Способ прогнозирования эффективности лечения хронического миелолейкоза

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ прогнозирования эффективности лечения хронического миелолейкоза. Проводят иммуногенетическое исследование венозной крови больных хроническим миелолейкозом, получающих лечение ингибитором тирозинкиназ I поколения - гливеком. Методом полимеразной цепной реакции PCR-SSP определяют гены системы HLA II класса локуса В. При выявлении специфичностей HLA-DRB 1*15(02) или HLA-DRB1*16(02) прогнозируют благоприятный исход хронического миелолейкоза с развитием в контрольные сроки (6, 12, 18 месяцев терапии) оптимального ответа. При выявлении специфичностей DRB1* 11(05) или DRB1*14(06) прогнозируют неблагоприятный исход хронического миелолейкоза с недостижением оптимального ответа на лечение. Предлагаемым способом достигается повышение точности прогнозирования исхода хронического миелолейкоза на фоне терапии гливеком. 9 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к внутренним болезням и гематологии, и может быть использовано для прогнозирования эффективности лечения ингибитором тирозинкиназ первого поколения иматинибом мезилатом (гливеком) хронического миелолейкоза.

Из практики медицины известны способы прогнозирования эффективности лечения хронического миелолейкоза (ХМЛ).

- Sokal JE, Сох ЕВ, Baccarani М, et al: Prognostic discrimination in "good-risk" chronic granulocytic leukemia. Blood 63: 789-799, 1984, заключающийся в определении прогностического фактора течения ХМЛ.

Недостатком способа является то, что способ использует в качестве исходных параметров только клинические данные на момент диагностики заболевания: возраст в годах, размер селезенка, число тромбоцитов, количество бластных клеток. Данный метод не приемлем для анализа в процессе лечения, не учитывает цитогенетические и молекулярные ответы.

Известен также способ:

- Hasford J, Pfirmann М, Hehlmann R, et al: A new prognostic score for survival of patients with chronic myeloid leukemia treated with interferon alfa. J Natl Cancer Inst 90: 850-858, 1998, заключающийся в определении прогностического фактора ХМЛ.

Недостатком способа является то, что способ также использует только клинические данные на момент диагностики заболевания: возраст в годах, размер селезенка, число тромбоцитов, количество бластных клеток, базофиллов и эозинофиллов. Данный метод не предусматривает повторное определение фактора риска плохого прогноза в процессе лечения, не учитывает цитогенетические и молекулярные ответы на лечение гливеком.

Изобретение направлено на повышение точности прогнозирования эффективности терапии хронического миелолейкоза.

Указанный технический результат достигается тем, что проводится иммуногенетическое исследование венозной крови больных хроническим миелолейкозом, получающих лечение ингибитором тирозинкиназ I поколения - гливеком и определение генов системы HLA II класса локуса В методом полимеразной цепной реакции PCR-SSP, при выявлении специфичностей HLA-DRB1*15(02) или HLA-DRB1*16(02) прогнозируют благоприятный исход хронического миелолейкоза с развитием в контрольные сроки (6, 12, 18 месяцев терапии) оптимального ответа, а при наличии специфичностей DRB1*11(05) или DRB1*14(06) прогнозируют неблагоприятный исход хронического миелолейкоза с недостижением в данные сроки оптимального ответа на лечение

Хронический миелолейкоз (ХМЛ) представляет собой заболевание, которое характеризуется на первых этапах относительно доброкачественным течением, однако в конечном итоге неизбежно заканчивается бластным кризом. Несмотря на улучшение результатов терапии ХМЛ, связанных с внедрением ингибиторов тирозинкиназ, полный цитогенетический ответ удается получить у 70-87% больных в хронической фазе, у части больных заболевание прогрессирует до фазы акселерации и бластного криза.

Первичная и вторичная резистентность к гливеку зависит от многих причин, которые не всегда в силу сложности методов их диагностики можно применить на практике. В связи с этим поиск дополнительных прогностических критериев ответа на лечение гливеком очень важен для пересмотра терапии (перевод больных на ингибиторы тирозинкиназ II поколения, трансплантация костного мозга).

В настоящее время не вызывает сомнений, что процесс онкогенеза заключается в патологических изменениях вначале на молекулярном, а затем на клеточном уровне, а предрасположенность к злокачественным новообразованиям и опухолевая прогрессия могут модифицироваться аллельными полиморфизмами различных генов. Одной из наиболее полиморфных генетических систем человека является система HLA. Иммуногенетические маркеры ранее изучались с помощью определения антигенного профиля HLA I класса. Использование ДНК-типирования с применением ПЦР позволило идентифицировать 1353 HLA-аллелей II класса. Наиболее полиморфным является ген DRB1, который детерминирует специфичности DR1-DR18. Специфичность абсолютного большинства DRB-аллелей связана с полиморфизмом именно DRB1 гена. Расположение молекул HLA класса II, определяющих аллельную специфичность непосредственно в антигенраспознающей области, является одним из основных механизмов, лежащих в основе развития ассоциированных с HLA заболеваний.

