Способ оценки эффективности применения иммуномодулятора имунофана при экспериментальной холере
Владельцы патента RU 2481791:
Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)
Изобретение относится к экспериментальной медицине, в частности к изучению эффективности иммуномодулятора для профилактики и лечения холеры. До заражения кроликам весом 1,5-2,0 кг проводят 10 инъекций через день имунофана в дозе 0,2 мкг, разведенных в 0,3 мл новокаина. Затем животных выдерживают без пищи 24 часа. Далее проводят заражение введением в изолированную петлю тонкого кишечника вирулентного штамма холерного вибриона. Под эфирным наркозом извлекают петли тонкого кишечника, накладывают лигатуры, перевязывают одинаковые участки кишечника длиной 12 см с промежутками между ними 4-5 см. При этом в одну лигированную петлю вводят 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия для контроля, в другую опытную петлю - 109 клеток 24-часовой культуры Vibrio cholerae 5879. После этого брюшную стенку зашивают и через 18 часов животных забивают для последующего изучении и оценки эффективности применения имунофана. Оценку проводят по наличию в опытных перевязанных петлях тонкого кишечника энтеропатогенного эффекта, выраженность которого оценивают в крестах, и наличию холерогенного эффекта. Последний рассчитывают по формуле K=Vж/αп, где K - коэффициент растяжения петли, Vж - объем жидкости, Lп - длина петли. Если в опытных петлях энтеропатогенный эффект отсутствует и K<1,0, считают использование имунофана эффективным. Способ обеспечивает объективную оценку эффективности иммунофана при холере. 2 пр., 2 табл.
Предлагаемое изобретение относится к медицине, в частности к вопросу изучения эффективности применения иммуномодуляторов для профилактики и лечения особо опасных инфекций, а именно холеры.
В настоящее время существует проблема при лабораторных исследованиях особо опасных инфекций, таких как холера, точно имитировать болезнь на экспериментальных животных для определения их патогенеза и оценивать возможность применения иммунопрепаратов при этом заболевании.
Известен способ оценки эффективности применения иммуномодулятора тималина при острых гнойных хирургических заболеваниях (см. патент RU № 2147436, кл. A61K 35/26, AK 35/00, от 20.04.2000 г.), заключающийся в определении уровня лейкоцитов в крови больного, и при отсутствии его повышения относительно нормы расценивают состояние больного как вторичное иммунодефицитное и назначают тимолин, после лечения которым подсчитывают количество лейкоцитов в 1 мкл крови по определенной формуле, и если коэффициент эффективности лечения тималином (КЭ)>1,2, то лечение считают эффективным.
Однако этот известный метод не может использоваться при холере в связи с тем, что это заболевание относится к особо опасным кишечным инфекциям, поэтому требуется другой способ оценки эффективности применения иммуномодуляторов при этой инфекции.
Цель предлагаемого изобретения состоит в разработке способа, позволяющего оценить эффективность применения иммуномодулятора имунофана у инфицированных холерой экспериментальных животных по его влиянию на наличие энтеропатогенного и холерогенного эффектов в изолированной петле тонкого кишечника взрослых кроликов.
Поставленная цель достигается тем, что предвадительно перед заражением животных в изолированную петлю тонкого кишечника взрослых кроликов весом 1,5-2,0 кг вводят через день иммуномодулятор имунофан в дозе 0,2 мкг, разведенный в 0,3 мл новокаина в количестве 10 инъекций, затем животных выдерживают без пищи 24 часа, после этого под эфирным наркозом извлекают петли тонкого кишечника, накладывают лигатуры, перевязывают одинаковые участки кишечника длиной 12 см с промежутками между ними 4-5 см, при этом в одну лигированную петлю вводят 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия для контроля, в другую опытную петлю - 109 клеток 24-часовой культуры Vibrio cholerae 5879, после брюшную стенку зашивают и через 18 часов животных забивают для последующего изучения и оценки эффективности применения имунофана, которую проводят по наличию в опытных перевязанных петлях тонкого кишечника энтеропатогенного эффекта, выраженность которого оценивают в крестах, и наличию холерогенного эффекта, последний рассчитывают по формуле
где
K - коэффициент растяжения петли;
Vж - объем жидкости;
Lп - длина петли,
если в опытных петлях энтеропатогенный эффект отсутствует и K<1,0, считают использование имунофана эффективным.
