Способ раннего прогнозирования исходов противовирусной терапии хронического вирусного гепатита "с"

Авторы патента:

Колесникова Наталья Владиславовна (RU)

C12Q1/70 - использующие вирусы или бактериофаги

Владельцы патента RU 2480526:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кубанский государственный медицинский университет "Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" (ГБОУ ВПО КубГМУ Минздравсоцразвития России) (RU)
Городин Владимир Николаевич (RU)
Авдеева Марина Геннадьевна (RU)
Колесникова Наталья Владиславовна (RU)
Котова Наталия Валерьевна (RU)
Полянский Алексей Владимирович (RU)
Зотов Сергей Викторович (RU)

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ раннего прогнозирования исходов противовирусной терапии хронического вирусного гепатита «С», включающий выявление иммунологических показателей в венозной крови больного, в том числе содержание циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) и вирусологического показателя (генотип вируса гепатита «С»), В комплексе определяют до начала противовирусной терапии количество В-лимфоцитов (CD₁₉), Т-лимфоцитов-супрессоров (CD₈), натуральных киллеров (CD₁₆), уровень иммуноглобулина A (IgA), и процент фагоцитоза (Ф%). По сумме весовых коэффициентов показателей определяют коэффициент иммунологического прогноза (КИП). При значении КИП 1,2÷3,2 определяют благоприятный прогноз исхода лечения, при значениях КИП 3,3÷3,9 возможен рецидив, а при КИП более 3,9 определяют неблагоприятный прогноз. Изобретение обеспечивает эффективный способ прогнозирования исхода противовирусной терапии до ее начала, предотвращая проведение дорогостоящего лечения и нерационального расходования денежных средств. 4 табл., 4 пр.

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к инфекционным заболеваниям, гепатологии, и может быть использовано при лечении хронического вирусного гепатита «С» (ХВГ «С»). Способ позволяет с высокой точностью прогнозировать исход противовирусной терапии до ее начала, тем самым предотвращая проведение заведомо неэффективного дорогостоящего лечения и нерационального расходования денежных средств. Кроме того, способ доступен и прост в исполнении, поскольку основывается на результатах стандартных общепринятых лабораторных методов.

Проблема противовирусной терапии больных хроническим вирусным гепатитом «С» (ХВГ «С») остро стоит в современной гепатологии в связи с тем, что остается достаточно многочисленная группа пациентов, не отвечающих на лечение или демонстрирующих рецидив заболевания после прекращения терапии.

В настоящее время фармакотерапия больных ХВГС определена стандартами, которые предусматривают использование препаратов рекомбинантных α-интерферонов в комбинации с аналогами нуклеозидов. Высокая стоимость и недостаточная эффективность противовирусной терапии обусловливает исследования в плане изыскания предикторов ее исходов.

С учетом того, что интерферонотерапия напрямую воздействует на иммунную систему больного, еще более актуален поиск иммунологических критериев как предикторов эффективности до начала противовирусной терапии, поскольку подход с позиций исходного иммунологического фона позволяет с высокой достоверностью прогнозировать эффективность лечения с учетом индивидуального уровня иммунного ответа и позволяет избежать нерационального использования денежных средств

Аналог.

Известно решение задачи выбора тактики лечения больных хроническим вирусным гепатитом В и С на основе прогнозирования эффективности противовирусного лечения путем определения анатомических, анамнестических, иммунологических, биохимических данных (С.Н.Соринсон. Вирусные гепатиты. - СПб.: ТЕЗА. 1998. С.147, 234; В.Т.Ивашкин. Комбинированное лечение хронического гепатита В // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 1998. - №5. - С.57-60).

При этом прогностически благоприятными, в плане выбора интерферонотерапии, считают следующие факторы:

- женский пол, молодой возраст, низкий вес, генотип не 1 (при хроническом вирусном гепатите С),

- продолжительность заболевания (до 2-х лет),

- повышение активности трансаминаз более чем в 2 раза,

- низкая концентрация вирусов в крови,

- отсутствие иммунодефицитного состояния,

- низкое содержание железа в сыворотке крови.

Данный способ прогнозирования позволяет оценить возможную эффективность противовирусной терапии до ее начала, однако имеет определенные недостатки, объективно снижающие его достоверность.

Недостатком данного способа является прежде всего то, что он основан на сложной субъективной интегральной оценке клинических показателей, и, в целом, не на объективном, а на субъективном подходе к больному без оценки исходного состояния его иммунной системы.