В настоящее время иммуногенетическое исследование используется не только для определения предрасположенности к развитию патологии, но и прогнозирования течения и исходов заболеваний. С применением в иммуногенетической практике полимеразной цепной реакции значительно расширились возможности диагностики и прогнозирования заболеваний, в частности ХМЛ.

Предрасположенность к ответу на терапию ингибитором тирозинкиназ первого поколения - гливеком может быть обусловлена определенными антигенами системы HLA. Выявление ассоциаций между специфичностями HLA-DRB1 и ответом на терапию гливеком позволят прогнозировать исход хронического миелолейкоза на фоне терапии гливеком и своевременно проводить коррекцию терапии (повышение дозы препарата или смена препарата).

Таким образом, иммуногенетические исследования перспективны для прогнозирования исхода ХМЛ на фоне терапии гливеком.

Все вышесказанное дает основание для применения способа прогнозирования эффективности лечения хронического миелолейкоза.

Представленным способом апробировано 50 коренных жителей Астраханской и Волгоградской областей русской национальности, страдающих хроническим миелолейкозом и получающих лечение гливеком. Критерии включения больных в исследование: хроническая фаза хронического миелолейкоза (определялась согласно рекомендациям ВО3-2008 г.); терапия гливеком в течение 24 месяцев (без учета предлеченности и длительности заболевания до назначения гливека). Критерии исключения из исследования: пациенты в стадии акселерации и бластного криза; пациенты, имеющие в анамнезе заболевания, ассоциированные с генами HLA. В группу наблюдения были включены больные хроническим миелолейкозом, находившиеся на обследовании и лечении в гематологическом отделении, наблюдающиеся в консультативной поликлинике ГУЗ «Александро-Мариинская областная клиническая больница» г.Астрахани и в поликлинике Государственного учреждения здравоохранения «Волгоградский областной клинический онкологический диспансер №1» в период с 2008 г. по 2010 г. Контрольную группу составили 200 здоровых доноров - коренных астраханцев русской национальности.

У всех пациентов было проведено обследование для диагностики и мониторирования терапии ХМЛ (согласно рекомендациям ELN-2009):

1. Общий анализ периферической крови: на момент диагностики ХМЛ, затем каждые 15 дней до достижения и подтверждения ПГО; далее, как минимум, каждые 3 месяца или по мере необходимости.

2. Морфологическое, цитологическое исследование костного мозга при установлении диагноза, затем 1 раз в 6-12 месяцев

3. Цитогенетическое исследование костного мозга (определение транслокации t(9; 22)(q34; q11) в момент диагностики ХМЛ, затем через 3 месяца; далее каждые 6 месяцев до достижения и подтверждения ПЦО, после чего каждые 12 месяцев; всегда после неудачи лечения (первичная или вторичная резистентность) и при возникновении необъяснимой анемии, лейкопении или тромбоцитопении.

4. Молекулярно-цитогенетическое исследование костного мозга - флуоресцентная in situ гибридизация хромосом (FISH) с ДНК зондом к слитному гену BCR-ABL (при невозможности проведения стандартного цитогенетического исследования).

5. Молекулярно-генетическое исследование крови методом ПЦР в реальном времени (количественная оценка экспрессии химерного гена BCR-ABL типа р210) при установлении диагноза, затем 1 раз в 3 месяца до достижения и подтверждения БМО, затем не реже чем каждые 6 месяцев.

Типирование аллелей HLA II класса

Определение аллелей HLA-DRB1 у больных хроническим миелолейкозом проводили методом полимеразной цепной реакции (PCR-SSP) с помощью наборов реагентов «Biotest» (Германия) в иммуногенетической лаборатории ЗАО «Межрегиональный центр иммуногенетики и гистотипирующих реагентов «Гисанс» (г.Санкт-Петербург, Россия). Контрольную группу составили 94 здоровых донора - коренных жителя астраханской геногеографической зоны русской национальности. Данные популяционного контроля опубликованы в 2005 году в журнале «Иммунология» совместной группой научных сотрудников ФГУ «Научно-исследовательский институт по изучению лепры Росздрава» (г.Астрахань) и ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России» (г.Москва).

Геномную ДНК для исследования выделяли из мононуклеарных клеток стабилизированной EDTA периферической крови, свежей или свежезамороженной и сохраняемой при -20°C. Кровь в количестве 500,0 мкл центрифугировали при 13000 g в течение 1 минуты в пластиковой пробирке типа «Eppendorf». Затем эритроциты удаляли путем обработки осадка 500,0 мкл лизирующего буфера (0.32М сахарозы; 10 mМ трис-HCl (рН 7,5); 5 mМ MgCl₂; 2,1% тритона Х-100) с последующим центрифугированием при 13000 g в течение 1 минуты. Процедуру лизиса повторяли до тех пор, пока надосадочная жидкость не становилась совершенно прозрачной (до 6 раз).

