Способ определения концентрации селена в крови



Способ определения концентрации селена в крови
Способ определения концентрации селена в крови
Способ определения концентрации селена в крови

 


Владельцы патента RU 2482492:

Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Оренбургский государственный аграрный университет" (RU)

Настоящее изобретение относится к медицине и описывает способ определения концентрации селена в крови, включающий получение сыворотки крови, превращение Se(VI) в Se(IV), получение селено-диазолового комплекса, его экстракцию и измерение флуоресценции при длине волны возбуждения λвозб=366 нм, построение градуировочного графика, выполненного на основе измерений стандартных растворов, где к полученной 1 мл сыворотке крови добавляют 2.5 мл 0.1 N раствора НСl, в течение 30 минут смесь постепенно нагревают до 60°С пока объем не достигнет 1 мл, затем в предварительно остуженную смесь добавляют 2.5 мл 2,3-диаминонафталина (ДАН), 1 мл ЭДТА и 50 мл 0.1 N НСl, полученную смесь нагревают при температуре 80°С в течение 20 минут, затем смесь остужают до температуры 37°С и экстрагируют 10 мл раствора циклогексана, затем проводят измерения спектров флуоресценции смеси (λрег=480÷600 нм) и производят обработку спектральных кривых используя метод Гауссово-Лоренцевых кривых. Способ обеспечивает повышение точности определения селена в крови. 1 пр., 3 ил.

 

Изобретение относится к аналитической химии, а также может быть использовано в медицине для определения содержания селена в крови и контроля состояний селеновой недостаточности человека и животных.

Известен способ определения селена в крови, основанный на определении интенсивности флуоресценции его соединений (Лебедев П.А., Лебедев А.А. Модификация спектрофлуориметрического метода определения селена в крови. // Химико-фарм. журн. - 1996. - Т.30, №10, с.54-55). Способ заключается в следующем. Пробы сыворотки крови (0.5 мл) обрабатывают в пробирках смесью концентрированных азотной и соляной кислот (3 мл). Пробирки нагревают постепенно от 100°С до 180-190°С в течение 2.5 ч, пока в каждой пробирке не останется примерно 1 мл жидкости. После охлаждения добавляют в каждую пробирку 5 N HCl (0.4 мл) и вновь нагревают при 130-150°С в течение 15 мин для превращения Se (VI) в Se (IV). После охлаждения добавляют маскирующий реактив (2 мл). Он представляет собой смесь из:

1) ЭДТА (комплексон III) 7.6 г, вода 80 мл, 5 N раствор аммиака в количестве, необходимом для растворения осадка;

2) гидроксиламин солянокислый 24 г, вода 500 мл;

3) метиловый оранжевый, 0.05% водный раствор, 40 мл.

Затем добавляют 7.5N раствор аммиака (по каплям) до появления желтого окрашивания и 1N HCl (по каплям) до появления розовой окраски. Затем объем содержимого пробирок доводят до 9 мл дистиллированной водой. Селено-диазоловый комплекс получают добавлением к пробе 1 мл раствора 2,3 - диаминонафталина (ДАН) в 0.1N HCl и последующим выдерживанием на водяной бане при 50°С в течение 30 минут. После охлаждения и добавления 5 мл гептана содержимое перемешивают в миксере 30 мин для экстракции комплекса.

После отстаивания пробы в течение 30 мин отделяют органический слой и измеряют его флуоресценцию на длине волны 525 нм (λвозб=366 нм). Полученные результаты сравнивают с величиной флуоресценции селенодиазоловых комплексов, полученных на основе стандартных растворов, содержащих 50, 100, 150, 200 мкг селена на 1 л воды.

Как отмечают авторы этой работы, стандартные растворы селенистой кислоты, проходящие ту же обработку, что и пробы плазмы и сыворотки крови, не дают воспроизводимых результатов, в отличие от проб крови. Поэтому в качестве вторичного стандарта применяют нормальную лошадиную сыворотку.

Приведенный способ имеет существенные недостатки. В технологии используется маскирующий реактив, а также смесь концентрированных азотной и соляной кислот. Их многократное нагревание и охлаждение для получения четырехвалентного селена значительно усложняют технологический процесс. Сравнение величин флуоресценции селенодиазоловых комплексов с таковой для стандартных растворов может внести существенный вклад в погрешность определяемых величин. Это связано с тем, что интенсивность флуоресценции зависит от многих факторов: параметров возбуждающего излучения и регистрирующей оптической системы, температуры, влажности, давления, освещенности помещения и др. [Паркер С. Фотолюминесценция растворов. М.: Мир, 1972. 504 с.]. Поэтому даже калибровка измерительной аппаратуры не позволяет быть уверенным в точности измерений.

