Олигонуклеотидные праймеры bmvat7-ch2s/bmvat7-ch2as для обнаружения фрагмента дифференциации вмаа0871 штаммов возбудителя сапа



Олигонуклеотидные праймеры bmvat7-ch2s/bmvat7-ch2as для обнаружения фрагмента дифференциации вмаа0871 штаммов возбудителя сапа
Олигонуклеотидные праймеры bmvat7-ch2s/bmvat7-ch2as для обнаружения фрагмента дифференциации вмаа0871 штаммов возбудителя сапа
Олигонуклеотидные праймеры bmvat7-ch2s/bmvat7-ch2as для обнаружения фрагмента дифференциации вмаа0871 штаммов возбудителя сапа

 


Владельцы патента RU 2478713:

Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии, молекулярной эпидемиологии. Предложены олигонуклеотидные праймеры для генотипирования В.mallei методом полимеразной цепной реакции. Изобретение может быть использовано в медицине для обнаружения возбудителя сапа. 3 ил., 3 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии, молекулярной эпидемиологии и может быть использовано в медицине для обнаружения дифференцирующего фрагмента ДНК ВМАА0871 в составе схемы генотипирования возбудителя сапа Burkholderia mallei как для практического здравоохранения, службы Роспотребнадзора, так и для научных исследований.

Возбудитель сапа (Burkholderia mallei) - аэробная грамотрицательная неферментирующая бактерия, принадлежащая к роду Burkholderia и относящаяся к потенциальным агентам биотерроризма группы В. Caп - особо опасная зоонозная инфекция. Необходимость исследований, направленных на генотипирование штаммов В.mallei, связана с сохранением угрозы возникновения чрезвычайных биологических ситуаций, обусловленных возникновением техногенных катастроф, природных катаклизмов, и возможных террористических актов с использованием этого возбудителя.

Генотипирование - комплексный анализ уникального для каждого живого организма генотипа на основе изучения его ДНК. Метод генотипирования на основе анализа вариабельных ампликонов (VAT - variable amplicontyping) заключается в серии полимеразных цепных реакций с праймерами, фланкирующими фрагменты уникальных ДНК-мишеней, существующих только у определенных штаммов, что позволяет проводить внутривидовую дифференциацию.

Метод полимеразной цепной реакции является прямым методом выявления целевых участков ДНК. В основе метода ПЦР лежит природный процесс репликации ДНК - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы.

Процесс удвоения нуклеиновых кислот можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных штаммов определенного вида микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генотипирования возбудителя сапа.

Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфические для определенных штаммов возбудителя сапа. Праймеры комплиментарны последовательностям ДНК на левой и правой границах дифференцирующего фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. В результате ПНР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка гена, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа исследуемых микроорганизмов.

Наиболее близким аналогом является схема генотипирования с использованием амплификации дифференцирующих фрагментов для возбудителя мелиоидоза, предложенная Kwanjit Duangsonk с соавторами в 2006 г. [Use of a Variable Amplicon Typing Scheme Reveals Considerable Variation in the Accessory Genomes of Isolates of Burkholderia pseudomallei, Kwanjit Duangsonk, Daniel Gal, Mark Mayo, C. Anthony Hart, Bart J. Currie, and Craig Winstanley]. Для возбудителя сапа подобных исследований ранее не проводилось.

Целью настоящего изобретения является получение олигонуклеотидных праймеров для идентификации дифференцирующего фрагмента генома ВМАА0871 В.mallei методом полимеразной цепной реакции.

Цель достигается конструированием специфичных олигонуклеотидов для идентификации вариабельного фрагмента ДНК штаммов возбудителя сапа, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации, имеющих следующую структуру:

5'-СТСАССТТССТТGGAGAGCC-3'-BmVAT7-Ch2s

5'-AGCGAATAGCCGTTGGTTTC-3'-BmVAT7-Ch2as

Характеристика олигонуклеотидных праймеров и участка амплифицируемой ДНК.

Основываясь на данных, представленных в базе GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, США), были подобраны праймеры, обозначенные BMVA T7-CH2S/BMVAT7-CH2AS, комплементарные дифференцирующему фрагменту ВМАА0871 для внутривидового типирования В.mallei. Расчетная длина специфического фрагмента составляет 166 п.н.

Апробация праймеров и зонда была осуществлена на наборе штаммов возбудителя сапа коллекционного центра МЖК Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров для обнаружения дифференцирующего фрагмента ВМАА0871 ДНК возбудителя сапа методом ПЦР.

На основе теоретического изучения секвенированных нуклеотидных последовательностей четырех штаммов возбудителя сапа, присутствующих в базах данных (EMBL, Genbank, DDBJ), для конструирования праймеров был выбран фрагмент вариабельной последовательности ВМАА0871, обнаруженной in silico на второй хромосоме штаммов В.mallei SA VP1 и В.mallei ATCC 22344. В составе генома штамма В.mallei NCTC 10229, В.mallei NCTC 10247 данного фрагмента обнаружено не было. Данный факт позволил рассматривать участок последовательности ВМАА0871 в качестве дифференцирующего фрагмента, пригодного для генотипирования возбудителя сапа. Расчетная длина фрагмента ДНК, фланкируемого предлагаемыми праймерами - 166 п.н.

При использовании компьютерных программ была проанализирована структура выбранных пар праймеров (образование димеров, шпилек и других вторичных структур) и показана их теоретическая пригодность для успешной инициации реакции амплификации.

Пример 2. Амплификация специфических фрагментов ДНК с помощью разработанных праймеров для внутривидовой дифференциации возбудителя сапа.