После окончательного удаления надосадочной жидкости при помощи автоматического дозатора к осадку добавляли 60,0 мкл буфера (50 mM KCl; 10 mМ трис-HCl (рН 8,3); 2,5 ml MgCl₂; 0,45% NP-40; 0,45% Tween 20), содержащего 250 мкг/мл протеиназы К и ресуспендировали. Инкубировали с ферментом в течение 60 минут при t=+55°C.

Инактивацию протеиназы после инкубации проводили нагреванием пробирки на водяной бане при t=+95°C в течение 10 минут. После остывания конденсат осаждали центрифугированием при 13000 g в течение 10-15 секунд. Раствор ДНК хранили при +4°C до использования.

Типирование аллелей HLA-DRBI-гена. Определение аллелей HLA-DRBI-гена проводили с использованием набора сиквенс-специфических праймеров, позволяющих определить 13 групп аллелей: DRB1*01, 03, 04, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Амплификацию проводили в 2 этапа:

1 этап - амплификация II экзона DRBI-гена из выделенной ДНК.

Продукт амплификации первого этапа длиной 247 пар нуклеотидов после 10-кратного разведения разбавителем использовался как исследуемый материал на втором этапе типирования.

2 этап - серия амплификации со специфическими парами праймеров.

Продукт, полученный в ходе амплификации, определяли методом горизонтального электрофореза в окрашенном бромистым этидием 3,3%-ном агарозном геле в ультрафиолетовом свете (310 нм). Специфичность продукта амплификации на всех этапах исследования оценивали в соотношении со стандартным маркером длин ДНК (PUC-19).

При обработке полученных результатов были использованы методы статистического анализа. Для определения показателя достоверности результатов рассчитывался непараметрический критерий X² с поправкой Йетса. Значение X², превышавшее 3,841 (что соответствует p<0,05), рассматривалось как показатель достоверной разницы между частотами в сравниваемых группах.

Для определения силы ассоциации между геном и изучаемым заболеванием рассчитывался показатель относительного риска (RR). Величина RR, равная 1, указывает на отсутствие различий в частоте встречаемости генов HLA у больных и в контроле. RR>1 (положительная ассоциация) означает, что данная специфичность HLA чаще регистрируется в группе больных. Этиологическая фракция (или атрибутивный риск) вычислялась для RR>1. Наибольшая величина этиологической фракции указывает на первичность ассоциативной связи исследуемой патологии с конкретным геном HLA. Если RR<1 (отрицательная ассоциация), то определяется величина превентивной фракции (PF). Величина PF показывает ту часть случаев, когда заболевание не развилось, благодаря наличию ассоциированного HLA-гена.

С целью поиска ассоциативных связей продуктов генов HLA и риском развития неудачи терапии гливеком нами был проведен анализ аллельного полиморфизма у больных ХМЛ с различным видом ответа на терапию.

На первом этапе мы проанализировали ответ на терапию в срок 6 месяцев лечения гливеком (таблица 1).

Как представлено в таблице 1, статистически значимым было повышение в группе больных ХМЛ с оптимальным ответом через 6 месяцев терапии группы аллелей DRB1*17(03) по сравнению с контрольной группой - 29,6% против 10,6% (RR-3,51, EF-0,212, p<0,05). Подводя итог проведенному анализу по распределению генов HLA у больных ХМЛ через 6 месяцев терапии, можно сделать следующий вывод: маркерами благоприятного прогноза с развитием оптимального ответа на терапию гливеком через 6 месяцев терапии являются специфичности DRB1*17(03), DRB1*15(02) (таблица 2).

Как представлено в таблице 2, у больных ХМЛ, не достигших оптимального ответа через 6 месяцев терапии гливеком, имеется достоверное повышение по сравнению с контролем частоты HLA-DRB1*14(06) - 13% против 0% (RR-32,3, EF-0,126, p<0,005) и снижение HLA-DRB1*15(02) - 8,7% против 28,7% (RR-0,29, PF-0,183, p<0,025).

Далее мы сравнили частоту генов в обеих группах и провели статистический анализ (таблица 3).

Из таблицы 3 следует, что при сравнительном анализе генного профиля HLA-DRB1 у больных ХМЛ с различным ответом на терапию гливеком через 6 месяцев в группе с оптимальным ответом регистрируется достоверное снижение по сравнению с группой, не достигшей оптимального ответа терапии HLA-DRB1*11(05) - 22,2% против 47,8% (RR-0,33, PF-0,348, р<0,05), HLA-DRB1*12(05) - 0% против 8,7% (RR-0,16, p<0,025), HLA-DRB1*14(06) - 0% против 13% (RR-0,11, p<0,025).

Подводя итог проведенному анализу по распределению генов HLA у больных ХМЛ через 6 месяцев терапии можно сделать следующий вывод: недостижение оптимального ответа маркируется специфичностями DRB1*11(05), DRB1*12(05), DRB1*14(06).