За ближайший аналог предлагаемого способа раннего прогнозирования эффективности интерферонотерапии ХВГ С выбран способ, включающий определение иммунологических показателей крови ребенка (А.С.Журкин, С.В.Соловьев. Продукция цитокинов и интерферонотерапия у больных хроническими вирусными гепатитами // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 1999. - №5. - С.27-29).

Данный способ основан на определении цитокинового статуса, поскольку установлено, что у детей с хроническим вирусным гепатитом С, достигших первичной вирусологической ремиссии, определялись исходно повышенные уровни содержания интерлейкина-4, интерлейкина-6, интерлейкина-8, фактора некроза опухоли, и также отмечено повышение этих показателей в крови у детей, ответивших на терапию.

Недостатками данного способа являются дорогостоящее оборудование и реактивы, сложность проведения исследований, малая доступность определения предложенных показателей в условиях клинической лаборатории лечебного учреждения.

Кроме того, данные критерии недостоверны в виде прогностических ввиду противоречивости, выявленной в результате их использования на практике с этой целью. Но данным литературы, не отмечено достоверных различий показателей цитокинов интерлейкина-1, интерлейкина-6, интерлейкина-10, фактора некроза опухоли у больных с позитивным и негативным ответами на интерферонотерапию. Таким образом, данный способ не обладает прогностической точностью.

Задачи.

Достоверное прогнозирование эффективности противовирусной терапии до ее начала но результатам исследования исходного иммунологического фона пациента и генотипирования вируса гепатита С.

Техническим результатом изобретения является:

- Высокая достоверность прогнозирования эффективности противовирусной терапии хронического вирусного гепатита С до ее начала.

- Предотвращение нерационального расходования денежных средств - исключение проведения заведомо неэффективной противовирусной терапии.

Сущностью изобретения является то, что в комплексе определяют до начала противовирусной терапии количество В-лимфоцитов (CD₁₉), Т-лимфоцитов-супрессоров (CD₈), натуральных киллеров (CD₁₆), содержание циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), уровень иммуноглобулина A (IgA) и процент фагоцитоза (Ф%), затем но сумме постоянных весовых коэффициентов указанных показателей определяют коэффициент иммунологического прогноза (КИП);

Способ раннего прогнозирования исходов противовирусной терапии хронического вирусного гепатита «С» по КИП апробирован более чем на 300 больных, проходивших стандартную противовирусную терапию в рамках Национального проекта «Здоровье» на базе ГБУЗ «Специализированная клиническая инфекционная больница» г.Краснодара. Доказана достоверность способа путем ретроспективного анализа 460 историй болезни. Выявлено, что достоверность составила p<0,05.

Способ осуществляют следующим образом.

До начала противовирусной терапии больному выполняют генотипирование вируса HCV (это исследование входит в Международный стандарт противовирусной терапии) и стандартное исследование иммунного статуса в клинической лаборатории, включающее определение показателей гуморального и клеточного иммунитета, функцию фагоцитоза и определение количества ЦИК. Далее проводят сравнительную опенку иммунологических показателей с учетом норм по лаборатории, выполнявшей исследование, и определяют коэффициент иммунологического прогноза (КИП) эффективности противовирусной терапии в каждом конкретном случае.

Исследуемый материал: периферическая венозная кровь. Взятие крови производят в асептических условиях из вены локтевого сгиба в стерильные силиконизированные пробирки. В одну из них предварительно вносят 0,2 мл. раствора ЭДТА, затем добавляют 5 мл венозной крови. В другую (сухую) пробирку вносят 3 мл крови.

Оценку состояния клеточного звена иммунитета производят с применением моноклональных антител к CD₃-, CD₄-, CD₈-, CD₁₆-, CD₁₉-рецепторам лимфоцитов.

Ход исследования

Гепаринизированную кровь смешивают в объемном соотношении 2:1 с 3% раствором желатина на среде 199, перемешивают и помещают на 20-25 минут в термостат при температуре +37°C. После расслаивания верхний слой осторожно переносят пастеровской пипеткой в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин на холоде. Для удаления эритроцитов осадок ресуспендируют в 1 мл в 1 мл гемолитического буфера или в 0,5 мл дистиллированной воды (время воздействия 20-30 с) с последующим разбавлением 20-кратным объемом забуференного фосфатами физиологического раствора (ЗФР). Клетки осаждают центрифугированием при 400-430 об/мин в течение 20 минут на холоде и собирают в интерфазу, содержащую лимфоциты, при помощи пастеровской пипетки. Полученную суспензию лимфоцитов трижды отмывают в ЗФР.

