Способ иммунофлуоресцентного определения протективного антигена возбудителя сибирской язвы

Разработан способ иммунофлуоресцентного высокочувствительного определения протективного антигена (ПА) возбудителя сибирской язвы на основе моноклональных антител, специфичных к различным эпитопам протективного антигена, одно из которых, специфичное к III домену ПА, иммобилизовано на твердой фазе и служит для связывания ПА, содержащегося в исследуемых пробах, а второе биотинилированное антитело, специфичное к IV домену, детектирует протективный антиген за счет взаимодействия с тетравалентной молекулой нейтравидина, конъюгированной с фикоэритрином, используемым для флуоресцентной детекции сигнала в режиме реального времени. Присутствие ПА в исследуемых образцах определяют по изменению уровня флуоресценции по сравнению с контролем. Способ характеризуется высокой чувствительностью (1 пг/мл) и позволяет проводить диагностику заболевания на ранних стадиях заражения сибирской язвой, предотвращая развитие токсической патологии и риск летального исхода и обеспечивая благоприятный прогноз исхода заболевания. 2 ил., 1 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, конкретно к областям диагностической медицинской микробиологии, прикладной иммунохимии и разработки диагностических тест-систем для иммунофлуоресцентного определения протективного антигена (ПА) возбудителя сибирской язвы в образцах биологического происхождения. Основной областью применения предлагаемого способа являются микробиологическая диагностика, микробиологические исследования, разработка средств ранней высокоэффективной диагностики возбудителя сибирской язвы, предотвращение угрозы биотерроризма.

Сибирская язва является особо опасным инфекционным заболеванием, поражающим животных и людей. В неблагоприятных условиях возбудитель сибирской язвы формирует спору и, переходя в метаболически неактивное состояние, сохраняется в почве в течение многих лет, формируя устойчивые природные очаги инфекции. По данным Всемирной организации здравоохранения в мире ежегодно регистрируется от 2000 до 20000 случаев заболевания сибирской язвой. В России известно около 72 тысяч пунктов, в которых регистрировались случаи сибирской язвы [1]. Кроме того. Bacillus anthracis традиционно рассматривается в качестве потенциального средства биотеррористической атаки. В 2001 году споры сибирской язвы были применены в качестве бактериологического оружия в США. В связи с чем разработка эффективных средств ранней диагностики сибирской язвы является актуальной задачей биологической защиты. В обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия по сибирской язве особая роль отводится качественной и своевременной диагностике.

В настоящее время традиционная схема лабораторного анализа по определению возбудителя сибирской язвы включает в себя использование биопробных животных и выделение чистой культуры. Эти исследования занимают до 10 дней [2].

В реализации патогенного действия сибиреязвенного микроба ведущая роль принадлежит полиглютаминовой капсуле и бифункциональному экзотоксину. Экзотоксин, состоящий из рецептор-связывающего компонента, также известного как протективный антиген (ПА), и двух эффекторов - отечного (ОФ) и летального (ЛФ) факторов, запускает основные звенья патогенеза сибиреязвенной инфекции. При взаимодействии протеолитически активированного ПА с ОФ и ЛФ образуются токсичные комплексы, оказывающие повреждающее действие на клетки макроорганизма [3]. Выявление в крови человека и животных компонентов экзотоксина Bacillus anthracis, в частности протективного антигена, на ранних стадиях заболевания в крайне низких концентрациях (около 1 пг/мл) предотвращает развитие токсической патологии [4] и позволяет своевременно начать адекватное лечение, тем самым предотвращая риск летального исхода и обеспечивая благоприятный прогноз исхода заболевания.

Повышение эффективности диагностики сибиреязвенной инфекции осуществляется при помощи современных методов детекции, таких как ПЦР-диагностика [5], масс-спектрометрия [6], иммунохимические методы. Однако, обладая высокой специфичностью и чувствительностью, все эти методы детекции имеют ряд существенных ограничений. Так, ПЦР-анализ очень чувствителен к контаминации, в связи с чем для получения воспроизводимых результатов требуется длительная и сложная процедура предварительной обработки образцов, а также тщательный подбор условий реакции. Несоблюдение данных требований может привести к возникновению ложноположительных результатов.

