Способ повышения эффективности вирусной трансдукции

Изобретение относится к области биотехнологии. Эукариотические клетки трансдуцируют ретровирусом в присутствии гистонного белка бис-мет-гистона И 1.3. Способ позволяет повысить эффективность ретровирусной трансдукции и избежать недостатков аналогов. Изобретение может быть использовано в медицине, ветеринарии, биологии для получения лекарственных препаратов для генной терапии и для генетической модификации клеток in vitro/ex vivo. 6 ил., 4 пр.

 

Изобретение относится к способу увеличения частоты ретровирусной трансдукции эукариотических клеток и может быть использовано в медицине, ветеринарии, биологии для получения лекарственных препаратов для генной терапии.

Известен способ [1] повышения эффективности ретровирусной трансдукции (инфекции, трансфекции генетического материала) с помощью поликатиона - декстрана. Недостатком способа является высокая токсичность и низкая эффективность декстрана. Кроме того, декстран не разрешен для клинического применения.

Известен способ [2] повышения эффективности ретровирусной трансдукции с помощью поликатиона - полибрена. Недостатком способа (Manning, Hackett et a1. 1971) является высокая токсичность и низкая эффективность полибрена. Кроме того, полибрен не разрешен для клинического применения.

Известен способ [3] «Опосредованный вирусом усиленный перенос ДНК». Способ также направлен на повышения эффективности ретровирусной трансдукции. Усиление ретровирусного переноса ДНК достигают инфицированием клеток в присутствии фибронектина или его фрагментов. Недостатком известного способа является высокая себестоимость фибронектина. Кроме того, инфицирование в присутствии фибронектина по указанному способу возможно только in vitro/ex vivo, так как фибронектин является одним из основных компонентов плазмы крови (300 мкг/мл). Таким образом, способ теряет смысл при применении in vivo, при котором фибронектин присутствует в больших количествах в организме в норме.

Наиболее близким изобретением является известный способ [4] повышения эффективности ретровирусной трансдукции с помощью протамин сульфата-специфического антагониста гепарина. Недостатком способа является низкая эффективность повышения ретровирусной трансдукции и возможные побочные эффекты при клиническом применении протамин сульфата. Например, внутривенное введение может вызвать артериальную гипотензию, брадикардию, чувство жара и покраснение кожи. У больных, принимавших протамин-цинк инсулин для лечения сахарного диабета, возможны анафилактические реакции на протамина сульфат. Противопоказанием к применению протамин сульфата является гиперчувствительность, идиопатическая или врожденная гипергепаринемия. Может взаимодействовать с другими лекарственными веществами, например с растворами цефалоспоринов и пенициллином, что может привести к снижению эффективности лекарственной терапии.

Способ позволяет повысить эффективность ретровирусной трансдукции и избежать недостатков аналогов.

Технический результат достигают тем, что эукариотические клетки трансдуцируют ретровирусом в присутствии гистонного белка - бис-мет-гистона Н 1.3 [5]. Под определением РЕТРОВИРУС подразумевают любой вирус семейства Retroviridae. Все представители семейства Retroviridae обладают схожим строением и жизненным циклом. Это семейство РНК-содержащих вирусов, представляющих из себя сферические вирионы сферической формы размером 80-100 нм, покрытые внешней липопротеиновой оболочкой, содержащие оболочечные гликопротеины. После инфицирования клетки ретровирусом в цитоплазме начинается синтез вирусного ДНК-генома с использованием вирионной РНК в качестве матрицы. Все ретровирусы используют для репликации своего генома механизм обратной транскрипции: вирусный фермент обратная транскриптаза (или ревертаза) синтезирует одну нить ДНК на матрице вирусной РНК, а затем уже на матрице синтезированной нити ДНК достраивает вторую, комплементарную ей нить. Образуется двунитевая молекула ДНК, которая, проникнув через ядерную оболочку, интегрируется в хромосомную ДНК клетки и далее служит матрицей для синтеза молекул вирусных РНК. Эти РНК выходят из клеточного ядра и в цитоплазме клетки упаковываются в вирусные частицы, способные инфицировать новые клетки. Наиболее известным представителем семейства Retroviridae является вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). В качестве примера метода повышения эффективности вирусной трансдукции, мы используем репликационно дефектный рекомбинантный лентивирус (GFP-RV), сконструированный на основе генома ВИЧ и сохранившего основные свойства ВИЧ дикого типа: способность взаимодействовать с клеточными мембранами посредством поверхностных гликопротеинов, проникать внутрь клетки-хозяина, осуществлять реакцию обратной транскрипции, транспорта в ядро клетки и интеграции в геном клетки-хозяина. Так как подобные стадии жизненного цикла присущи всем представителям семейства Retroviridae, то предложенный метод будет эффективным и для других представителей семейства.