Выделенные лимфоциты ресуспендируют в необходимом объеме ЗФР, доводя их концентрацию до 1-2 млн/мл и вносят но 100 мл клеточных суспензий в U-образные лунки 96-луночпого планшета. Планшеты центрифугируют на холоде в течение 2 минут при 1000 об/мин, супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в 100 мкл моноклональных антител требуемого разведения на забуференном фосфатами изотоническом растворе с 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 0,02% азида натрия. Клетки инкубируют с антителами при +4°C в течение 30 минут с периодическим осторожным встряхиванием. После окончания срока инкубации клетки центрифугируют при +4°C в течение 2 минут, осадок ресуспендируют в 150-200 мкл ЗФР или среды 199, осаждают, подвергают повторной отмывке.

Полученные фиксированные пробы анализируют под микроскопом в ультрафиолетовом свете. Для оценки результатов реакции с достаточной степенью достоверности необходимо подсчитать не менее 200-300 клеток в каждой пробе.

Физиологические нормы относительного содержания лимфоцитов, принятые в лаборатории:

- CD₃ - 40-67%;

- CD₄ - 23-48%;

- CD₈ - 12-25%;

- CD₁₆ - 9-15%;

- CD₁₉ -3-13%.

Титр иммуноглобулинов классов А, М, G вычисляют математически на основе данных радиальной иммунодиффузии в агаровом геле но методу Манчини.

Ход исследования

При температуре 55-56°C смешивают агар с соответствующей антисывороткой в соотношении 3:1. Быстро выливают смесь в стеклянную чашку Петри, лежащую на горизонтальном столе. После застывания агара в нем по трафарету пробойником выбивают 33 лунки, в каждую лунку пастеровской пипеткой вносят но 5 мл испытуемой сыворотки, в средние четыре лунки добавляют в 4-кратных разведениях тест-сыворотку с известным содержанием иммуноглобулинов. После этого чашки помещают во влажную среду в строго горизонтальном положении на 24-48 часов при 4°C (для IgA и IgG - 24 часа, для IgM - 48 часов). Через 24-48 часов реакцию учитывают. При косом освещении кольцо преципитации становится видимым и измеряется линейкой. По диаметру кольца вокруг лунок с тест-сывороткой строят калибровочную кривую на полулогарифмической бумаге. При ее построении учитывают то обстоятельство, что в определенном интервале концентрации иммуноглобулинов диаметр кольца прямо пропорционален логарифму концентрации иммуноглобулинов.

После измерения диаметра кольца в испытуемых пробах но калибровочной кривой оценивают концентрацию иммуноглобулина соответствующего класса в исследуемых образцах.

Концентрацию выражают в МЕ или в мг белка на 100 мл (мг%) или г/л (система СИ).

Физиологически нормальное содержание иммуноглобулинов:

- IgA - 1,5-3,0 г/л;

- IgG - 7,7-12,0 г/л;

- IgM - 0,6-2,5 г/л.

Уровень содержания в сыворотке крови общей фракции циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) оценивают методом преципитации 3,5% раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ).

Необходимые материалы и оборудование:

- изотонический раствор натрия хлорида;

- 7% раствор ПЭГ;

- 0,1 н. раствор едкого натрия;

- центрифуга;

- спектрофотометр;

- центрифужные пробирки;

- пипетки емкостью 1 мл и 5 мл.

Реактивы.

7% раствор ПЭГ: 7 г ПЭГ растворяют 100 мл боратного буфера (рН 8,4). Боратный буфер готовят путем смешивания 55 мл 1,24% раствора борной кислоты и 45 мл 1,9% раствора буры, доводят до 200 мл дистиллированной водой. 3,5% раствор ПЭГ: 20 мл 7% раствора ПЭГ и 20 мл боратного буфера. 0,1 н. раствора едкого натрия: 4 г NaOH разводят в 1 мл дистиллированной воды.

Постановка метода

Сыворотку крови разводят изотоническим раствором хлорида натрия в соотношении 1:25 (0,1 мл + 2,5 мл). Разведенную сыворотку смешивают с 7% раствором ПЭГ в соотношении 1:1 (0,5 мл + 0,5 мл). Для проведения реакции преципитации пробирки помещают в холодильник при 4°C на 18 часов. Пробирки центрифугируют 15 минут при 1500 об/мин и удаляют надосадочную жидкость. Далее осадок растворяют в 2,5 мл 0,1 н. раствора NaOH, очень тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре не менее чем на 30 минут. Пробы замеряют на спектрофотометре, длина волны 280 нм против 0,1 н. раствора NaOH. Уровни ЦИК выражают в единицах оптической плотности. Уровни ЦИК, определенные методом преципитации 3,5% раствором ПЭК, в норме составляют 0,017-0,047 единиц оптической плотности.