В состав реакционных смесей входили комплементарные специфическому фрагменту праймеры, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, буферный раствор и фермент Taq-полимераза. Для предупреждения испарения в процессе амплификации на мультициклере «Терцик» на поверхность смеси наслаивали 20 мкл минерального масла. Для отрицательного контроля в пробирку вместо образца вносили такой же объем дистиллированной воды. Амплификацию продолжительностью 40 циклов проводили в микроцентрифужных пробирках (0,5 мл) на мультициклере «Терцик» (ЗАО «НПФ ДНК-технология», г.Москва) в объеме 25 мкл с использованием «горячего старта».

Условия проведения реакции: этап предварительной денатурации ДНК при 95°С - 5 мин, затем в течение 40 циклов - денатурация ДНК при 95°С - 10 сек; отжиг праймеров при 60°С - 10 сек; элонгация цепи при 72°С - 10 сек, с финальной полимеризацией в течение 1 мин.

Анализ продуктов ПЦР осуществляли с помощью электрофореза в 3% агарозном геле, сравнивая их подвижность с подвижностью полос маркеров молекулярного веса (рис.1). Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждалась ее положением по отношению к контрольным маркерным фрагментам (леддер 100 п.н. ДНК, ООО «Интерлабсервис», Москва) и ДНК-стандарту (ДНК, выделенная из В. mallei Ц-5 в концентрации 1×105 м.к./мл).

Пример 3. Использование олигонуклеотидных праймеров BMVAT7-CH2S/BMVAT7-CH2AS в составе схемы дифференциации штаммов возбудителя сапа на музейных штаммах коллекционного центра живых культур Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.

Специфичность реакции амплификации с разработанными специфичными праймерами оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из бактериальных взвесей клеток, выращенных на плотных питательных средах в 4 мл 0,15 М NaСl в концентрации, соответствующей 1×109 м.к./мл по стандартному образцу мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича (ОСО 42-28-85 П). Обеззараживание материала проводили в соответствии с МУ 1.3.1794-03 и МУ 3.5.5.1034-01.

Обеззараживание исследуемых проб производили добавлением раствора мертиолята натрия до конечной концентрации 0,1% и прогреванием в течение 40 мин при температуре 56°С. Выделение ДНК из чистых культур буркхольдерий осуществляли с помощью метода нуклеосорбции на силикагеле в присутствии гуанидинтиоционата (R.Boom et al. - 1990 г.). Постановку реакции ПЦР осуществляли как описано в примере 2.

При тестировании коллекции культур В. mallei Волгоградского научно-исследовательского противочумного института с использованием разработанных олигонуклеотидных праймеров продукт амплификации синтезировался с ДНК следующих штаммов возбудителя сапа: В. mallei Ц-4, В.mallei Ц-5, В.mallei 11, В.mallei 8, В.mallei V-120, В. mallei P-1, B. mallei Иванович, В.mallei 5584, В.mallei Z-12. Co штаммами В. mallei Муксувар, В.mallei Загреб, В.mallei Bogor, B.mallei 10230 и В.mallei Будапешт в реакции ПНР с разработанными праймерами в 100% случаев получен отрицательный результат (рис.2).

На основе анализа вариабельных ампликонов нами разработана схема генотипирования возбудителя сапа, состоящая из 9 реакций амплификации. Сочетание положительных и отрицательных результатов ПЦР формирует VAT-паттерны, уникальные для каждого штамма возбудителя сапа (рис.3А).

Таким образом, с использованием разработанных праймеров BMVAT7-CH2S/BMVA T7-CH2AS в составе схемы внутривидовой дифференциации возбудителя сапа методом VAT, удалось разделить 18 исследуемых штаммов В.mallei на 15 типов (рис.3).

Олигонуклеотидные праймеры для генотипирования В.mallei методом полимеразной цепной реакции, обладающие активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации, имеющие следующую структуру:
5'-СТС АСС ТТС СТТ GGA GAG CC-3'-BmVAT7-Ch2s
5'-AGC GAA TAG CCG TTG GTT TC-3'-BmVAT7-Ch2as
комплементарные дифференцирующему фрагменту генома возбудителя сапа ВМАА0871.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, а именно к генетической инженерии. .

Изобретение относится к способу обнаружения и подсчета жизнеспособных микроорганизмов вида Legionella pneumophila в образце. .

Изобретение относится к способу измерения относительных уровней кариесогенных и аргинолитических бактерий в ротовой полости, например, как части режима стоматологического обслуживания, путем применения композиции, включающей основную аминокислоту в форме свободного соединения или соли.

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии и касается олигонуклеотидных праймеров для генотипирования В.mallei. .

Изобретение относится к области биотехнологии и касается олигонуклеотидных праймеров для генотипирования В.mallei. .

Изобретение относится к области биотехнологии и касается олигонуклеотидных праймеров для генотипирования В.mallei. .

Изобретение относится к области биотехнологии и касается олигонуклеотидных праймеров для генотипирования B.mallei. .

Изобретение относится к области биотехнологии и касается олигонуклеотидных праймеров для генотипирования В.mallei. .

Изобретение относится к области биотехнологии и касается олигонуклеотидных праймеров для генотипирования В.mallei. .

Изобретение относится к области биотехнологии и касается олигонуклеотидных праймеров для генотипирования В.mallei. .

Изобретение относится к области биотехнологии и касается олигонуклеотидных праймеров для генотипирования B.mallei. .

Изобретение относится к области биотехнологии и касается олигонуклеотидных праймеров для генотипирования В.mallei. .

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетике. .
Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии. .
Изобретение относится к области биохимии, молекулярной биологии, ветеринарии и медицины. .

Изобретение относится к области биотехнологии и касается олигонуклеотидных праймеров для генотипирования В.mallei
Наверх