Возможность осуществления изобретения иллюстрируют примеры. Способ производят последовательно, например, в четыре этапа.

Пример 1

Первый этап.

Культивирование клеток.

Все работы с культурой клеток проводят в стерильном ламинарном боксе согласно общепринятым правилам работы в лаборатории 2-го класса био-безопасности.

Эмбриональные клетки почки человека НЕК-293Т (АТСС, CRL-11268) и HeLa (АТСС, CCL-2) культивируют в среде DMEM с добавлением 10% сыворотки крови плодов коровы (англ. Fetal Bovine Semm, FBS) и пенстрепа (фирма-производитель - Sigma, Великобритания). Клетки инкубируют при плюс 37°С, во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2. Пересев клеток проводят при плотности клеточного монослоя 90% с применением 0,25% раствора трипсина-ЭДТА (фирма-производитель - БиоЛот, Санкт Петербург).

Таким путем завершают получение клеточных культур НЕК-293Т и HeLa и приступают ко второму этапу.

Второй этап. Получение рекомбинантного лентивируса (GFP-RV).

Рекомбинантный лентивирус получают с помощью котрансфекции культуры клеток плазмидами, кодирующими разные компоненты рекомбинантного вируса. Например плазмидами, полученными из некоммерческой организации AddGene (www.addgene.org): pCMV-VSV-G (плазмида №8454), psPAX2 (плазмида №12260) и pWPT-GFP (плазмида №12255). Клетки НЕК-293Т культивируют в культуральном флаконе Т75 до плотности клеточного монослоя 70%. Трансфекцию проводят, например через 2 часа после смены среды трансфекционной смесью: 112,5 мкг векторной плазмиды pWPT-GFP, 39,5 мкг оболочечной плазмиды pCMV-VSV-G, 75 мкг упаковочной плазмиды psPAX2, 3,3 мл ТЕ 0, 1X (10 мМ Трис + 1 мМ ЭДТА рН 8,0), 1,75 мл дистиллированной воды, 565 мкг 2,5 М раствора CaCl2, 5,7 мл 2х HBS (0,280 М NaCl, 0,1 М Hepes, 0,0015 М Na2HPO4, рН 7,12). Через 17 часов после трансфекции заменяют среду на свежую. Сбор содержащего вирус супернатанта проводят 3 раза, через каждые 12 часов. Супернатанты объединяют и хранят при плюс 4°С. По завершению сбора супернатанты центрифугируют в течение 5 минут, при 1500 об/мин и фильтруют через фильтр 0,22 мкм. Очищенные супернатанты хранят в аликвотах при минус 80°С.

Таким путем завершают получение раствора рекомбинантного лентивируса GFP-RV и приступают к третьему этапу.

Третий этап. Приготовление раствора бис-мет-гистона H 1.3.

Для приготовления препаратов гистона (гистонного белка) делают навеску бис-мет-гистона Н 1.3, растворяют в стерильной воде MilliQ до концентрации 50 мкг/мкл. Рабочий раствор бис-мет-гистона Н 1.3 хранят при плюс 4°С.

Четвертый этап. Трансдукция клеток HeLa рекомбинантным лентивирусом GFP-RV.

Эксперименты проводят, например - в 24-луночных культуральных планшетах. Клетки HeLa культивируют в 24-луночном планшете до плотности клеточного монослоя 50%. Далее клетки инфицируют рекомбинантным лентивирусом GFP-RV, экспрессирующим GFP. Для этого к клеткам HeLa добавляют рекомбинантный лентивирус с протамин сульфатом в количестве 5 мкг на 500 мкл среды (конечная концентрация 10 мкг/мл).

Клетки инкубируют в течение 48 часов при плюс 37°С, во влажной атмосфере, содержащей 5% СO2, после чего определяют степень инфицирования клеток рекомбинантным лентивирусом.