Поглотительную активность нейтрофильных гранулоцитов и степень завершенности фагоцитоза исследуют с помощью реакции с живой культурой золотистого стафилококка (штамм 209).

Ход исследования

Каплю венозной крови в количестве 0,1 мл помешают на чистое обезжиренное покровное стекло. Его выдерживают во влажной камере при 37°C 45 минут, после чего образовавшийся сгусток осторожно удаляют пинцетом. Покровное стекло с прикрепленными нейтрофилами промывают в растворе Хенкса, наносят расчетную дозу суточной культуры Staf. aurens и снова помещают во влажную камеру при 37°C па 30 минут. После инкубации стекло промывают в растворе Хенкса для удаления непоглощенных частиц и высушивают. Высушенный препарат фиксируют и красят по Романовскому-Гимзе.

Учет фагоцитарной активности проводят, определяя процент нейтрофилов с фагоцитарным материалом - фагоцитарное число - и количество поглощенных частиц из расчета на один нейтрофил - фагоцитарный индекс.

В каждом препарате подсчитывают не менее 200 клеток. Физиологические нормы по лаборатории:

- процент фагоцитоза - 40-80%;

- фагоцитарное число - 2,2-6;

- фагоцитарный индекс - 1,4-2,5;

- переваривающая активность - более 50%;

- индекс переваривания - 1,3-2,0.

Дизайн исследования был построен таким образом, что 64 больных хроническим вирусным гепатитом «С», которые начали противовирусную терапию после предварительного исследования иммунологических показателей, ретроспективно (по исходам терапии) были разделены на две группы - с благоприятным и неблагоприятным результатом лечения. Далее для каждого параметра в каждой группе были введены минимальные и максимальные значения интервала нормы, затем для каждого пациента вычислен квадрат отклонения каждого показателя, т.е. квадрат отклонения в большую сторону от максимального и в меньшую от минимального значений. По каждому параметру в группах было подсчитано количество «нулевых» и «ненулевых» значений, и вычислен «весовой» коэффициент, который является отношением количества «нулевых» и «ненулевых» значений к количеству «ненулевых» значений. Поскольку «весовой» коэффициент каждого параметра находится в границах от 0 до 1, показатели нормированы, и коэффициенты имеют фиксированные величины.

Коэффициент иммунологического прогноза определяется по формуле:

КИП=W(генС)+W(CD₁₉)+W(CD₈)+W(CD₁₆)+W(ЦИК)+W(IgA)+W(Ф%),

Где W - коэффициент, равный «нулю» при отсутствии отклонений показателя от границ его нормы, а при отклонении от нормы - ниже минимального или выше максимального значения, равный:

W(CD₁₉) - 0,54; W(CD₈) - 0,8; W(CD₁₆) - 0,2; W(ЦИК) - 0,41;

W(IgA) - 0,73; W(Ф%) - 0,76.

Для весового показателя генотипа вируса гепатита С (WгенC) определены соответствующие значения:

- при генотипе вируса гепатита С «1b» WгенC=0,7;

- при генотипе вируса гепатита С «3а» WгенC=0,29;

- при генотипе вируса гепатита С «2а» или «неопределенном» WгенC=0,1.

При значении КИП 1,2÷3,2 определяют благоприятный прогноз исхода лечения, при значениях КИП 3,3÷3,9 возможен рецидив, а при КИП более 3,9 определяют неблагоприятный прогноз.

Работоспособность способа демонстрируется на клинических примерах.

Пример 1.

Больной К., история болезни №Г-2475, 34 лет, с диагнозом: Хронический вирусный гепатит «С», репликативная фаза, умеренной степени активности. До начала противовирусной терапии проведено определение генотипа вируса гепатита С (3а) и исследование иммунного статуса (результаты исследований приведены в таблице 1).

Таблица 1.
Показатель	Значение показателя у больного	Норма
CD₁₉	19	3-13%.
CD₈	22	12-25%
CD₁₆	12	9-15%;
ЦИК	0,05	0,017-0,047 ед. опт. плотн.
IgA	1,7	1,5-3,0 г/л
% фагоцитоза	50	40-80%;

Исходя из приведенных значений, W(генС)=0,29, W(CD₁₉)=0,54; W(CD₈)=0; W(CD₁₆)=0; W(ЦИК)=0,41; W(IgA)=0; W(Ф%)=0.

