонку уравновешивают посадочным буфером и проводят нанесение образцов со скоростью 10 мл/час при комнатной температуре. После нанесения образцов, колонку отмывают от не связавшихся компонентов и проводят элюцию иммуноглобулинов 0.05 М глициновым буфером, 0.15 М NaCl, pH 2.3. Контроль выхода фракции иммуноглобулинов осуществляют при помощи УФ детектора ("Pharmacia LKB", Швеция).
Выделенные иммуноглобулины концентрируют осаждением при помощи сухого сульфата аммония (до 50% насыщения) и переводят в фосфатно-солевой буферный раствор методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-25 (PD-10, "Pharmacia LKB", Швеция) емкостью 10 мл. Чистоту полученных иммуноглобулиновых фракций оценивают в SDS-PAGE-электрофорезе в денатурирующих условиях.
В результате были получены очищенные препараты иммуноглобулинов (фиг.4).
Пример 6. Определение подклассовой принадлежности МКА 5G6.
Подклассы полученных МКА определяют с помощью набора для определения изотипов мышиных моноклональных антител (Roche Diagnostic Corporation, США). В культуральную жидкость объемом 500 мкл погружают иммунохроматографическую полоску для определения изотипов мышиных моноклональных антител не глубже чем на 1,5 см на 5 минут. После проявления контрольной полосы и полосы, соответствующей тестируемым Ig, определяют с помощью контрольной иммунохроматографической полоски (прилагается к набору для определения изотипов мышиных моноклональных антител) подкласс антител.
Определение подкласса полученных МКА показало, что штамм гибридных клеток 5G6 продуцирует моноклональные антитела, относящиеся к lgG2b подклассу иммуноглобулинов мыши (фиг.5).
Пример 6. Иммуноблотинг МКА 5G6 с V антигеном Y.pestis.
Для проверки специфичности МКА 5G6 с V антигеном Y.pestis проводят SDS-PAGE-электрофорез в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) в течение 1 часа при 220 в, 20 мА. V антиген из ПААГ переносят на нитроцеллюлозную мембрану (GE Water & Process Technologies, США) в течение 1 часа при силе тока 380 мА. После завершения переноса мембрану блокируют, погружая в 1% раствор БСА в ФСБ рН 7,4 на 1 час при комнатной температуре. Для промывок мембран используют ФСБ-Т рН 7,4. Блокированную и промытую мембрану инкубируют в растворе МКА гибридомы 5G6 в течение одного часа при температуре 37°С. Далее, после промывки буфером, мембрану инкубируют с пероксидазным конъюгатом к суммарной фракции Ig мыши (Sigma, США) в рабочем разведении при тех же условиях, промывают ФСБ-Т. Визуализацию реакции проводили раствором субстратной смеси на основе диаминобензидина (0.05% диаминобензидина (Sigma, США), 0.015%Н2O2,0.01 М фосфатно-солевой буфер - ФСБ, рН - 7.4). Реакцию останавливают промывкой дистиллированной водой.
В результате проведенного анализа было установлено, что МКА 5G6 взаимодействуют с V антигеном Y.pestis (фиг 6).
Пример 7. Обнаружение клеток Y.pestis в реакции латекс-агглютинации.
Для постановки реакции латекс-агглютинации (РЛА) используют полиакролеиновые латексные частицы диаметром 1 и 1,2 мкм (Институт биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Москва) и МКА 5G6. Иммобилизацию МКА на латексных частицах проводят согласно протоколу производителя: к 50 мкл 10% латексной суспензии добавляют 100 мкл МКА 5G6 с концентрацией 1 мг/мл, доводят объем до 0,5 мл и инкубируют 2 часа при комнатной температуре и перемешивании. Для блокировки не прореагировавших групп добавляют 4 мл 1% раствора овальбумина (Sigma, США) в 0,1 М боратном буфере (ББ), рН 8,2. От не связавшихся МКА латексные частицы отмывают в ББ трехкратным 10-минутным центрифугированием при 1200 g. Осадок ресуспендируют в 5 мл ББ с 1% овальбумином.
Реакцию латекс-агглютинации проводят в 96-луночных планшетах с V-образным профилем лунок (фирма Greiner Bio one, Германия). В качестве контрольных штаммов используют: Yersinia pestis И-2377, Yersinia pestis И-2422, Yersinia pestis И-2638. Для контроля специфичности используют штаммы: Y.pseudotuberculosis И-722, Y.pseudotuberculosis И-716, Y.enterocolitica 287, Y.enterocolitica И-131, E.coli 3912/41, E.coli ATCC 25922, P.aeruginosa ATCC 27853, S.typhimurium 21, S.enteritidis 1127, S.typhi H-901, S.paratyphi A-225, Sh.disenteriae 1362.
В качестве отрицательного контроля используют 0,1 М боратный буфер, рН 8,2.
Разведения клеток штаммов микроорганизмов с шагом 2 готовят в объеме 25 мкл в 96-луночных планшетах в боратном буфере. После добавления во все лунки по 25 мкл латексных частиц с иммобилизованными МКА 5G6, планшет встряхивают и инкубируют 1,5-2,0 часа при комнатной температуре.
Учет результатов проводят визуально по четырехкрестной системе на светлом фоне при хорошем освещении.
4+ - все частицы латекса агглютинированы, равномерно покрывают дно лунки, образуя «зонтик».
3+ - агглютинированы почти все частицы латекса, что выражается в уменьшении диаметра «зонтика».
2+ - агглютинирована половина латексных частиц.
1+ - большинство частиц не агглютинировано и осело на дно лунки, но диаметр «пуговицы» пока еще отличается от «точки».