Обладающая высокой чувствительностью масс-спектрометрия (до 1 пг) также осложняется необходимостью тщательной предварительной очистки исследуемого материала, что занимает достаточно продолжительное время. Следует добавить, что на данный момент большинство этих методов находится на стадии экспериментальных разработок и не доступно в виде коммерческих диагностических препаратов.

Помимо ПЦР-анализа в реальном времени, масс-спекрометрических методов наибольшее распространение для выявления и идентификации антигенов и микробных клеток возбудителей инфекционных заболеваний в настоящее время получили иммунологические методы, основанные на специфическом взаимодействии целевого антигена и антител. Методы, используемые для иммунодетекции различных маркеров возбудителей инфекционных заболеваний, в зависимости от принципов детекции, на которых они основаны, обладают различными аналитическими характеристиками - специфичностью и чувствительностью [7]. Специфичность иммунологических методов может быть увеличена за счет использования моноклональных антител, обладающих наибольшим сродством к целевому антигену в отличие от поликлональных сывороток. Эффективность применения моноклональных антител (МКА) в качестве основы при изготовлении медицинских иммунобиологических препаратов для обнаружения и идентификации возбудителей опасных инфекционных заболеваний подтверждена многочисленными исследованиями. Одним из современных направлений биотехнологии является разработка технологий на основе иммобилизованных форм биологических объектов. Перспективными для использования в методах иммуноанализа являются твердофазные носители, в частности различные гранулированные сорбенты, а также сорбенты с магнитными свойствами [9].

Известен способ определения специфических антигенов возбудителя сибирской язвы с помощью реакции иммунопреципитации по Асколи. Реакция по Асколи позволяет в короткие сроки обнаружить сибиреязвенный антиген в экстрактах из струпьев язв больных, органов умерших от сибирской язвы людей, шкур и органов павших животных. Недостатком данного метода является невысокая чувствительность, в связи с чем при исследовании заведомо сибиреязвенного материала реакция дает отрицательный результат.

Известен способ определения протективного антигена Bacillus anthracis в сыворотке или плазме крови с помощью иммунофильтрации («Senova abicap classic test kit», Senova immunoassay systems). Однако чувствительность данного метода составляет всего 100 пкг/мл, что может оказаться недостаточным для ранней диагностики сибиреязвенного заболевания и предотвращения развития токсической патологии.

Также известен способ иммунохроматографического определения протективного антигена Bacillus anthracis в крови зараженных животных и человека. Протективный антиген улавливается моноклональными антителами, сорбированными на нитроцеллюлозной мембране, а вторые моноклональные антитела, специфичные к другим эпитопам протективного антигена и связанные с частицами коллоидного золота, являются реагентами для детекции. Для проведения реакции требуется 10-15 минут, однако данный метод недостаточно чувствителен (около 25 нг/мл ПА) [8].

Известен способ иммунофлуоресцентного определения спор возбудителя сибирской язвы в объектах окружающей среды и биологических образцах ("RAMP Anthrax Test", Response Biomedical Corporation, США). Однако данная тест-система не достаточно чувствительна (4 нг спор) и не применима для детекции специфических антигенов Bacillus anthracis (протективный антиген, летальный фактор) или вегетативной формы возбудителя сибирской язвы и, следовательно, не может использоваться для диагностики инфекции на ранних стадиях заболевания.

Также известен способ определения ПА методом иммуноферментного анализа ("Anthrax Protective Antigen (PA) ELISE Kit», Bio-Quant Incorporation, США). Недостаток метода - невысокая чувствительность (наименьшее количество антигена, определяемое данным методом, составляет 10 нг/мл).

Задача изобретения - разработка высокочувствительного и высокоспецифичного иммунофлуоресцентного метода определения протективного антигена возбудителя сибирской язвы в биологических образцах на ранних стадиях заболевания сибирской язвой.

