Способ микроклонального размножения ириса сибирского (i.sibirica l.)


 


Владельцы патента RU 2479992:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" (RU)

Изобретение представляет собой способ микроклонального размножения I.sibirica L. in vitro. Растения, идентичные исходным экземплярам, получают методом прямой регенерации, минуя каллусную культуру, а в качестве эксплантов используют фрагменты трубки околоцветника и цветоножки. Экспланты культивируют на питательной среде Мурасиге-Скуга, в которую вносят фитогормоны 3 мкМ НУК в сочетании с 8 мкМ БАП и добавляют 0,6% агара. Затем побеги переносят на питательную среду, дополненную 5-7,5 мкМ БАП, 0,1 мкМ НУК и 0,1 мкМ ИМК, размножают по схеме, чередуя среды с высоким (5-7,5 мкМ) и низким (1 мкМ) содержанием БАП. Затем побеги укореняют на питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей 1 мкМ НУК. Изобретение позволяет ускорить получение регенерантов данного вида ириса прямым методом, минуя каллусную культуру, и повысить их выход путем увеличения коэффициента размножения для получения растений, идентичных исходным экземплярам. 1 табл.

 

Изобретение относится к цветоводству и биотехнологии, может быть использовано для массового размножения ценных декоративных сортов и гибридов ириса сибирского, освобождения их от системных патогенов, а также в селекционной практике для создания новых улучшенных сортов.

Известен способ получения растений-регенерантов I.Sibirica, согласно которому эксплантами являются верхушечные и боковые почки, изолированные с корневищ многолетних генеративных растений во время вегетации (июнь-июль) и после ее окончания (сентябрь-октябрь). Корневища выкапывали из земли, очищали от частиц почвы и отмерших тканей, делили на участки, содержащие почки, промывали в мыльном растворе и проводили стерилизацию растительного материала. Стерильность и жизнеспособность эксплантов при введении в культуру in vitro составила 49-68%. Экспланты культивировали на безгормональной среде, после формирования первых листьев пересаживали на питательные среды мультипликации побегов. В результате из одного экспланта формировалось одно растение-регенерант (Ишмуратова М.М. Особенности культивирования in vitro растений различных экологических групп на примере видов рода Iris L. Растительные ресурсы. - 1999. - 35, №4. Москва. 1999. - С.67-74).

Недостатком данного способа (аналога) является сложность проведения стерилизации растительного материала. I.sibirica является геофитом, поэтому получение стерильного и жизнеспособного материала при введении в культуру in vitro почек вегетативного побега представляет большую трудность. Даже при условии успешной поверхностной стерилизации внутренняя инфекция проявляет себя на протяжении всех этапов микроклонального размножения этой культуры. При данном способе повреждается или уничтожается растение-донор.

Наиболее близким (прототипом) является способ получения растений-регенерантов I.sibirica на основе индукции развития почек в каллусной культуре из изолированных фрагментов трубки околоцветника. После стерилизации бутонов из них извлекали части околоцветника, которые делили на фрагменты размером 0,5×0,5 см и помещали на поверхность питательной среды Мурасиге-Скуга, дополненной 10, 20 и 30 мкМ 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) в сочетании с 5 мкМ БАП (6-бензиламинопурин). Культивирование осуществляли в условиях темноты. В первые дни культивирования наблюдали увеличения размеров эксплантов за счет растяжения клеток, а в дальнейшем сформировался зеленый плотный каллус. При пересадке каллуса на среду с уменьшенным содержанием 2,4-Д (0,2 мкМ) и культивировании его в условиях фотопериода происходила регенерация флоральных почек у I.sibirica. Индуцировать регенерацию вегетативных почек на данной среде не удалось. В связи с этим каллусную ткань с флоральными почками пересаживали на среду с повышенной концентрацией БАП - 20 мкМ. В конце пассажа на этой среде происходила регенерация вегетативных почек. Продолжительность пассажа на одной среде составляла 25-30 суток (Вечернина Н.А., Таварткиладзе O.К., Клементьева Л.А., Долганова З.В. Особенности регенерации и размножения растений рода Iris (Iridaceae) in vitro // Раст. Ресурсы, 2004. - Т.40, вып.4. - С.56-60).