КИП=0,29+0,54+0+0+0,41+0+0=1,24.

КИП соответствовал благоприятному прогнозу противовирусной терапии.

Больному начата стандартная противовирусная терапия по схеме Пегинтрон + Рибавирин, через 1 мес. от начала терапии получен ранний вирусологический ответ, спустя 6 и 12 мес. ПЦР HCV отрицательна. Результат лечения положительный, проведенная противовирусная терапия эффективна.

Пример 2.

Больная С., история болезни №Г-1272, 48 лет, с диагнозом: Хронический вирусный гепатит «С», репликативная фаза, умеренной степени активности. До начала противовирусной терапии проведено определение генотипа вируса гепатита С (1в) и исследование иммунного статуса (результаты исследований приведены в таблице 2).

Таблица 2.
Показатель	Значение показателя у больной	Норма
CD₁₉	11	3-13%.
CD₈	32	12-25%
CD₁₆	24	9-15%;
ЦИК	0,025	0,017-0,047 ед. опт. плотн.
IgA	1,42	1,5-3,0 г/л
% фагоцитоза	30	40-80%;

Исходя из приведенных значений, W(генС)=0,7; W(CD₁₉)=0; W(CD₈)=0,81; W(CD₁₆)=0,2; W(ЦИК)=0; W(IgA)=0,73; W(Ф%)=0,7.

КИП=0,7+0+0,81+0,2+0+0,73+0,76=3,2.

КИП соответствовал благоприятному прогнозу противовирусной терапии. Больной начата стандартная противовирусная терапия по схеме: Пегасис + Рибавирин, через 1 мес. от начала терапии вирусологический ответ не получен, через 3 и 6 мес. ПЦР HCV отрицательная. Результат лечения в целом положительный.

Пример 3.

Больной X., история болезни №Г-2562, 41 год, с диагнозом: Хронический вирусный гепатит «С», репликативная фаза, умеренной степени активности. До начала противовирусной терапии проведено определение генотипа вируса гепатита С (3а) и исследование иммунного статуса (результаты исследований приведены в таблице 3).

Таблица 3.
Показатель	Значение у больного	Норма лаборатории
CD₁₉	28	3-13%.
CD₈	32	12-25%
CD₁₆	26	9-15%;
ЦИК	0,01	0,017-0,047 ед. опт. плотн.
IgA	1,42	1,5-3,0 г/л
% фагоцитоза	38	40-80%;

Исходя из приведенных значений, W(генС)=0,29; W(CD₁₉)=0,54; W(CD₈)=0,81; W(CD₁₆)=0,2; W(ЦИК)=0,41; W(IgA)=0,74; W(Ф%)=0,76.

КИП=0,29+0,54+0,81+0,2+0,41+0,73+0,76=3,74.

КИП соответствовал неопределенному прогнозу лечения. Больному начата стандартная противовирусная терапия но схеме: Пегинтрон + Рибавирин, через 1 и 3 мес. от начала терапии вирусологический ответ не получен, спустя 6 мес. ПЦР HCV отрицательна. Результат лечения неопределенный, поскольку ранний вирусологический ответ не получен и возможен рецидив заболевания.

Пример 4.

Больная Н., история болезни №Г-2479, 52 лет, с диагнозом: Хронический вирусный гепатит «С», репликативная фаза, умеренной степени активности. До начала противовирусной терапии проведено определение генотипа вируса гепатита С (1в) и исследование иммунного статуса (результаты исследований приведены в таблице 4).

Таблица 4.
Показатель	Значение у больного	Норма лаборатории
CD₁₉	32	3-13%.
CD₈	27	12-25%
CD₁6	20	9-15%;
ЦИК	0,100	0,017-0,047 ед. опт. плотн.
IgA	1,42	1,5-3,0 г/л
% фагоцитоза	33	40-80%;

Исходя из приведенных значений, W(генС)=0,7; W(CD₁₉)=0,54; W(CD₈)=0,81; W(CD₁₆)=0,2; W(ЦИК)=0,41; W(IgA)=0,73; W(Ф%)=0,76.

КИП=0,7+0,54+0,81+0,2+0,41+0,73+0,76=4,15.

КИП соответствовал неблагоприятному исходу противовирусной терапии. Больной начата стандартная противовирусная терапия по схеме: Пегасис + Рибавирин, через 1 и 3 мес.от начала терапии вирусологический ответ не получен, спустя 6 мес.больная снята с противовирусной терапии ввиду ее неэффективности. Результат лечения отрицательный, проведенная противовирусная терапия неэффективна.