Инфицирование клеток определяют по экспрессии и флуоресценции GFP, например - на проточном цитометре Becton Dickinson FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) согласно инструкциям производителя.

Пример 2

Отличается от примера 1 тем, что на 4 этапе клетки (вместо протамин сульфата) предобрабатывают бис-мет-гистоном Н 1.3. и затем добавляют рекомбинантный лентивирус.

Пример 3

Отличается от примера 1 тем, что на 4 этапе клетки (вместо протамин сульфата) обрабатывают рекомбинантным лентивирусом и затем бис-мет-гистоном H 1.3.

Пример 4

Отличается от примера 1 тем, что на 4 этапе клетки (вместо протамин сульфата) обрабатывают смесью рекомбинантного лентивируса и бис-мет-гистона H 1.3.

Бис-мет-гистон Н 1.3 (в примерах 2-4) добавляют в лунку в количестве 125 мкг на 500 мкл среды (конечная концентрация 250 мкг/мл).

Концентрация 250 мкг/мл - максимально нетоксичная концентрация гистона для клеток HeLa (на сроках 24, 48 и 72 часа после добавления бис-мет-гистона Н 1.3), то есть была выбрана максимально безопасная (с точки зрения цитотоксичности) концентрация гистона, которая является эффективной в данном случае. В каждом конкретном случае количество бис-мет-гистона Н 1.3 будет зависеть от клеточной культуры, от используемого ретровируса и возможно других факторов.

На Фигурах приведены данные проточной цитофлуориметрии клеток, трансдуцированных рекомбинантным лентивирусом, экспрессирующим зеленый флуоресцентный белок GFP. Культуру клеток или раствор лентивируса обрабатывали рекомбинантным бис-мет-гистоном Н 1.3 в различных вариантах. Эффективность вирусной трансдукции по экспрессии репотерного гена, например - GFP. Ген GFP входит в состав генома рекомбинантного лентивируса и, таким образом, ведет себя как типичный вирусный ген. Для экспрессии лентивирусных генов необходимо, чтобы провирус встроился (интегрировался) в геном клетки хозяина. После встраивания в геном клетки хозяина начинается экспрессия вирусных генов - транскрипция мРНК и трансляция белка. Таким образом, наличие зеленой флуоресценции клеток свидетельствует об успешной вирусной трансдукции.

Фиг.1. Не трансдуцированные клетки (контроль фоновой флуоресценции). В связи с тем, что популяция клеток обладает естественной гетерогенностью по уровню автофлуоресценции, пороговое значение флуоресценции было выбрано таким образом, что 99,5% клеток считались не флуоресцирующими, а 0,5% клеток, соответственно, считались ложно-положительными по флуоресценции.

Фиг.2. - Клетки, трансдуцированные рекомбинантным лентивирусом GFP-RV. 9,21% клеток обладали флуоресценцией, что свидетельствует о трансдукции GFP-RV.

Фиг.3. - Клетки, трансдуцированные рекомбинантным лентивирусом GFP-RV с добавлением протамин сульфата. 12,73% клеток обладали флуоресценцией, что свидетельствует о трансдукции GFP-RV. Таким образом, добавление протамин сульфата повысило эффективность вирусной трансдукции на 38,22% по отношению с GFP-RV без дополнительных добавок.

Фиг.4. - Клетки, предобработанные рекомбинантным бис-мет-гистоном Н 1.3 и затем трансдуцированные рекомбинантным лентивирусом GFP-RV. 8,16% клеток обладали флуоресценцией, что свидетельствует о трансдукции GFP-RV. Таким образом, предобработка клеток бис-мет-гистоном Н 1.3 не привела к увеличению эффективности лентивирусной трансдукции.

Фиг.5. - Клетки, трансдуцированные рекомбинантным лентивирусом GFP-RV и затем обработанные рекомбинантным бис-мет-гистоном Н 1.3. 27,19% клеток обладали флуоресценцией, что свидетельствует о трансдукции GFP-RV. Таким образом, обработка бис-мет-гистоном Н 1.3 повысила эффективность вирусной трансдукции на 213,59% по отношению с GFP-RV без дополнительных добавок.