«-» - признаков агглютинации нет, латексные частицы осели на дно лунки в виде «точки» ярко синего цвета в центре лунки.
Положительной считается реакция, оцениваемая не менее чем на 3+.
В результате проведенной реакции латекс-агглютинации было установлено, что латексные частицы с иммобилизованными МКА 5G6 клетки штамма Y.pestis в концентрации 1,5×106 клеток/мл и не выявляют гетерологичные культуры микроорганизмов в концентрации 5×10 клеток/мл и ниже (фиг.7, фиг.8, таблица 1, таблица 2).
Пример 7. Выявление V антигена Y.pestis методом ИФА с использованием МКА 5G6.
МКА 5G6 в фосфатно-солевом буфере, рН 7,4 с начальной концентрацией 5 мкг/лунку титровали двукратным шагом по вертикали до конечной концентрации 0,035 мкг/лунку (по 100 мкл/лунку в ФСБ). Для титрования использовали 96-ти луночные стрипованные планшеты для ИФА. В первый вертикальный ряд планшета вносили положительные (К+) и отрицательные контроли (К-) контроли. Лунку A1 с отрицательным контролем использовали как бланк. Планшет с антителами инкубировали в течение 1 ч на шейкере при температуре 37°С, затем 4 раза промывали ФСБ-Т. Участки неспецифического связывания блокировали добавлением в лунки по 160 мкл молока 0,5% жирности, инкубировали в течение 1 ч на шейкере при температуре 37°С, и промывали 3 раза ФСБ-Т. V антиген титровали двукратным шагом по горизонтали с начальной концентрацией 0,1 мкг/лунку в ФСБ до конечной концентрации 0,000097 мкг/лунку в ФСБ (по 100 мкл/лунку в ФСБ), инкубировали при тех же условиях, после чего промывали планшет 4 раза в ФСБ-Т. Биотинилированные МКА 2 В8 (фракция №3-1,52 мг/мл) вносили заведомо в избытке (разведение 1:500) по 100 мкл/лунку в ФСБ, инкубацию и промывку планшета проводили четырехкратно, как описано выше. Затем в лунки планшета добавляли по 100 мкл конъюгата стрептавидин-пероксидаза хрена («Имтек», Россия) в разведении 1:5000 (согласно инструкции по применению) в ФСБ. После инкубации и четырехкратной отмывки планшета в лунки вносили по 100 мкл субстрат-индикаторной смеси (0,008 мг ортофенилендиамина в 10 мл фосфатно-цитратного буфера, рН 5,0 с 1 мкл/мл 33% Н2O2). Планшет помещали на 3-5 мин в защищенное от света место при комнатной температуре, затем останавливали реакцию 4N серной кислотой (50 мкл/лунку). Учет результатов проводили с помощью планшетного спектрофотометра xMark («Bio-Rad», США) при длине волны 492 нм.
В результате проведенного анализа было установлено, что для иммобилизованных МКА 5G6 наиболее оптимальной является концентрация 5 мкг/лунку, позволяющая уверенно определять минимальные количества V антигена (4 нг/мл) (таблица 3).
| Таблица 1 | ||||||||||||
| Результаты учета реакции латекс-агглютинации | ||||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| А | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 3+ | 2+ | 1+ | - | - | - | - | - |
| В | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 3+ | 2+ | 1+ | - | - | - | - | - |
| С | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 3+ | 2+ | 1+ | - | - | - | - |
| D | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Таблица 2 |
||||||||||||
| Результаты учета реакции латекс-агглютинации | ||||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| А | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| В | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| С | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Таблица 3 | |||||||||||
| Выявление V антигена Yersinia pestis методом ИФА | |||||||||||
| Концентрация МКА 5G6(мкг/лунка) | Концентрация V антигена (мкг/лунка) | ||||||||||
| 0,5 | 0,25 | 0,125 | 0,062 | 0,03 | 0,015 | 0,0075 | 0,0037 | 0,0018 | 0,001 | 0,0005 | |
| Оптическая плотность при длине волны 492 нм (о.е.) | |||||||||||
| 5,00 | 2,332 | 1,687 | 1,376 | 1,190 | 0,656 | 0,403 | 0,242 | 0,174 | 0,075 | 0,048 | 0,028 |
| 2,50 | 1,942 | 1,570 | 1,227 | 0,701 | 0,335 | 0,173 | 0,063 | 0,008 | -0,008 | -0,005 | -0,008 |
| 1,25 | 1,080 | 0,662 | 0,481 | 0,246 | 0,080 | 0,022 | -0,027 | -0,016 | -0,016 | -0,013 | -0,009 |
| 0,63 | 0,372 | 0,238 | 0,199 | 0,119 | 0,037 | -0,031 | -0,028 | -0,025 | -0,024 | -0,021 | -0,003 |
| 0,30 | 0,095 | 0,046 | 0,030 | 0,003 | -0,049 | -0,047 | -0,047 | -0,038 | -0,035 | 0,030 | -0,009 |
| 0,15 | 0,014 | 0,014 | 0,005 | 0,001 | -0,049 | -0,045 | -0,042 | -0,040 | -0,038 | -0,038 | -0,025 |
| 0,07 | -0,053 | -0,048 | -0,044 | -0,044 | -0,044 | -0,044 | -0,043 | -0,035 | -0,032 | -0,025 | -0,019 |
| 0,03 | -0,062 | -0,053 | -0,046 | -0,045 | -0,045 | -0,042 | -0,042 | -0,039 | -0,038 | -0,035 | -0,032 |
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 5G6 - продуцент моноклональных антител, специфичных к V антигену Yersinia pestis, депонирован в государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск», коллекционный номер Н-19.