Следующим этапом работы был анализ ассоциативных связей аллелей HLA-DRB1 с ответом на лечение гливеком через 12 месяцев терапии (таблица 4). Из таблицы 4 следует, что у больных ХМЛ, достигших оптимального ответа через 12 месяцев терапии гливеком, регистрируется достоверное повышение по сравнению с контрольной группой HLA-DRB1*16(02) - 23,5% против 5,3% (RR-5,42, EF-0,192, p<0,05).

Как следует из таблицы 5, у больных ХМЛ, не достигших оптимального ответа через 12 месяцев терапии гливеком, имеется достоверное повышение по сравнению с контролем частоты HLA-DRB1*14(06) - (9,1% против 0% (RR-21,69, EF-0,087, p<0,025) и снижение HLA-DRB1*15(02) - 9,1% против 28,7% (RR-0,28, PF-0,193, p<0,025).

Затем мы сравнили распределение специфичностей HLA у больных ХМЛ с различным ответом на терапию гливеком через 12 месяцев между собой (таблица 6).

Из представленной таблицы 6 следует, что отмечено достоверное снижение в группе больных ХМЛ с оптимальным ответом на лечение гливеком через 12 месяцев по сравнению с группой, не достигших этого ответа, HLA-DRB1*11(05) - 17,6% против 42,4% (RR-0,32, PF-0,289, p<0,05).

Анализируя данные, полученные при обработке распределения специфичностей HLA через 12 месяцев терапии гливеком, можно сделать следующий вывод: иммуногенетическими маркерами благоприятного прогноза ХМЛ через 12 месяцев лечения гливеком являются гены HLA-DRB1*15(02), DRB1*16(02).

Следующим этапом работы был анализ ассоциативных связей HLA с ответом на терапию гливеком через 18 месяцев терапии (таблица 7). Как видно из таблицы 7, у больных ХМЛ, достигших оптимального ответа через 18 месяцев терапии гливеком, отмечается достоверное повышение по сравнению с контрольной группой HLA-DRB1*16(02) - 23,5% против 5,3% (RR-5,42, EF-0,192, p<0,05).

У больных ХМЛ, не достигших оптимального ответа (таблица 8) через 18 месяцев терапии гливеком, имеется достоверное повышение по сравнению с контролем частоты HLA-DRB1*14(06) - 9,1% против 0% (RR-21,69, EF-0,087, p<0,025) и снижение HLA-DRB1*15(02) -12,1% против 28,7% (RR-0,37, PF-0,174, p<0,05).

Анализируя данные об особенностях распределения аллелей генов HLA у больных ХМЛ через 18 месяцев терапии гливеком, можно сделать следующий вывод: иммуногенетическими маркерами неблагоприятного прогноза ХМЛ через 18 месяцев лечения гливеком является ген HLA- DRB1*14(06). Затем мы сравнили распределение специфичностей HLA у больных ХМЛ с различным ответом на терапию гливеком через 18 месяцев между собой (таблица 9).

Как представлено в данной таблице, специфичность HLA-DRB1*14(06) регистрируется у больных с недостижением оптимального ответа в 3 раза чаще, чем у больных с оптимальным ответом (RR-0,25), специфичность HLA-DRB1*16(02) в 7,22 раза чаще у больных с оптимальным ответом. Данные созвучны с предыдущим анализом, но не достигли достоверных величин.

Анализируя данные об особенностях распределения аллелей генов HLA у больных ХМЛ через 18 месяцев терапии гливеком, можно сделать следующий вывод: иммуногенетическими маркерами благоприятного прогноза ХМЛ через 18 месяцев лечения гливеком являются гены HLA-DRB1*15(02), DRB1*16(02).

Подводя итог анализу особенностей распределения специфичностей HLA у больных ХМЛ на различных сроках лечения гливеком и с различным ответом на лечение (согласно критериям ELN-2009), можно сделать вывод: «генеральными маркерами» благоприятного исхода ХМЛ с развитием в контрольные сроки оптимального ответа от применения гливека, являются специфичности DRB1*15(02), DRB1*16(02). «Генеральными» маркерами неблагоприятного прогноза (недостижение оптимального ответа) являются специфичности DRB1*11(05), DRB1*14(06).

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример 1.

Больная С., 1969 года рождения. Диагноз: хронический миелолейкоз, хроническая фаза, впервые выявленный, риск по Sokal низкий, установлен в гематологическом отделении ГУЗ AM ОКБ г.Астрахани 10.04.2007 г.

Общий анализ крови от 09.04.2007: Эр.-3,72*10¹²/л, Hb-118 г/л, ЦП-0,9; Tr-115*10⁹/л; L-28,0*10⁹/л; миелоциты-7; метамиелоциты-8; П-6; С-54; М-7; Э-1; баз-4; СОЭ-14 мм/час. Миелограмма от 09.04.2007: бластные клетки - 2,4%, промиелоциты - 1,0%, миелоциты - 10,2%, метамиелоциты - 10,8%, палочкоядерные - 22,6%, сегментоядерные - 29,8%, эозинофилы - 0%, базофилы - 0%, лимфоциты - 4,6%, моноциты - 1,0%, плазматические клетки - 0,5%. По данным УЗИ: печень и селезенка не увеличены.