Фиг.6. - Клетки, трансдуцированные смесью рекомбинантного лентивируса GFP-RV и рекомбинантного бис-мет-гистона Н 1.3. 23,75% клеток обладали флуоресценцией, что свидетельствует о трансдукции GFP-RV. Таким образом, смесь GFP-RV с бис-мет-гистоном Н 1.3 повысила эффективность вирусной трансдукции на 186,57% по отношению с GFP-RV без дополнительных добавок.

Приведенные примеры показывают полезность способа для повышения эффективности ретровирусной трансдукции. Способ повышения эффективности вирусной трансдукции может найти применение в клеточной биологии, биотехнологии и генной терапии для создания препаратов, повышающих эффективность ретровирусной трансдукции, что применимо, в частности, для генетической модификации клеток in vitro.

Данное техническое решение также может найти применение для лечения наследственных заболеваний, посредством использования известных стандартных технических устройств и оборудования.

Источники информации

1. Duc-Nguyen, H. (1968). "Enhancing effect of diethylaminoethyl-dextran on the focus-forming titer of a murine sarcoma virus (Harvey strain)." J Virol 2(6): 643-644.

2. Manning, J.S., A.J.Hackett, et al. (1971). "Effect of polycations on sensitivity of BALD-3T3 cells to murine leukemia and sarcoma virus infectivity." Appl Microbiol 22(6): 1162-1163.

3.Патент RU 2174846. Опосредованный вирусом усиленный перенос ДНК.

4. Cornetta, K. and W.F.Anderson (1989). "Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy." J Virol Methods 23(2): 187-194.

5. WO 2008122434, 16.10.2008.

Способ увеличения частоты трансдукции эукариотических клеток с помощью ретровируса, отличающийся тем, что эукариотические клетки инфицируют ретровирусом в присутствии бис-мет-гистона Н 1.3 в эффективном количестве.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к таким иммуногенным и вакцинным композициям, которые пригодны для использования у различных животных (мишеневых или хозяев) видов, восприимчивых к заболеванию, вызванному BTV, включая, но не ограничиваясь, млекопитающих, рептилий, птиц, в особенности людей, парных млекопитающих или животных, таких как, но не ограничиваясь, собак, кошек, лошадей, млекопитающих из зоопарков или животных, таких как морские млекопитающие, напр., тюлени, кошки, лошади, зоопарковые рептилии, такие как змеи, крокодилы, аллигаторы, и птичьи виды.

Изобретение относится к медицинской и молекулярной генетике. .

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии. .

Изобретение относится к области биотехнологии и здравоохранения. .

Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии, вирусологии и медицины. .

Изобретение относится к области генной инженерии и вирусологии. .

Изобретение относится к области молекулярной биологии, конкретно, к белкам, регулирующим клеточную дифференцировку путем ингибирования белка семейства Wnt, и может быть использовано в медицине для профилактики и лечения связанных с нарушениями активности Wnt сигнального пути заболеваний, например рака толстой кишки, меланомы, карциномы.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицине, конкретно к применению EGFRvIII совместно с темозоломидом, и может быть использовано для лечения опухоли у субъекта.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к исследованию рецептору, сопряженному с G-белком, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к области биохимии. .

Изобретение относится к медицине и касается набора для определения целевого полипептида, выбранного из группы A 42, A 40 и их смеси. .

Изобретение относится к пептидам общей формулы R 1-AA-R2, которые могут регулировать нейронный экзоцитоз, их смесям и их косметически или фармацевтически приемлемым солям, где АА представляет собой последовательность 6-40 соседних аминокислот, содержащихся в аминокислотной последовательности белка SNAP-25, R1 выбран из группы, состоящей из Н или ацетила, либо насыщенного или ненасыщенного, линейного, разветвленного или циклического С3-С24ацила, либо полиэтиленгликолевого полимера, R2 выбран из группы, состоящей из амино, незамещенного или замещенного насыщенными линейными, или разветвленными, или циклическими С1-С24 алифатическими группами, при условии, что когда R1 представляет собой Н или ацетил, тогда R2 не является незамещенным амино.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к использованию рекомбинантных белков для лечения млекопитающих, страдающих от злокачественных опухолей.

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к стабильным производным метастина, обладающим превосходными биологическими активностями. .

Изобретение относится к области биотехнологии

Наверх