Недостатками данного способа (прототипа) является длительный период получения вегетативных почек (90 суток). Получение каллусной ткани с последующей индукцией органогенеза или соматического эмбриогенеза непригодно для использования при микроразмножении сортов растений, так как при дедифференциации клеток может происходить полиплоидизация и анеуплоидизация числа хромосом, которое способствует получению неоднородного потомства.

Задачей заявляемого изобретения является создание способа микроклонального размножения I.sibirica за счет ускорения получения регенерантов данного вида ириса прямым методом, минуя каллусную культуру, и повышение их выхода путем увеличения коэффициента размножения для получения растений, идентичных исходным экземплярам.

Сущность изобретения заключается в том, что способ микроклонального размножения Ириса Сибирского (I.sibirica L.) in vitro позволяет применять метод прямой регенерации, минуя стадию каллусообразования, а в качестве эксплантов используют фрагменты трубки околоцветника и цветоножки. Причем экспланты культивируют на питательной среде, которая обеспечивает высокий процент выхода генетически стабильных регенерантов в более короткие сроки. После обеззараживания бутонов трубку околоцветника и цветоножку делят на фрагменты 3×3 мм, которые затем высаживают на питательную среду Мурасиге-Скуга (MS), содержащую 3 мкМ НУК (α-нафтилуксусную кислоту) в сочетании с 8 мкМ БАП, через 30 суток образовавшиеся вегетативные побеги из всех предложенных типов эксплантов пересаживают на питательную среду, дополненную 5-7,5 мкМ БАП, 0,1 мкМ НУК и 0,1 мкМ ИМК (3-индолилмасляную кислоту) при чередовании высоких (5-7,5 мкМ) и низких (1 мкМ) концентраций БАП, укореняют побеги на среде Мурасиге-Скуга, дополненной 1 мкМ НУК.

Способ осуществляют в два этапа.

1 этап. Цветки берут в фазе бутонизации (VII этап органогенеза), когда они плотно закрыты листочками обертки, и в условиях ламинарбокса проводят стерилизацию. Части трубки околоцветника и цветоножки делят на фрагменты размером не более 3×3 мм и помещают на питательные среды.

Питательные среды готовят по прописи Мурасиге и Скуга (MS), содержащие 30 г/л сахарозы. В них вводят фитогормоны в разных концентрациях: 3 мкМ НУК в сочетании с 8 мкМ БАП, рН среды доводят до 5,8-5,9 и добавляют 0,6% агара. Среды разливают в пластиковые контейнеры (по 30 мл) или в культуральные флаконы (по 10 мл). Автоклавируют приготовленные питательные среды в течение 20 мин при 120°С. Экспланты культивируют в условиях фотопериода 16/8 часов свет/темнота при 24-26°С.

Через 30 суток в ткани эксплантов развиваются вегетативные побеги достаточной величины для пересадки на среды размножения. В результате прямого органогенеза получают полноценные вегетативные побеги I.sibirica в количестве 10-15 штук на один эксплант.

2 этап. На этапе собственно микроклонального размножения I.sibirica L субкультивирование побегов проводят на питательной среде, содержащей 5-7,5 мкМ БАП, 0,1 ДмкМ НУК и 0,1 мкМ ИМК, по схеме чередуя среды с высоким и низким (1 мкМ БАП) содержанием цитокинина, (используются питательные среды: Мурасиге-Скуга или Гамборга и Эвелега (B5), дополненные 5-7,5 мкМ БАП, 0,1 мкМ НУК и 0,1 мкМ ИМК). Данные питательные среды позволяют получать морфологически не измененные побеги с хорошей способностью к укоренению (табл.1).