Поставленная задача решается тем, что предложен способ иммунофлуоресцентного определения протективного антигена возбудителя сибирской язвы в биологических образцах, включающий адсорбцию белка протективного антигена на полистироловых микросферах при помощи специфического моноклонального антитела к III домену ПА, связывание иммобилизованного белка протективного антигена при помощи биотинилированного моноклонального антитела, специфичного к IV домену ПА, детекцию иммунокомплекса моноклональное антитело-ПА-биотинилированное антитело посредством связывания с нейтравидином, конъюгированным с фикоэритрином, используемым для флуоресцентной детекции сигнала в режиме реального времени. Наличие протективного антигена в исследуемых пробах определяют по интенсивности сигнала флуоресценции в соответствующих лунках планшета по сравнению с контрольными лунками. В качестве отрицательного контроля используют значения сигнала флуоресценции в лунках планшета, не содержащих исследуемых образцов. В качестве положительного контроля используют значения сигнала флуоресценции в лунках планшета, содержащих протективный антиген возбудителя сибирской язвы в известной концентрации.

Отличием предлагаемого способа является использование пары моноклональных антител, специфичных к различным доменам (III и IV домены) протективного антигена, за счет чего обеспечивается высокая специфичность определения, так как детекция протективного антигена возможна только при его «узнавании» обоими антителами. При этом не происходит конкуренции между антителами за сайты связывания, что увеличивает чувствительности определения.

Также поставленная задача решается тем, что применятся твердофазный формат, а именно полистироловые карбоксилированные микросферы, на которых ковалентно иммобилизуются моноклональные антитела к III домену ПА, с высокой специфичностью связывающие минимальные количества протективного антигена, содержащегося в исследуемых образцах. Тем самым уже на ранних стадиях анализа происходит удаление содержащихся в образцах контаминирующих веществ.

Также поставленная задача решается тем, что в качестве детектирующих антител применяются моноклональные антитела, конъюгированные с биотином, что увеличивает количество молекул фикоэритрина, связанных с единичной молекулой детектирующего антитела, тем самым усиливая сигнал.

Также поставленная задача решается тем, что для детекции сигнала используется система Био-Плекс (Био-Рад), основанная на принципах проточной цитометрии. Каждая микросфера проходит через детекционную камеру и считывается дискретно. При этом происходит возбуждение как внутренних флуоресцентных красителей, связанных с самой микросферой, так и флуоресцентных репортеров, ассоциированных с искомым аналитом, полученные данные суммируются и обрабатываются в режиме реального времени. Оптимизация струйной техники для фиксированного размера микросфер (5,6 мкм), увеличенная интенсивность цифрового сигнала позволяют детектировать минимальное количество молекул протективного антигена Bacillus anthracis в исследуемых образцах, тем самым увеличивая чувствительность предложенного способа детекции.

При постановке анализа моноклональные антитела 16F5 к III домену ПА, ковалентно иммобилизованные на полистироловых микросферах, связывают молекулы протективного антигена Bacillus anthracis, содержащиеся в образце, с твердой фазой. После чего с иммобилизованными на твердой фазе молекулами ПА связываются моноклональные антитела 17С10 к IV домену ПА, конъюгированные с биотином. После чего посредством биотин-нейтравидинового взаимодействия образовавшиеся иммунные комплексы связываются с фикоэритрином, флуоресцентный сигнал которого детектируется в режиме реального времени.

Техническим результатом изобретения является то, что изобретение позволяет выявлять протективный антиген Bacillus anthracis в концентрации до 1 пг/мл.

В предлагаемом техническом решении специфичность узнавания протективного антигена Bacillus anthracis обеспечивается за счет пары моноклональных антител, взаимодействующих с различными эпитопами молекулы протективного антигена, что позволяет избежать конкуренции антител за сайты связывания на одной молекуле ПА и повышает чувствительность метода. Одно из антител биотинилируют для последующего связывания с конъюгатом нейтравидина с фикоэритрином. Нейтравидин, являющийся производным белка авидина, характеризуется высокой специфичностью и эффективностью взаимодействия с биотином, что также повышает чувствительность метода.

Для проведения анализа на основе данного метода детекции рекомендуется использовать 96-ти луночные планшеты с фильтрующим дном MultiScreen (Millipore, Франция) с размером пор 0,45 мкм, оптимизированные для работы с микросферами. Данный формат анализа (с использованием твердой фазы) позволяет автоматизировать процессы отмывки планшета во время проведения анализа, а также учет результатов, тем самым минимизируя контакт оператора с потенциально инфицированным материалом.