Таким образом, определение КИП является способом достоверного раннего прогнозирования исходов противовирусной терапии хронического вирусного гепатита «С».

Способ раннего прогнозирования исходов противовирусной терапии хронического вирусного гепатита «С», включающий выявление иммунологических показателей в венозной крови больного, в том числе содержание циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) и вирусологического показателя (генотип вируса гепатита «С»), отличающийся тем, что в комплексе определяют до начала противовирусной терапии количество В-лимфоцитов (CD₁₉), T-лимфоцитов-супрессоров (CD₈), натуральных киллеров (CD₁₆), уровень иммуноглобулина A (IgA) и процент фагоцитоза (Ф%), затем по сумме весовых коэффициентов показателей определяют коэффициент иммунологического прогноза (КИП) по формуле:
КИП=W(генС)+W(CD₁₉)+W(CD₈)+W(CD₁₆)+W(ЦИК)+W(IgA)+W(Ф%),
где W - коэффициент, равный «нулю» при отсутствии отклонений показателя от границ нормы, а при отклонении от нормы - ниже минимального или выше максимального, равный:
W(CD₁₉) - 0,54; W(CD₈) - 0,8; W(CD₁₆) - 0,2; W(ЦИК) - 0,41; W(IgA) - 0,73; W(Ф%) - 0,76,
для весового показателя генотипа вируса гепатита «С» (WгенC) определены соответствующие значения:
- при генотипе вируса гепатита «С» «1b» WгенС=0,7;
- при генотипе вируса гепатита «С» «3a» WгенС=0,29;
- при генотипе вируса гепатита «С» «2а» или «неопределенном» WгенC=0,1,
и при значении КИП 1,2÷3,2 определяют благоприятный прогноз исхода лечения, при значениях КИП 3,3÷3,9 возможен рецидив, а при КИП более 3,9 определяют неблагоприятный прогноз.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. .

Способ идентификации yersinia enterocolitica // 2460802

Изобретение относится к лабораторной диагностике заболевания иерсиниозом, вызываемым Yersinia enterocolitica. .

Новая детерминанта вирулентности в пределах структурного гликопротеина е2 вируса классической лихорадки свиней // 2451746

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и ветеринарии. .

Рекомбинантный белок, несущий эпитопы вируса папилломы человека, встроенные в белок аденилатциклазу или его фрагмент, его терапевтическое применение // 2441022

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и медицины. .

Наборы и способ детектирования папилломавируса человека с помощью набора олигонуклеотидных гранул // 2410441

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к набору праймеров для амплификации гена L1 папилломавируса человека (HPV), набору для детектирования генотипа папилломавируса человека (HPV) и к способам детектирования генотипов папилломавируса человека (HPV).

Изоляты вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и способы их применения // 2407802

Способ скрининга библиотеки фагового дисплея // 2402777

Способ определения степени патогенности штамма коксаки в вируса // 2401864

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для прогнозирования возможности эпидемий. .

Разработка диагностического набора для выявления рекомбинантного белка оболочки вируса кольцевой пятнистости растений // 2398884

Способ получения стандартной положительной панели сывороток крови для контроля качества иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления специфических антител к вирусным респираторным инфекциям в биологических жидкостях организма крупного рогатого скота // 2392331

Изобретение относится к области ветеринарии, иммунологии, биотехнологии и вирусологии. .

Композиции и способы выявления // 2480732

Способ определения антител к оппортунистическим инфекциям в ликворе детей // 2488822

Изобретение относится к области биотехнологии

Способ оценки состояния гиперпролиферативных заболеваний шейки матки // 2503960

Изобретение относится к области медицины, в частности к применению молекулярных маркеров ВПЧ ВКР и их качественных и количественных характеристик для прогнозирования течения гиперпролиферативных заболеваний ШМ. Способ осуществляется поэтапно: 1) из соскобов из цервикального канала и биоптатов ШМ выделяют ДНК ВПЧ; 2) определяют генотип вируса; 3) отбирают пациенток с ВПЧ16-позитивной CIN; 4) методом ПНР в реальном времени определяют число копий ДНК вируса и степень интеграции ее в хозяйский геном (физический статус); 5) устанавливают пороговый уровень вирусной нагрузки с учетом физического статуса вируса (6,5 lg копий ДНК ВПЧ 16 на клетку); 6) классифицируют пациенток в зависимости от установленного порогового уровня вирусной нагрузки и физического статуса вируса (эписомальная или интегрированная форма); 7) выявляют пациенток с неблагоприятным прогнозом, имеющих высокую вирусную нагрузку (>6.5 lg копий ДНК на клетку) при эписомальной форме вируса или низкую нагрузку (<6.5 lg копий ДНК на клетку) при интегрированной форме вируса. Способ позволяет провести раннее прогнозирование неблагоприятного течения цервикальных интраэпителиальных неоплазий и возможного перехода их в рак ШМ. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 4 пр.