Диагноз подтвержден в лаборатории медицинской генетики Ростовского государственного медицинского университета методом СЦИ 27.04.2007: исследовано 20 метафаз. Заключение: 46ХХ, t(9; 22)(q34; q11)[20] Ph-хромосома выявлена в 100% метафаз.

В общем анализе крови от 01.08.2007 (до начала приема гливека): Эр.-4,3*10¹²/л; Hb-132 г/л; ЦП-0,9; Tr-172*10⁹/л; L-25*10⁹/л; миелоциты-2; П-4; С-42; М-4, л-46; э-1; баз-1; СОЭ-6 мм/час. Больной 01.07.2007 был назначен гливек в дозе 400 мг внутрь. Предлеченность гидреа составила 3 месяца. При динамическом наблюдении у больной через 3 месяца от момента начала приема гливека был достигнут ПГО. В общем анализе крови от 01.10.2007: Эр.-3,7*10¹²/л, Hb-120 г/л, ЦП-0,9; Tr-155*10⁹/л; L-5,2*10⁹/л; П-6; С-43; М-7; л-41; э-3; СОЭ-2 мм/час. Миелограмма от 17.12.2007 г.: бластные клетки - 0,8%, нейтрофилы - 65% (промиелоциты-5%, миелоциты - 17%, метамиелоциты-5%, палочкоядерные - 18%, сегментоядерные - 20%), эозинофилы - 3,8%, базофилы - 0%, лимфоциты - 17,2%, моноциты - 0,6%.

Согласно критериям ELN-2009 контрольные исследования проводились через 6 месяцев терапии гливеком. У больной достигнут оптимальный ответ: сохранялся ПГО, развился частичный цитогенетический ответ (в контрольном исследовании клеток костного мозга методом СЦИ 17.02.2008 г. исследовано 20 метафаз. Результат: 46ХХ, t(9; 22)(q34; q11[4] /46ХХ [16]. Заключение: Ph-хромосома обнаружена в 10% метафаз).

Через 12 месяцев лечения гливеком у больной зарегистрирован оптимальный ответ: ПГО, полный цитогенетический ответ (Ph-хромосома методом СЦИ - 0%), большой молекулярный ответ (при количественном определении экспрессии гена BCR-ABL вариант р210 методом Real-Time PCR экспрессия гена BCR-ABL - 0,097%).

Через 18 месяцев лечения гливеком у больной сохранялся оптимальный ответ: ПГО, полный цитогенетический ответ (подтвержден в контрольном цитогенетическом исследовании методом СЦИ 03.02.2009: исследовано 20 метафаз. Заключение: 46ХХ[20]. Ph-хромосома не выявлена), полный молекулярный ответ (при количественном определении экспрессии гена BCR-ABL вариант р210 методом Real-Time PCR 03.02.2009 экспрессия гена BCR-ABL не обнаружена).

Через 24 месяца лечения гливеком у больной сохранялись: полная клинико-гематологический ответ, полный цитогенетический, полный молекулярный ответ.

Таким образом, диагноз больной С: хронический миелолейкоз, хроническая фаза от 10.04.2007 г., риск по Sokal низкий; полный клинико-гематологический ответ от 01.11.2007 г.; полный цитогенетический ответ от 20.06.2008 г.; полный молекулярный ответ от 03.02.2009 г. Оптимальный ответ на терапию гливеком.

Иммуногенетическое исследование: HLA-DRB1*16(02): DRB1*13(06).

Таким образом, присутствие в генотипе больной специфичности HLA-DRB1*16(02) способствовало развитию оптимального ответа на терапию гливеком с достижением полного цитогенетического и полного молекулярного ответов.

Пример 2.

Больной М., 1976 года рождения. Диагноз: Хронический миелолейкоз, хроническая фаза, риск прогноза по Sokal - низкий, установлен в гематологическом отделении ГУЗ AM ОКБ г.Астрахани 24.10.2006 г.

В общем анализе крови от 23.10.2006: Эр. - 3,02*10¹²/л; гемоглобин-93 г/л; Tr-169*10⁹/л; L-210*10⁹/л; бласты-1; миелоциты-20; п-20; с-35; м-2; л-11; э-2; б-1; СОЭ-30 мм/час. Миелограмма от 23.10.2006: бласты - 2,0%; промиелоциты - 1,0%; миелоциты - 13,0%; палочкоядерные - 21,0%; сегментоядерные - 31%; соотношение лейко/эритро 11,26. УЗИ органов брюшной полости от 23.10.2006 г.: размеры печени - правая доля 127 мм, левая доля 57 мм, размеры селезенки 150*56 мм. Диагноз подтвержден в Ростовском государственном медицинском университете стандартным цитогенетическим исследованием от 21.11.2006. Было исследовано 20 метафаз. Заключение: 46,XY,t(9; 22)(q34; q11)[19]/46,XY [1], Ph-хромосома выявлена в 95% метафаз.