Укоренение проводят на питательной среде Мурасиге-Скута, дополненной 1 мкМ НУК. Способность к укоренению на данной среде составляет 100%. После укоренения растения переносят в контейнеры с почвой и выращивают обычным способом до получения стандартной рассады с закрытой корневой системой.

Необходимым условием клонального микроразмножения является стабильное воспроизводство исходного генотипа. Однако соблюдение этого условия вызывает ряд трудностей, т.к. биологически активные компоненты питательных сред способны вызвать генетические изменения в клетках, что приводит к генетической вариабельности полученных регенерантов. Для подтверждения идентичности регенерантов материнским растениям I.sibirica сорт Стерх, полученных в результате прямой регенерации побегов из тканей трубки околоцветника, проводят анализ с помощью ПЦР. Методом RAPD-анализа полногеномной ДНК не выявлено никаких отличий между материнскими экземплярами I.sibirica сорт Стерх и полученными от них растениями-регенерантами.

В результате использования микроклонального размножения I.sibirica от одного экспланта за 4 месяца культивирования получают около 100 штук растений-регенерантов, морфологически генетически идентичных материнским.

Таблица 1
Влияние концентрации БАП и способа культивирования на число и высоту побегов у I.sibirica сорт Стерх
БАП, мкМ Без ауксинов С ауксинами (0.1 мкМ НУК+ОДмкМ ИМК)
Без чередования Чередование сред с 1 мкМ БАП Без чередования Чередование сред с 1 мкМ БАП
ч.п. в.р., мм ч.п. в.р., мм ч.п. в.р., мм ч.п. в.р., мм
2,5 2,5±0,5 40,5±7,7 1,8±0,1 55,3±3,6 2,2±0,3 35,7±3,1 2,4±0,4 42,7±2,3
5,0 1,7±0,1 41,4±9,3 2,0±0,1 56,0±4,6 1,9±0,3 34,7±3,8 1,9±0,2 52,3±3,0
7,5 1,9±0,3 42,7±3,0 2,0±0,3 52,0±6,3 1,5±0,2 55,0±4,2 1,8±0,2 52,1±3,1
10,0 1,5±0,2 65,3±4,6 1,5±0,2 53,4±3,6 1,5±0,3 53,6±5,9 2,0±0,5 57,1±5,5
1,0 контр 1,3±0,1 58,4±5,8
Примечание:
1) ч.п. - число побегов;
2) в.р. - высота растения.

Способ микроклонального размножения ириса Сибирского (I.sibirica L.) in vitro, включающий, культивирование эксплантов на питательной среде, размножение и укоренение регенерантов, отличающийся тем, что применяют метод прямой регенерации, минуя каллусную культуру, а в качестве эксплантов используют фрагменты трубки околоцветника и цветоножки, причем экспланты культивируют в течение 30 суток на питательной среде Мурасиге-Скуга (MS), в которую вносят фитогормоны 3 мкМ НУК в сочетании с 8 мкМ БАП и добавляют 0,6% агара, затем полученные побеги переносят на питательную среду, дополненную 5-7,5 мкМ БАП, 0,1 мкМ НУК и 0,1 мкМ ИМК, размножают по схеме, чередуя среды с высоким (5-7,5 мкМ) и низким (1 мкМ) содержанием БАП, укореняют на питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей 1 мкМ НУК.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к семеноводству картофеля при подготовке оздоровленного посадочного материала. .
Изобретение относится к области биотехнологии и сельского хозяйства. .
Изобретение относится к лесному хозяйству, а именно к созданию сортового плантационного лесовыращивания на основе современных инновационных биотехнологий. .
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к штамму продуценту стефарина. .

Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности, к тем методам культивирования в условиях in vitro, где требуется укоренение полученных растений-регенерантов и адаптация их к естественным условиям выращивания (ex vitro).

Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано в селекции растений для направленного создания исходного селекционного материала клевера лугового с хозяйственно-ценными признаками методом генетической трансформации, а также в исследованиях по физиологии, фитопатологии и генетике растений.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности культивированию клеток растения женьшеня настоящего, и может быть использовано для получения ценных биологически активных соединений - гинзенозидов, которые широко используются в фармацевтической промышленности и косметологии.

Изобретение относится к биотехнологической промышленности и касается получения субстанции медицинского препарата - стефаглабрина сульфата из культуры клеток растения стефания гладкая.
Изобретение относится к адаптации растений к нестерильным условиям
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой питательную среду для укоренения побегов яблони и груши in vitro
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в процессе клонального микроразмножения яблони и груши на этапе собственно микроразмножения
Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии, семеноводству картофеля, картофелеводству
Изобретение относится к способу укоренения черенков сенполии узамбарской и может быть использовано для цветочной рассады

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ поверхностной стерилизации эксплантов и апикальных почек земляники садовой, винограда, хурмы сорта «Королек» in vitro
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой получение каллуса на питательной среде Мурасиге-Скуга, доведенной до 1 литра водой, в течение одного пассажа, где в питательную среду добавляют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту с концентрациями 4-8 мг/л, культивируют семена льна многолетнего, в питательную среду Гамборга добавляют 6-бензиламинопурин с концентрацией 1-2 мг/л и α-нафтилуксусную кислоту с концентрацией 0,1-0,5 мг/л и затем на питательную среду Гамборга пересаживают полученные каллусы для регенерации и культивируют в течение 2-4 пассажей, в жидкую питательную среду Мурасиге-Скуга с концентрацией всех компонентов 50% добавляют α-нафтилуксусную кислоту с концентрацией 0,1-0,5 мг/л и на нее пересаживают растения-регенеранты и культивируют их в течение 2-4 пассажей. Изобретение позволяет ввести в культуру клетки льна многолетнего. 3 табл.
Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности к микроклональному размножению in vitro. В способе культивируют каллусные культуры из стерильных эксплантов стеблевых сегментов, листьев, листовых черешков. Используют базовые питательные среды Мурасиге-Скуга, Вуди Плант Медиум с содержанием и соотношением регуляторов роста: 6-бензиламинопурин - 0,2-1,5 мг/л, α-нафтилуксусная кислота - 0,2-0,5 мг/л, индолилмасляная кислота - 2 мг/л. Далее проводят адаптацию при освещенности 2000 люкс и питательном режиме регенерантов в теплице с получением посадочного материала для лесных культур. Способ позволяет получать посадочный материал с высокими наследственными свойствами. 2 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения растений-регенерантов земляники in vitro, включающий в себя введение эксплантов в культуру, размножение и укоренение вновь образованных in vitro побегов, где в качестве эксплантов используют фрагменты цветоложа и цветоножки из цветов земляники, взятых в фазе бутонизации, которые промывают под проточной водой в течение 15-25 минут, стерилизуют 0,1% раствором сулемы 10 минут, затем трижды промывают стерильной дистиллированной водой, цветоложе освобождают от чашелистиков и лепестков, разрезают на фрагменты 5×5 мм и помещают срезом на питательную среду, цветоножку отделяют от цветка, отрезают фрагмент длиной 5 мм и также помещают на питательную среду. Изобретение позволяет получить увеличенное количество растений-регенерантов от одного экспланта. 1 табл., 2 ил.
Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к виноградарству. Способ включает микроразмножение пробирочных растений и высадку их на жидкую питательную среду с добавлением макроэлементов, витаминов и биопрепаратов. При этом на основе субстрата Мурасиге-Скуга исключают активированный уголь, снижают содержание солей и кислот в 2-4 раза и добавляют Гумат+7B в количестве 5-10 мл/л. Способ позволяет повысить эффективность и ускорить размножение оздоровленных от вирусной инфекции перспективных сортов винограда. 2 табл., 1 пр.
Наверх