Способ генерирования заквасочной культуры, заквасочная культура и способ ферментации с ее использованием // 2531343

Представленные решения касаются способа генерирования заквасочной культуры, заквасочной культуры и способа ферментации с использованием такой заквасочной культуры. Представленный способ генерирования заквасочной культуры включает воздействие на материнский бактериальный штамм, содержащий, по меньшей мере, часть локуса CRISPR, бактериофагом для получения смеси бактерий, содержащей устойчивый к бактериофагам вариантный штамм, содержащий модифицированный локус CRISPR, содержащий, по меньшей мере, один дополнительный спейсер в указанном модифицированном локусе CRISPR; независимое воздействие на тот же материнский бактериальный штамм тем же бактериофагом для получения смеси бактерий, содержащей другой устойчивый к бактериофагам вариантный штамм, содержащий модифицированный локус CRISPR, содержащий, по меньшей мере, один дополнительный спейсер в указанном модифицированном локусе CRISPR, отличный от дополнительного спейсера в первом устойчивом к бактериофагам вариантном штамме; отбор указанных устойчивых к бактериофагам вариантных штаммов из смесей бактерий и их выделение. Представленные изобретения позволяют получать устойчивые к бактериофагам культуры и могут быть использованы в пищевой промышленности при изготовлении подвергнутых брожению продуктов. 3 н. и 26 з.п. ф-лы, 23 ил., 20 табл., 23 пр.

Способ количественной оценки литической активности бактериофагов // 2587636

Способ относится к микробиологии и может применяться для определения чувствительности микроорганизмов к бактериофагам. Способ количественной оценки литической активности бактериофагов предусматривает приготовление бактериальной суспензии суточной культуры микроорганизма, выращенной при заданных условиях и соединенной с мясо-пептонным бульоном и специфическим бактериофагом. Оценку литической активности бактериофага осуществляют по среднему значению многократных измерений оптической плотности с вычетом оптической плотности фона реакции взаимодействия компонентов. При полученном значении показателя не более 0,045±0,025 испытуемый микроорганизм оценивают как чувствительный к бактериофагу. При полученном значении показателя литической активности выше указанного микроорганизм считают устойчивым к исследуемому бактериофагу. Изобретение позволяет повысить достоверность результата. 4 табл., 2 пр.

Набор для выявления днк провируса иммунодефицита крупного рогатого скота, содержащий пару специфичных праймеров и зонд, и способ диагностики вирусного иммунодефицита крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени // 2595373

Изобретение относится к биохимии. Описан набор для выявления ДНК провируса иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV (bovine immunodeficiency virus)), содержащий пару специфичных праймеров и ДНК-зонд, методом ПЦР в режиме реального времени. Праймеры и зонд имеют следующий нуклеотидный состав (5′-3′-): pf - TAGGGTAGTGGGATCTCAGAAATC, pr - ACATCCGTAACATCTCCTACCATC, z - GAGGATGGTAGGAGATGTTACGGAT. В качестве источника флуоресценции на 5′ конце зонда применяют краситель ROX, а для тушения флуоресценции на 3′ конце BHQ2. Также описан способ диагностики BIV методом ПЦР в режиме реального времени с использованием набора по п. 1. Реакционную смесь готовят путем смешения буфера 10-кратного для ПЦР - 2.5 мкл, дНТФ (25 мМ) - 0,2 мкл, праймеров pf и pr (10 пмоль/мкл) по 1 мкл, зонда z (10 пмоль/мкл) - 0,5 мкл, Taq полимеразы (5 ед./мкл) - 0,2 мкл, MgCl2 (50 мМ) - 2 мкл, бидистиллированной воды - 7,6 мкл, а амплификацию проводят в следующем режиме: денатурация 95°С - 5 мин, циклирование: денатурация (95°С - 20 с) - отжиг (55°С - 20 с) - элонгация (72°С - 20 с), причем цикл денатурация - отжиг - элонгация повторяется 10 раз, циклирование 2 с детекцией: денатурация (95°С - 20 с) - отжиг (55°С - 20 с) - элонгация (72°С - 20 с), причем цикл денатурация - отжиг - элонгация повторяется 25 или 30 раз. Флуоресценцию измеряют по каналу Orange при температуре 55°С. Пересечение кривой флуоресценции линии threshold, установленной на уровне 30% от максимального уровня флуоресценции в последнем цикле амплификации, свидетельствует о наличии в образце провируса BIV, причем, чем меньше значение показателя «Ct», тем выше количество провируса BIV в исследуемом образце, в то время как отсутствие пересечения кривой флуоресценции линии threshold свидетельствует об отсутствии провируса BIV в образце. Изобретение может быть использовано в научных исследованиях для обнаружения генетического материала BIV в лимфоцитах крови животных методом ПЦР в режиме реального времени. 2 н.п. ф-лы, 6 ил., 3 табл., 2 пр.