Больному 14.05.07 г. был назначен гливек в дозе 400 мг. Предлеченность гидреа составила 7 месяцев. При динамическом наблюдении у больного через 3 месяца от момента начала приема гливека был достигнут ПГО. В общем анализе крови от 20.08.07 г.: эр.-4,55*10¹²/л, Hb-148 г/л, ЦП-0,9; Tr-243*10⁹/л; L-5,0*10⁹/л; п-2; с-41; м-9; л-46; э-2; СОЭ-2 мм/час. Миелограмма от 20.08.07 г.: бластные клетки - 0,1%; нейтрофилы - 54,3%; (промиелоциты - 0,2%; миелоциты - 11,6%; метамиелоциты - 4,3%; палочкоядерные - 16,6%; сегментоядерные - 21,6%); эозинофилы - 2,0%; базофилы - 0,1%; лимфоциты - 26,0%; моноциты - 1,3%; плазматические клетки - 0,2%; соотношение лейко/эритро 5,4.

Согласно критериям ELN-2009 через 6 месяцев терапии гливеком констатирована неудача терапии. У больного сохранялся ПГО, однако был достигнут лишь минимальный цитогенетический ответ - в контрольном стандартном цитогенетическом исследовании было исследовано 20 метафаз. Заключение: 46,XY, t(9; 22) (q34; q11) 16/[46], XY[4], Ph-хромосома выявлена в 80% метафаз.

Через 12 месяцев лечения гливеком - неудача терапии. У больного сохранялся ПГО, малый цитогенетический ответ (в контрольном стандартном цитогенетическом исследовании от 17.05.2008 было исследовано 20 метафаз. Заключение: 46,XY t(9;22) (q34; q11)12/[46], XY[8], Ph-хромосома выявлена в 60% метафаз). Было проведено количественное определение экспрессии гена BCR-ABL вариант р210 методом Real-Time PCR от 17.05.08. Результат исследования: 0,8% BCR-ABL. Заключение: высокий уровень экспрессии BCR-ABL. В связи с отсутствием оптимального ответа доза гливека увеличена до 600 мг в сутки.

18 месяцев терапии - неудача терапии (Ph-хромосома выявлена в 60% метафаз), отсутствие БМО - высокий уровень экспрессии BCR-ABL-0,6%.

Через 24 месяца лечения гливеком у больного сохранялся ПГО, малый цитогенетический ответ (в контрольном стандартном цитогенетическим исследовании: исследовано 20 метафаз. Заключение: 46XY[4], t(9;22)(q34; q11)[16] Ph-хромосома выявлена в 60% метафаз); при количественном определении экспрессии гена BCR-ABL вариант p210 методом Real-Time PCR была выявлена экспрессия BCR-ABL: 0,04% BCR-ABL.

Таким образом, диагноз пациента:

Хронический миелолейкоз, хроническая фаза от 24.10.2006 г., риск прогноза по Sokal - низкий; полный клинико-гематологический ответ от 24.09.07 г.; малый цитогенетический ответ от 17.05.2008 г. Неудача терапии гливеком. Первичная резистентность к гливеку.

Иммуногенетическое исследование: HLA-DRB1*14(06):DRB1*04.

Таким образом, наличие специфичности HLA-DRB1*14(06) способствовало развитию первичной резистентности к гливеку и неудачи терапии ХМЛ.

Пример 3

Больная В., 1937 года рождения. Диагноз: Хронический миелолейкоз, хроническая фаза, впервые выявленный, риск по Sokal низкий. Диагноз установлен в гематологическом отделении ГУЗ AM ОКБ г.Астрахани 08.11.2007 г.

В общем анализе крови от 08.11.2007 г.: Эр.-4,26*10¹²/л; гемоглобин-142 г/л; Tr-221,5*10⁹/л; L-33,9*10⁹/л; миелоциты - 10; метамиелоциты - 7; п - 10; с - 60; э - 3; м - 1; л - 9; м - 1; СОЭ-3 мм/ч. В миелограмме от 09.11.2007 г.: бласты - 0,6%; промиелоциты - 2,2%; миелоциты - 15,6%; метамиелоциты - 8,0%; палочкоядерные - 23,4%; сегментоядерные - 25,4% (гранулоцитарный росток раздражен, представлен всеми формами дифференцировки с преобладанием зрелых форм.

По данным УЗИ: печень 151*92 мм, селезенка не увеличена.

Диагноз подтвержден в лаборатории медицинской генетики Ростовского государственного медицинского университета методом СЦИ от 18.12.2007: было исследовано 20 метафаз. Заключение: 46 ХХ, t(9; 22)(q34; q11)[20]. Ph-хромосома выявлена в 100% метафаз.