К преимуществам заявленного способа определения протективного антигена возбудителя сибирской язвы относятся:

1) высокая чувствительность метода, позволяющая диагностировать сибирскую язву на ранних стадиях заболевания и своевременно начать адекватное лечение;

2) высокая специфичность определения, обеспечивающаяся за счет примененного способа иммунодетекции, и, следовательно, низкая вероятность получения ложноположительных результатов;

3) возможность анализирования большого числа исследуемых образцов за короткое время;

4) возможность экстраполяции разработанного способа детекции для диагностики любых других возбудителей инфекционных заболеваний при подборе пары специфических моноклональных антител.

Изобретение осуществляют следующим образом.

Моноклональное антитело 16F5, специфичное к III домену ПА Bacillus anthracis, иммобилизуют на карбоксилированных полистироловых микросферах (Био-Рад, США). Оставшиеся свободными сайты связывания на поверхности микросфер блокируют фосфатно-солевым буфером, рН 7,4, содержащим 0,05% твин-20, с 0,1% бычьего сывороточного альбумина (ФСБТ-БСА). Планшет дважды промывают (ФСБТ-БСА).

Проводят подготовку проб. Для этого биологические жидкости центрифугируют для освобождения от клеточного дебриса и добавляют к надосадочной жидкости 1/10 (от объема образца) раствора, содержащего 200 мМ трис-HCl, 1 М хлорида натрия и 50 мМ ЭДТА.

Подготовленные пробы добавляют к микросферам с иммобилизованным моноклональным антителом и инкубируют в течение 1 часа. После трехкратной отмывки планшета (ФСБТ-БСА) к микросферам добавляют биотинилированное антитело 17С10 к IV домену ПА и инкубируют в течение 1 часа на шейкере при комнатной температуре.

К иммобилизованному на твердой фазе иммунокомплексу «антитело-протективный антиген-биотинилированное антитело» добавляют раствор нейтравидина, конъюгированного с флуоресцентным красителем фикоэритрином, и инкубируют в течение 15 минут. Планшет трижды промывают (ФСБТ-БСА), добавляют в лунки планшета по 125 мкл свежего раствора (ФСБТ-БСА) и проводят учет результатов анализа с помощью проточного флуориметра Био-Плекс-200. Наличие протективного антигена в исследуемых пробах определяют по интенсивности сигнала флуоресценции в соответствующих лунках планшета по сравнению с контрольными лунками. В качестве отрицательного контроля используют значения сигнала флуоресценции в лунках планшета, не содержащих исследуемых образцов. В качестве положительного контроля используют значения сигнала флуоресценции в лунках планшета, содержащих протективный антиген возбудителя сибирской язвы в известной концентрации. Принципиальная схема осуществления изобретения приведена на фиг.1.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.

Фиг.1. Схема постановки эксперимента по определению протективного антигена возбудителя сибирской язвы методом иммунофлуоресценции.

Фиг.2. Иммуноблот доменов ПА с МКА 17С10 к IV домену ПА (А) и 16F5 к III домену ПА (В). М - маркеры молекулярного веса; GST - контрольный препарат тотального белка из штамма Е.coli, продуцирующего GST.

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.

Пример 1. Получение моноклональных антител 16F5 и 17С10 к протективному антигену Bacillus anthracis.

Получение препарата рекомбинантного протективного антигена. Рекомбинантный протективный антиген получают с использованием Т7 экспрессионной системы и рЕТ-основанных векторов. Амплификацию осуществляют с тотальной ДНК В.anthracis. Соответствие полученных последовательностей нативному протективному антигену подтверждают секвенированием. ПА экспрессируют в Е.coli BL21 (DE3). Очистку ПА осуществляют последовательно в 2 стадии: с помощью аффинной хроматографии на колонке, содержащей сорбент NTA, заряженный ионами Со²⁺ (Clonetch Talon Superflow), a затем методом анионообменной хроматографии на DEAE-сефарозе «Toyopeari», 650M («Toyo soda MFG, CO.», Япония). Чистоту полученного препарата оценивают с помощью электрофореза, в среднем она составляет около 90%.

Иммунизация мышей. Мышей линии BALB/c в возрасте 3-4 месяцев иммунизируют препаратом протективного антигена по следующей схеме:

0 день - подкожно 50 мкг антигена в фосфатно-солевом буфере, рН 7,4, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ);

21 день - подкожно 50 мкг антигена в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), рН 7,4, эмульгированного в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ);

51 день - внутривенно 50 мкг антигена в фосфатно-солевом буфере, рН 7,4;

58 день - внутривенно 50 мкг антигена в фосфатно-солевом буфере, рН 7,4.