Способ осуществляется следующим образом:
Взрослым кроликам весом 1,5-2 кг вводят иммуномодулятор имунофан в дозе 0,2 мкг, разведенного в 0,3 мл новокаина, через день в количестве 10 инъекций. Контрольные животные иммуномодулятор не получают. Животных после иммунотерапии и контрольных кроликов выдерживают без пищи 24 часа. Под эфирным наркозом делают разрез по средней линии живота и извлекают петли тонкого кишечника. На 60 см проксимальнее аппендикса накладывают лигатуры, перевязывая одинаковые участки кишечника длиной 12 см с промежутками между ними 4-5 см. В одну лигированную петлю вводят 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия (контрольная петля), в другую - 109 клеток 24-часовой культуры Vibriocholerae 5879, выращенной в пептонной воде и суспендированной в 1 мл пептонного раствора (опытная петля). После этого брюшную стенку зашивают. Спустя 16-18 часов животных забивают воздушной эмболией и вскрывают.
Об эффективности использования имунофана судят по наличию и выраженности энтеропатогенного и холерогенного эффектов.
Энтеропатогенный эффект оценивают по патологоанатомической картине в опытной перевязанной петле тонкого кишечник, а именно: наличию отека слизистой и подслизистой оболочек, кровоизлияний и некрозов покровного эпителия ворсин. Выраженность этого эффекта оценивают в крестах. Отсутствие подобных нарушений свидетельствует об эффективности использования иммуномодулятора имунофана.
Холерогенный эффект оценивают по коэффициенту растяжения опытной петли, рассчитываемого по формуле
где
K - коэффициент растяжения петли;
Vж - объем жидкости;
Lп - длина петли,
если K<1,0, то применение иммуномодулятора является эффективным.
Таким образом, об эффективности применения имунофана судят по отсутствию энтеропатогенного (нет отека слизистой и подслизистой оболочек, кровоизлияний и некрозов покровного эпителия ворсин) и холерогенного эффектов (K<1,0) в опытных изолированных петлях экспериментальных животных.
У животных, получавших имунофан, энтеропатогенный и холерогенный эффекты отсутствовали.
Пример 1. Влияние имунофана на энтеропатогенный эффект в тонком кишечнике взрослых кроликов, зараженных холерой.
Предварительно пяти взрослым кроликам весом 1,5-2 кг вводят иммуномодулятор имунофан в дозе 0,2 мкг, разведенного в 0,3 мл новокаина, через день в количестве 10 инъекций. Пять взрослых кроликов (контрольные животные) имунофан не получали. Животных после иммунотерапии и контрольных кроликов выдерживают без пищи 24 часа. Затем, используя модель изолированной петли тонкого кишечника взрослого кролика, проводят заражение животного по вышеописанной схеме 24-часовой культурой Vibrio cholerae 5879, выращенной в пептонной воде и суспендированной в 1 мл пептонного раствора. После этого брюшную стенку зашивают. Через 18 часов животных забивают воздушной эмболией и вскрывают.
Затем проводят оценку патологоанатомической картины в опытных перевязанных петлях тонкого кишечника животных из опытной и контрольной групп. У животных, не получавших имунофан, наблюдались ярко выраженные (+++ и ++++) отек слизистой и подслизистой оболочек, кровоизлияния и некроз покровного эпителия ворсин, что свидетельствовало о наличии энтеропатогенного эффекта. У кроликов, которым вводили иммуномодулятор имунофан, никаких патоморфологических изменений не выявлялось, то есть энтеропатогенный эффект отсутствовал.
Результаты влияния иммуномодулятора на выраженность энтеропатогенного эффекта при холере в изолированной петле тонкого кишечника взрослого кролика представлены в таблице 1.
Таким образом, отсутствие энтеропатогенного эффекта у инфицированных холерой экспериментальных животных, получавших иммунотерапию имунофаном, свидетельствует об эффективности применения этого иммуномодулятора при холере.
Пример 2. Влияние имунофана на выраженность холерогенного эффекта у взрослых кроликов, зараженных холерой.
Так же, как в примере 1, проводят иммунотерапию имунофаном у пяти взрослых кроликов. Пять кроликов (контрольные животные) имунофан не получали. Затем у опытных и контрольных животных после 24-часового голодания перевязывали петли тонкого кишечника вышеописанным способом. В одну лигированную петлю вводили 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия (контрольная петля), в другую (опытная петля) - 109 клеток 24-часовой культуры Vibriocholerae 5879, выращенной в пептонной воде и суспендированной в 1 мл пептонного раствора. Через 18 часов животных забивают воздушной эмболией и вскрывают.