Больной 08.01.2008 был назначен гливек в дозе 400 мг. Предлеченность гидреа составила 2 месяца. При динамическом наблюдении у больной через 3 месяца от момента начала приема гливека была достигнута полная клинико-гематологическая ремиссия. В общем анализе крови от 11.04.2008: Эр.-3,8*10¹²/л, Hb-118 г/л, ЦП-0,9; Tr-255*10⁹/л; L-5,1*10⁹/л; П-7; С-42; М-8; л-40; э-3; СОЭ-2 мм/ч. Миелограмма от 11.04.2008 г.: бластные клетки - 0,3%, нейтрофилы - 60% (промиелоциты - 0,0%, миелоциты - 15%, метамиелоциты - 4%, палочкоядерные - 19%, сегментоядерные - 22%), эозинофилы - 2,1%, базофилы - 0%, лимфоциты - 13,1%, моноциты - 0,6%.

Через 6 месяцев терапии гливеком у больной достигнут оптимальный ответ: полный клинико-гематологический ответ, частичный цитогенетический ответ (в контрольном исследовании клеток костного мозга методом СЦИ от 02.10.2008 было исследовано 20 интерфазных ядер. Заключение: 46 XX, t (9; 22) (q34; q11) [6]/ 46 XX [14]. Результат: Ph-хромосома выявлена в 30% метафаз).

Через 12 месяцев терапии гливеком в дозе 400 мг/сут у больной сохранялся полный клинико-гематологичесий ответ. Был достигнут полный цитогенетический ответ (в контрольном исследовании клеток костного мозга методом СЦИ от 20.02.09 было исследовано 20 метафаз, результат: 46 ХХ[20], заключение: Ph-хромосома не выявлена). В контрольном количественном определении экспрессии гена BCR-ABL вариант р210 методом Real-Time PCR 20.02.2009, результат исследования: 0,21% BCR-ABL.

Через 18 месяцев терапии гливеком в дозе 400 мг/сут. у больной сохранялся полный клинико-гематологический ответ, полный цитогенетический ответ. У больной был достигнут большой молекулярный ответ - в контрольном количественном определении экспрессия гена BCR-ABL методом Real-Time PCR не обнаружена (0% BCR-ABL). Через 24 месяца терапии гливеком в дозе 400 мг/сут. У больной сохранялись полный клинико-гематологический ответ, полный цитогенетический ответ и полный молекулярный ответы.

Таким образом, диагноз пациентки на 24 месяца лечения гливеком: Хронический миелолейкоз, хроническая фаза от 08.11.2007 г. Риск по Sokal низкий. Полный клинико-гематологический ответ от 11.03.2008 г. Полный цитогенетический ответ от 20.02.09 г. Полный молекулярный ответ от 20.05.2009 г.Оптимальный ответ на терапию гливеком.

Иммуногенетическое исследование: DRB1*15(02); DRB1*09.

Таким образом, присутствие в генотипе больной специфичности HLA-DRB1*15(02) способствовало развитию оптимального ответа на терапию гливеком и указывает на благоприятный прогноз ХМЛ.

Пример 4. Больная В., 1936 года рождения.

Наблюдается в ГУЗ ВОКОД №1 г. Волгограда с 11.01.2001 года с диагнозом: хронический миелолейкоз, Ph - позитивный, хроническая фаза, высокая группа риска по J.Sokal. Обоснование диагноза:

В общем анализе крови от 12.01.2001 г.: Эг - 3,8*10¹²/л, Hb - 120 г/л, Tr - 152*10⁹/л, Le - 49*10⁹/л, миелоциты - 2%, метамиелоциты - 11%, палочкоядерные - 17%, сегментоядерные - 58%, эозинофилы - 1%, лимфоциты - 32%, моноциты - 5%, базофилы - 4%, бластные клетки - 1%, СОЭ - 26 мм/час.

Гепатоспленомегалия (селезенка +4 см, печень +2 см ниже реберной дуги). В миелограмме от 20.01.2001 г.: бластные клетки -1,8%, промиелоциты - 0,6%, миелоциты - 3,2%, метамиелоциты - 19,6%, палочкоядерные - 17%, сегментоядерные - 36,6%, эозинофилы - 6%.

В течение 70 месяцев больная получала терапию препаратами: миелосан (с 04.01.2001 г по 08.02.2003 г.), гидреа (с 16.03.2003 г.по 28.10.2006 г.). Был достигнут полный гематологический ответ, который сохраняется до настоящего времени. При цитогенетическом исследовании костного мозга от 15.10.2006 г.методом СЦИ 46, XX, t(9; 22)(q34; q11)[20] выявлена Ph-хромосома в 100% метафаз.

С 08.11.2006 г. больная начала получать гливек в стандартной дозе 400 мг в сутки.

Через 3 месяца лечения сохранялся полный гематологический ответ (оптимальный ответ по критериям ELN - 2009). В общем анализе крови от 11.02.2007 г.: Эр - 4,35*10¹²/л, Hb - 141 г/л, Tr - 178*10¹²/л; Le - 4,8*10⁹/л; палочкоядерные - 2%, сегментоядерные - 48%, эозинофилы - 1%, лимфоциты - 24%, моноциты - 1%, СОЭ - 5 мм/час.