Кровь у иммунных мышей отбирают из хвостовой вены на третий день после последней иммунизации согласно Animal protocol №Р02-19 стр.7.

Титры специфических антител в сыворотках крови иммунизированных животных определяют с помощью непрямого твердофазного ИФА.

Гибридизация. Проводят слияние спленоцитов мыши, титр специфических антител в сыворотке крови которой составляет не менее 1:32, с мышиной миеломной клеточной линией P3-X63-Ag8.653 в соотношении 1:10. Селекцию гибридом проводят на селективной среде, содержащей гипоксантин-аминоптерин-тимидин (ГАТ). Далее культивирование гибридом осуществляют на среде RPMI-1640, содержащей 20% фетальной телячьей сыворотки.

Скрининг гибридных клонов. Для отбора положительных гибридных клонов, продуцирующих МКА к протективному антигену Bacillus anthracis, используют непрямой твердофазный ИФА. Иммунологический планшет сенсибилизируют раствором препарата протективного антигена в фосфатно-солевом буфере из расчета 1 мкг антигена/лунку, свободные сайты связывания блокируют инертным белком (молоко 0,5% жирности). Культуральную жидкость гибридом вносят в лунки планшета в объеме 100 мкл и инкубируют на шейкере при 37° в течение 1 часа. Затем добавляют конъюгат пероксидазы хрена с кроличьими антителами к целой молекуле иммуноглобулинов мыши в разведении 1:5000 и инкубируют при тех же условиях. После каждой инкубации планшет несколько раз промывают фосфатно-солевым буфером, содержащим 0,05% твина - 20 (ФСБ-Т). После шестикратной промывки планшета в лунки вносят по 100 мкл субстрат-индикаторного раствора (10 мкл 30% H₂O₂ и 8 мг ортофенилендиамина на 10 мл фосфатно-цитратного буфера рН 5,0). Положительную реакцию оценивают по появлению желто-коричневого окрашивания раствора. Реакцию останавливают добавлением в лунки 50 мкл 4N серной кислоты. Учет результатов проводят с помощью планшетного спектрофотометра xMARK (Вio-Rad, США) при длине волны 492 нм. Положительными считают лунки, значения оптической плотности в которых составляют ≥0,900 оптических единиц (о.е.) при отрицательном контроле, равном ≤0,2 о.е.

Клонирование и реклонирование положительных гибридных клеток проводят методом лимитирующих разведений в 96-луночных планшетах на слое перитонеальных макрофагов из расчета 1×10⁴ макрофагов на лунку. Скрининг клонов проводят непрямым твердофазным ИФА, как описано выше.

Получение асцитических жидкостей. Наработку моноклональных антител производят в мышах линии BALB/c 20-ти недельного возраста, предварительно премированных пристаном (Sigma, США). Мышам вводят перитонеально по 1×10¹⁰ гибридных клеток. Появление асцитических жидкостей регистрируют на 10-15 сутки после инъекции.

Выделение моноклональных антител. МКА из асцитических жидкостей выделяют в два этапа: методом аффинной хроматографии на колонке с белком G - сефарозой (Protein G Sepharose 4 Fast Flow, GE Healthcare, Швеция) и методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-25 (Sephadex™ G-25 M, GE Healthcare, Швеция). Чистоту полученных препаратов моноклональных антител оценивают в SDS-PAGE-электрофорезе. Концентрацию моноклональных антител определяют спектрофотометрически при длине волны 280 нм (спектрофотометр Smart Spec Plus, BIO RAD, США).

Определение доменной специфичности моноклональных антител (фиг.2). Оценку специфичности моноклональных антител проводят методом иммуноблота. Фрагменты последовательностей, кодирующих домены протективного антигена, получают методом ПЦР, используя в качестве матрицы тотальную ДНК штамма Bacillus anthracis СТИ-1. Домены ПА продуцируют как химерные белки, содержащие на N-конце полипептид GST.

Пример 2. Иммобилизация моноклональных антител 16F5 к III домену ПА на карбоксилированных полистироловых частицах.