О влиянии имунофана на холерогенный эффект судят по коэффициенту растяжения опытной петли (таблица 2). В группе контрольных животных в зараженной опытной петле наблюдался ярко выраженный холерогенный эффект (K>1,0), у опытных кроликов, получивших иммунотерапию, этот эффект отсутствовал (K<1).
Данные, представленные в таблице 2, свидетельствуют о том, что применение иммуномодулятора имунофана при холере является эффективным.
Использование предлагаемого изобретения позволяет оценить эффективность применения иммуномодуляторов, в частности имунофана, у экспериментальных животных, инфицированных холерой, используя для этого модель изолированной петли тонкого кишечника взрослых кроликов. Результаты, полученные при изучении эффективности иммуномодулятора имунофана с предложенного изобретения на экспериментальных животных, позволяют рекомендовать этот иммуномодулятор для профилактики и лечения холеры у людей.
| Таблица 1 | |
| Животные | Патоморфологические изменения (++++) |
| получавшие имунофан: | |
| 1 кролик (вес 1,5 кг) | не выявлены |
| 2 кролик (вес 1,7 кг) | не выявлены |
| 3 кролик (вес 2,0 кг) | не выявлены |
| 4 кролик (вес 1,95 кг) | не выявлены |
| 5 кролик (вес 1,65 кг) | не выявлены |
| Контрольные (не получавшие мунофан): | |
| 1 кролик (вес 1,58 кг) | ++++ |
| 2 кролик (вес 1,70 кг) | ++++ |
| 3 кролик (вес 2,0 кг) | +++ |
| 4 кролик (вес 1,85 кг) | ++++ |
| 5 кролик (вес 1,60 кг) | +++ |
| Таблица 2 | |||
| Животные | Объем жидкости | Длина петли | Коэффициент растяжения петли (K) |
| получавшие имунофан: | |||
| 1 кролик (вес 1,5 кг) | 1,2 | 12,0 | 0,10 |
| 2 кролик (вес 1,7 кг) | 1,0 | 11,9 | 0,08 |
| 3 кролик (вес 2,0 кг) | 1,4 | 11,8 | 0,12 |
| 4 кролик (вес 1,95 кг) | 1,2 | 12,0 | 0,10 |
| 5 кролик (вес 1,65 кг) | 1,15 | 11,5 | 0,10 |
| Контрольные (не | |||
| получавшие имунофан): | |||
| 1 кролик (вес 1,58 кг) | 10,9 | 10,0 | 1,10 |
| 2 кролик (вес 1,70 кг) | 11,6 | 10,1 | 1,15 |
| 3 кролик (вес 2,0 кг) | 12,0 | 9,8 | 1,22 |
| 4 кролик (вес 1,85 кг) | 10,6 | 10,5 | 1,00 |
| 5 кролик (вес 1,60 кг) | 11,2 | 11,3 | 1,00 |
Способ оценки эффективности применения иммуномодулятора имунофана при экспериментальной холере, включающий заражение животных в изолированную петлю тонкого кишечника взрослых кроликов вирулентным штаммом холерного вибриона, при этом до заражения холерой животным весом 1,5-2,0 кг вводят через день иммуномодулятор имунофан в дозе 0,2 мкг, разведенный в 0,3 мл новокаина, в количестве 10 инъекций, затем животных выдерживают без пищи 24 часа, после этого под эфирным наркозом извлекают петли тонкого кишечника, накладывают лигатуры, перевязывают одинаковые участки кишечника длинной 12 см с промежутками между ними 4-5 см, при этом в одну лигированную петлю вводят 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия для контроля, в другую опытную петлю - 109 клеток 24-часовой культуры Vibrio cholerae 5879, после брюшную стенку зашивают и через 18 часов животных забивают для последующего изучения и оценки эффективности применения имунофана, которую проводят по наличию в опытных перевязанных петлях тонкого кишечника энтеропатогенного эффекта, выраженность которого оценивают в крестах, и наличию холерогенного эффекта, последний рассчитывают по формуле
где K - коэффициент растяжения петли;
Vж - объем жидкости;
Lп - длина петли,
если в опытных петлях энтеропатогенный эффект отсутствует и K<1,0, считают использование имунофана эффективным.