Миелограмма от 17.02.2007 г.: бластные клетки - 0,8%, нейтрофилы - 65% (промиелоциты - 5%, миелоциты - 17%, метамиелоциты - 5%, палочкоядерные - 18%, сегментоядерные - 20%), эозинофилы - 4,8%, базофилы - 0%, лимфоциты - 17,2%, моноциты - 0,6%. При физикальном осмотре не обнаружено гепато- и спленомегалии. На фоне терапии гливеком у больной развилась негематологическая токсичность (отеки, требующие приема диуретиков). Впервые после начала терапии гливеком цитогенетическое исследование клеток костного мозга и количественное определение экспрессии гена BCR-ABL проведено через 18 месяцев: при цитогенетическом исследовании костного мозга от 15.05.2008 г. методом СЦИ исследовано 20 метафаз. Заключение: 46 XX, t(9; 22) (q 34; q 11) Ph-хромосома выявлена в 100% клеток костного мозга. Количественное определение экспрессии гена BCR-ABL от 15.05.2008 г. Заключение: высокая экспрессия гена BCR-ABL (13,5%).

Согласно критериям ELN 2009 данный ответ оценен как неудача терапии. Установлена первичная цитогенетическая резистентность от 15.05.2008 г. Неудача терапии гливеком. В связи с неэффективностью гливека в 400 мг через 18 месяцев лечения гливеком доза была увеличена до 600 мг в сутки.

Через 24 месяца лечения гливеком в дозе 600 мг/сут сохранялся полный гематологический ответ и был получен лишь минимальный цитогенетический ответ. Цитогенетическое исследование костного мозга от 10.11.2008 г. методом СЦИ, исследовано 20 метафаз. Заключение: 46 XX, t(9;22) (q 34; q 11) Ph-хромосома выявилась в 86% метафаз. Количественное определение экспрессии гена BCR-ABL от 10.11.2008 г. составляло - 1,5% (отсутствие молекулярного ответа по критериям ELN - 2009).

Через 30 месяцев терапии гливеком сохранялся полный гематологический, минимальный цитогенетический ответы и отсутствовал молекулярный ответ. Цитогенетическое исследование от 11.06.2009 г. методом СЦИ. Заключение: 46 XX, t(9; 22) (q 34; q 11) Ph-хромосома выявилась в 81% метафаз. Количественное определение экспрессии гена BCR-ABL от 11.06.2009 г. составлял - 2,8% (отсутствие молекулярного ответа по критериям ELN - 2009).

Через 36 месяцев был утрачен минимальный цитогенетический ответ, сохранялся полный гематологический ответ. Контрольное цитогенетическое исследование методом СЦИ от 10.12.2009 г. Заключение: 46 XX, t(9; 22) (q 34; q 11) обнаружена Ph-хромосома в 100% клетках костного мозга. Количественное определение гена BCR-ABL составлял 4,5%. Также сохранялась негематологическая токсичность (отеки, требующие приема мочегонных препаратов). Данный ответ расценен как вторичная резистентность к гливеку. Неудача терапии гливеком.

Заключительный диагноз (через 36 месяцев терапии гливеком): хронический миелолейкоз, Ph - позитивный, хроническая фаза от 11.01.2001 года. Высокая группа риска по J.Sokal. Полный гематологический ответ от 11.02.2007 г.

Минимальный цитогенетический ответ от 10.11.2008 г.

Первичная цитогенетическая резистентность к гливеку от 10.11.2008 г.

Потеря минимального цитогенетического ответа от 10.12.2009 г.

Вторичная резистентность к гливеку от 10.12.2009 г.

Отсутствие молекулярного ответа.

Согласно критериям ELN - 2009 данный результат является неудачей терапии.

Иммуногенетическое исследование: HLA-DRB1*04; DRB1*11(05).

Таким образом, наличие специфичности HLA-DRB1*11(05) способствовало развитию резистентности к гливеку и неудачи терапии ХМЛ.

Предлагаемым способом достигнуто повышение точности прогнозирования исхода хронического миелолейкоза на фоне терапии гливеком. Использование иммуногенетических методов в клинической практике позволит выработать индивидуальный алгоритм ведения больного ХМЛ, что будет способствовать увеличению общей и бессобытийной выживаемости.

Достоинством способа является его высокая достоверность, однократность выполнения (генный спектр HLA не изменяется на протяжении всей жизни), что указывает на возможность широкого применения в терапевтических, гематологических стационарах.

Способ прогнозирования эффективности лечения хронического миелолейкоза, включающий иммуногенетическое исследование венозной крови больных хроническим миелолейкозом, получающих лечение ингибитором тирозинкиназ I поколения - гливеком, определение генов системы HLA II класса локуса В методом полимеразной цепной реакции PCR-SSP и при выявлении специфичностей HLA-DRB1*15(02) или HLA-DRB1*16(02) прогнозируют благоприятный исход хронического миелолейкоза с развитием в контрольные сроки (6, 12, 18 месяцев терапии) оптимального ответа, а при наличии специфичностей DRB1* 11(05) или DRB1*14(06) прогнозируют неблагоприятный исход хронического миелолейкоза с недостижением в данные сроки оптимального ответа на лечение.