Для иммобилизации моноклональных антител на твердой фазе используют полистироловые микросферы с карбоксильными группами на поверхности (Био-Рад, США). Стоковую суспензию микросфер тщательно перемешивают на вортексе, после чего отбирают 5×10⁶ частиц (400 мкл) в пластиковую пробирку типа «эппендорф» объемом 1,5 мл. Частицы осаждают центрифугированием, промывают деионизованной водой и добавляют буфер для активации, рН 6,2. После добавления раствора сульфо НХС (N-гидроксисульфосукцинимид) (10 мкл, концентрация 50 мг/мл) и раствора ЕДЦ (1-этил-3-[3-диэтиламинопропил] карбодиимид гидрохлорид) (10 мкл, концентрация 50 мг/мл) смесь инкубируют на шейкере при комнатной температуре, завернутую в фольгу. Микросферы дважды промывают фосфатно-солевым буфером, после чего к активированным микросферам добавляют МКА 16F5 к III домену ПА в количестве 10 мкг, доводят объем суспензии до 500 мкл ФСБ и инкубируют на шейкере при комнатной температуре в течение 2 часов. После окончания инкубации несвязавшиеся моноклональные антитела удаляют центрифугированием и блокируют свободные сайты связывания ФСБ-Т с 0,1% бычьего сывороточного альбумина в течение 30 минут на шейкере. Микросферы дважды промывают ФСБ-Т, добавляют 1 мл блокирующего буфера с 0,05% азида натрия. Производят подсчет числа микросфер в суспензии с помощью камеры Горяева и доводят объем конъюгированных микросфер до 1 млн./мл блокирующим буфером. Полученный конъюгат микросфер с моноклональными антителами хранят при температуре 2-8°С в темноте.

Эффективность иммобилизации МКА 16F5 к III домену ПА на микросферах проверяют с помощью поликлональных антивидовых (антимышиных) антител, меченных фикоэритрином (Sigma, США). В микроцентрифужные пробирки переносят по 10000 конъюгированных микросфер и исходных микросфер без иммобилизованных моноклональных антител, используемых в качестве отрицательного контроля. В обе пробирки добавляют по 50 мкл раствора антимышиных антител, меченных фикоэритрином, с концентрацией 1 мкг/мл и инкубируют на шейкере при комнатной температуре в течение 30 минут. По окончании инкубации микросферы трижды промывают ФСБ-Т путем центрифугирования, после чего добавляют 125 мкл ФСБ, перемешивают на вортексе и переносят в 96-ти луночный планшет. Учет результатов производят с помощью системы Био-Плекс (Био-Рад, США). Конъюгирование считают эффективным, если сигнал флуоресценции в пробирке с микросферами, содержащими на своей поверхности МКА ≥2000 единиц интенсивности флуоресценции.

Пример 3. Подготовка проб для определения протективного антигена возбудителя сибирской язвы методом иммунофлуоресценции.

Подготовку проб биологического материала проводят следующим образом:

образцы биологических жидкостей центрифугируют при 5000×g и температуре +4°С для освобождения от клеточного дебриса, отбирают надосадочную жидкость и повторно центрифугируют ее при 10000×g в течение 15 минут. К супернатанту добавляют 1/10 стерильного раствора, содержащего 200 мМ трис-HCl, 1 М хлорида натрия и 50 мМ ЭДТА.

В случае необходимости проводят уничтожение в образцах жизнеспособных клеток и спор возбудителя сибирской язвы прогреванием при температуре +95°С в течение 1 часа.

Подготовленные образцы хранят при температуре +4°С в течение 4 часов до проведения анализа или замораживают при -70°С для длительного хранения.

Для проведения анализа образцы разводят фосфатно-солевым буфером, рН 7,4 в соотношении 1:20.

Пример 4. Конъюгация моноклональных антител 17С10 к IV домену ПА с биотином.