Однонуклеотидный полиморфизм на хромосоме 15, который позволяет прогнозировать восприимчивость к лечению вируса гепатита с // 2606759

Изобретение относится к биохимии. Описан способ прогнозирования восприимчивости человека, инфицированного вирусом гепатита С (HCV), к терапии пэгинтерфероном альфа-2a, рибавирином и противовирусным агентом прямого действия. Обеспечивают образец от указанного человека и идентификацию нуклеотида, присутствующего в однонуклеотидном полиморфизме rs12148487. Наличие по меньшей мере одной аллели A в rs12148487 у указанного субъекта указывает на высокую вероятность быстрого вирусологического ответа в течение двух недель (RVR2), достигнутого указанным субъектом в ответ на указанное лечение, по сравнению с субъектом, который имеет две G-аллели, присутствующие в rs12148487. Изобретение позволяет оптимизировать лечение пациентов с гепатитом С. 4 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 пр.

Способ оценки вирусной обсемененности воздуха // 2619179

Изобретение касается способа оценки вирусной контаминации воздуха РНК-содержащими вирусами, возбудителями острых респираторных вирусных инфекций в помещении. Представленный способ включает отбор проб воздуха с помощью пробоотборника «Флора - 100», который размещают по определенной схеме, и идентификацию микроорганизмов, при этом дополнительно устанавливают мембранный фильтр в пробоотборник, в чашку с отобранной пробой помещают 10 мл среды для сохранения и стабилизации РНК вирусов, а идентификацию вирусов проводят путем определения содержания нуклеиновых кислот возбудителей острых респираторных вирусных инфекций человека методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени. Изобретение повышает точность оценки и может быть использовано для оценки вирусной обсемененности воздуха в помещениях предприятий и организаций различного профиля. 2 ил., 4 пр.

Способ выявления в биологическом материале днк вируса гепатита в при низкой вирусной нагрузке на основе двухэтапной пцр // 2633755

Изобретение относится к медицине и, в частности, к вирусологии и инфекционным заболеваниям. Предложен способ выявления вируса гепатита В при низкой вирусной нагрузке путем определения в биопробе ДНК вируса методом ПЦР с дальнейшим секвенированием фрагментов. Выявление проводят в плазме и/или сыворотке крови, сгустке крови, ротоглоточных смывах, сперме, тканях печени. Выявление проводится в два этапа. На первом этапе используется асимметричная ПЦР с протяженными праймерами (прямой праймер: 5'-ctgcgcaccagcaccatgcaactttttcacctctgc-3', обратный праймер: 5'-cagaccaatttatgcctacagcctccta-3'). На втором этапе используются праймеры к одному из четырех регионов генома ВГВ. Способ обеспечивает повышение специфичности и чувствительности диагностики вируса гепатита В. 4 пр., 2 ил., 2 табл.

Состав агарового покрытия для определения концентрации и состава популяции вируса мачупо - возбудителя боливийской геморрагической лихорадки с использованием метода негативных колоний // 2634868

Изобретение относится к области вирусологии. Предложен состав агарового покрытия для выявления вируса Мачупо. Первичное агаровое покрытие содержит: аминокислотный витаминный комплекс (АВК), раствор Эрла, фетальную телячью сыворотку, 5%-ный раствор бикарбоната натрия, деминерализованную воду, 2,9%-ный раствор 1-глутамина, антибиотики, бактоагар «BacteriologCal» или «Bacto™ Agar». Вторичное агаровое покрытие содержит: аминокислотный витаминный комплекс (АВК), раствор Эрла, фетальную телячью сыворотку, бикарбонат натрия, деминерализованную воду, 0,1%-ный раствор нейтрального красного, бактоагар «Bacteriologi Cal» или « Bacto™ Agar». Изобретение обеспечивает увеличение чувствительности метода выявления вируса Мачупо. 3 табл., 4 пр.