Для приготовления биотинилирующего реагента 1 мг водорастворимого производного биотина (biotin 3-sulfo-N-hydroxy-succinimide ester sodium salt, «Sigma», США) растворяют в 100 мкл фосфатно-солевого буфера, рН 7,4. К 2,5 мг моноклональных антител добавляют 50 мкл приготовленного биотинилирующего реагента, хорошо перемешивают и инкубируют на шейкере при комнатной температуре в течение 1 часа. Свободный биотин удаляют методом гель-фильтрации на колонке с Sephadex-25 («Amersham», Швеция), уравновешенной фосфатно-солевьм буфером. Концентрацию биотинилированных антител определяют спектрофотометрически при длине волны 280 нм (спектрофотометр SmartSpec™ Plus, Био-Рад, США). Эффективность связывания МКА с биотином оценивают в ИФА с использованием конъюгата стрептавидин-пероксидаза хрена (Sigma, США).

Пример 5. Определение протективного антигена Bacillus anthracis методом иммунофлуоресцентного анализа на основе моноклональных антител 16F5 к III домену ПА и 17С10 к IV домену ПА.

Постановку анализа осуществляют в 96-ти луночных планшетах с фильтрующим дном («MultiScreen» Millipore, Франция). Микросферы, сенсибилизированные МКА 16F5 к ПА, тщательно ресуспендируют с помощью вортекса и вносят в лунки планшета, предварительно смоченные ФСБ, из расчета 10000 микросфер/лунку в 50 мкл ФСБ с 1% бычьего сывороточного альбумина (ФСБ-БСА). Микросферы дважды промывают ФСБ-БСА с помощью вошера (Bio-Plex Pro II wash station, Био-Рад, США).

Подготовленные биологические образцы разводят фосфатно-солевым буфером, рН 7,4 в соотношении 1:20.

Отдельно в ФСБ-БСА готовят десятикратные разведения препаратов протективного антигена Bacillus anthracis, получая растворы с концентрацией 2 мкг, 0,2 мкг, 0,02 мкг, 2 нг, 0,2 нг, 0,02 нг, 2 пг, 0,2 пг в мл. Затем к 50 мкл приготовленных образцов добавляют по 50 мкл каждого из приготовленных растворов ПА, тщательно перемешивают и переносят в лунки планшета в двух повторностях. Также вносят положительный контроль. В качестве положительного контроля используют раствор рекомбинантного протективного антигена Bacillus anthracis в концентрации 10 мкг/мл. В лунку с отрицательным контролем вносят 100 мкл ФСБ-БСА. Планшет заклеивают пленкой, встряхивают на шейкере при 1100 об/мин в течение 30 секунд, после чего инкубируют при 370 об/мин при комнатной температуре в течение 1 часа.

Включают анализатор и платформу для подачи планшета проточного флуориметра Био-Плекс 200 и компьютер. Для приведения прибора в рабочее состояние (прогрева лазеров) необходимо 30 минут. По истечении 30 минут запускают программу Bio-Plex Manager и проводят процедуры Start Up (Пуск) и Calibration (Калибровка).

Создают протокол анализа, руководствуясь инструкцией к системе Био-Плекс. Для этого выбирают раздел New в меню File, где будет открыто окно нового протокола с рядом подчиненных подокон. В подокне Describe protocol вводят описание протокола. В подокне Select Analytes, используя команду Create panel, ввводят название аналита и соответствующий ему номер микросфер (ПА В. anthracis - №36), кнопкой Add переносят аналит в список Selected (Выбранные). В подокне Format Plate задают формат планшета. В подокне Enter Samples Info вводят информацию об исследуемых пробах.

Планшет 3 раза отмывают ФСБ-БСА с помощью вошера и осушают дно планшета фильтровальной бумагой. Во все лунки планшета вносят биотинилированные антитела 17С10 к ПА в концентрации 4 мкг/лунку в 100 мкл ФСБ-БСА, ресуспендируют микросферы при помощи шейкера при 1100 об/мин в течение 30 секунд и инкубируют при 370 об/мин при комнатной температуре в течение 1 часа. После трехкратной отмывки планшета во все лунки вносят по 100 мкл раствора конъюгата нейтравидин-фикоэритрин (Pierce, США) в рабочем разведении 2 мкл/мл ФСБ и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут. Планшет отмывают 3 раза ФСБ-БСА и вносят в лунки планшета по 125 мкл ФСБ-БСА. Микросферы тщательно ресуспендируют с помощью шейкера и производят измерение интенсивности флуоресценции в лунках планшета с помощью проточного флуориметра Био-Плекс 200 (Био-Рад, США). Сигнал считают положительным, если минимальное значение сигнала флуоресценции в лунках с образцами на 5 и более единиц интенсивности флуоресценции превышает отрицательный контроль, а положительный контроль составляет не менее 2000 единиц. Чувствительность определения протективного антигена при определении предложенным способом составляет 1 пг/мл (табл.1).

Способ иммунофлуоресцентного определения протективного антигена возбудителя сибирской язвы

Таблица 1 - Результаты определения протективного антигена Bacillus anthracis иммунофлуоресцентным способом с использованием проточного флуориметра Био-Плекс 200 (Био-Рад)
Концентрация ПА	Интенсивность флуоресценции	Стандартное отклонение	Коэффициент вариации, %
1 мкг/мл	5135,0	73,54	1,43
0,1 мкг/мл	984,5	38,89	3,95
0,01 мкг/мл	132,5	12,02	9,07
1 нг/мл	114,5	7,78	6,79
0,1 нг/мл	91,4	1,27	1,39
0,01 нг/мл	88,4	0,85	0,96
1 пг/мл	76,0	4,24	5,58
0,1 пг/мл	46,2	3,04	6,59
Отрицательный контроль	44,0	-	-

Источники информации, используемые при составлении заявки

1. Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов И.В., Харечко А.Т., Васильев П.Г., Садовой Н.В., Кожухов В.В. Сибирская язва: Актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики.- М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. - 448 С.

2. Бургасов П.Н., Рожков Г.И. Сибиреязвенная инфекция. - М., 1984.

3. Leppla, S.Н. (1991a) in Sourcebook of Bacterial Protein Toxins (Alouf, J.E., and Freer. J.Н.. eds) DD. 277-302. Academic Press. London

4. Shoop W.L., Xiong Y., Wiltsie J., Woods A., Guo J., Pivnichny J.V., Felcetto Т., Michael B.F., Bansal A., Cummings R.T., Cunningham B.R., Friedlander A.M., Douglas C.M., Patel S.B., Wisniewski D., Scapin G., Salowe S.P., Zailer D.M., Chapman K.T., Scolnick E.M., Schmatz D.M., Bartizal K., MacCoss M., and Hermes J.D. Anthrax lethal factor inhibition. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. - V.102, N.22. - P.7958-7963.

5. Antwerpen M.H., Zimmermann P., Bewley K., Frangoulidis D., and Meyer Н. Real-time PCR system targeting a chromosomal marker specific for Bacillus anthracis. // Mol. Cell. Probes. - 2008. - V.22. - P.313-315.

6. Boyer A.E., Gallegos-Candela M., Lins R.C., Kuklenyik Z., Woolfitt A., Moura Н., Kalb S., Quinn C.P., and Barr J.R. Quantitative mass spectrometry for bacterial protein toxins-a sensitive, specific, high-throughput tool for detection and diagnosis. // Molecules. - 2011. - V.16, N.3. - P.2391-2413.

7. Andreotti P.K, Ludwig G.V., Peruski A.Н. et at Immunoassay of infectious agents. // Biotechniques. - 2003. - Vol.35. - P.850-859.

8. Пальцев М.А. Молекулярная медицина и прогресс фундаментальных наук. // Вестник РАН. 2003, т.73, №2, с.99-109.

9. Tanaka, Т. Detection of HbA (Ic) by boronate affinity immunoassay using bacterial magnetic particles. / T.Tanaka, T.Matsunaga // Biosens Bioelectron. - 2001. - P.1089.

Способ иммунофлуоресцентного определения протективного антигена возбудителя сибирской язвы в биологических образцах, включающий адсорбцию белка протективного антигена на полистироловых микросферах при помощи специфического моноклонального антитела к III домену ПА, связывание иммобилизованного белка протективного антигена при помощи биотинилированного моноклонального антитела, специфичного к IV домену ПА, детекцию иммунокомплекса моноклональное антитело-ПА-биотинилированное антитело посредством связывания с нейтравидином, конъюгированным с фикоэритрином, используемым для флуоресцентной детекции сигнала в режиме реального времени, и регистрацию присутствия протективного антигена в исследуемых образцах по изменению уровня флуоресценции в соответствующих лунках планшета или пробирках стрипа против контрольных.