Задачей изобретения является повышение точности определения концентрации селена в крови с помощью специального метода обработки спектральных данных.

Технический результат достигается за счет того, что в способе определения концентрации селена в крови, включающем получение сыворотки крови, превращение Se (VI) в Se (IV), получение селенодиазолового комплекса, его экстракцию и измерение флуоресценции при длине волны возбуждения λвозб=366 нм, построение градуировочного графика, выполненного на основе измерений стандартных растворов, отсутствуют маскирующий реактив и концентрированные азотная и соляная кислоты, для определения концентрации селена измеряются спектры флуоресценции смеси (λрег=480÷600 нм), а обработку спектральных данных производят используя метод Гауссово-Лоренцевых кривых с последующим построением градуировочного графика.

На фиг.1 изображены спектры флуоресценции стандартных растворов при различных концентрациях селена (1-1.05 мМ; 2-2.1 мМ; 3-4.2 мМ). На фиг.2 продемонстрировано разложение спектров флуоресценции смеси на составляющие методом Гауссово-Лоренцевых кривых. На фиг.3 изображен градуировочный график, имеющий линейную функцию в выбранном диапазоне концентраций, учитывающий выход реакции образования СДК, погрешность температуры и концентраций, статистическую обработку спектральных данных мешающих элементов и других факторов.

Способ осуществляют следующим образом.

Кровь предварительно центрифугируют при 8000 об/мин в течение 10 минут для отделения клеточных элементов. К 1 мл полученной сыворотки добавляют 2.5 мл 0.1 N раствора HCl. В течение 30 минут смесь постепенно нагревают до 60°С для перевода селена (VI) в селен (IV), пока объем не достигнет 1 мл. Затем, в предварительно остуженную смесь, добавляют 2.5 мл ДАН, 1 мл ЭДТА и 50 мл 0.1 N HCl. Полученную смесь нагревают при температуре 80°С в течение 20 минут. Затем смесь остужают до температуры 37°С и экстрагируют 10 мл раствора циклогексана. Затем на спектрофлуориметре проводят измерения спектров флуоресценции смеси (λрег=480÷600 нм). Длина волны возбуждения составляет 366 нм, так как находится в максимуме поглощения селендиазолового комплекса (СДК).

Для построения градуировочного графика приготавливают серию стандартных растворов, для чего берут аликвоту раствора селенистой кислоты H2SeO3 с концентрацией 7.75·10-3 М, добавляют к ней 2.5 мл ДАН, 1 мл ЭДТА и 50 мл 0.1 М HCl. Аликвота раствора селенистой кислоты составляет от 5 до 30 мкл. Смесь нагревают при температуре 80°С в течение 20 минут, затем остужают до температуры 37°С и экстрагируют 10 мл раствора циклогексана. Затем измеряют спектры флуоресценции смеси в фазе циклогексана от 480 до 600 нм (фиг.1).

Обработка результатов спектральных данных. Спектры флуоресценции смеси раскладывают на составляющие методом Гауссово-Лоренцевых кривых (фиг.2), что достаточно просто с помощью современного программного обеспечения. Затем подсчитывают площадь под кривой каждого из составляющих спектра. Количество селена определяют исходя из соотношения

где S515, S560 - площадь под кривой спектров флуоресценции при максимумах 515 и 560 нм, характеризующих флуоресценцию СДК и ДАН соответственно;

0.27·10-6 - концентрация ДАН перед нагреванием при 80°С, М;

ССДК - концентрация СДК, М.

Из (1) получают выражение для концентрации селена

Истинную концентрацию селена в стандартных растворах определяют из закона разбавления растворов

- концентрация селенистой кислоты, равная 7.75·10-3 М;

- аликвота селенистой кислоты, л;

Vр-ра - объем полученного раствора, л.

После обработки спектров стандартных растворов строят градуировочный график ССДК=f(CSeист), по которому находят концентрацию селена в пробе.

Спектры имеют два четко выраженных максимума (515 и 560 нм), первый из которых (515 нм) характеризуется флуоресценцией СДК, образованный в результате реакции [Паркер С. Фотолюминесценция растворов. М.: Мир, 1972. 520 с.]. Второй (560 нм) - флуоресценцией не израсходованного ДАН. С увеличением концентрации селена наблюдается характерное увеличение интенсивности флуоресценции СДК в выбираемом диапазоне концентраций.

Разложение спектров методом Гауссово-Лоренцевых кривых позволяет разделять флуоресценцию каждого из компонентов смеси, что дает возможность наблюдать существенное различие отношения интенсивностей максимумов каждого из компонентов смеси в спектре флуоресценции от такового после разложения спектров на составляющие (фиг.2). В связи с этим целесообразно использовать разложение спектра на составляющие методом Гауссово-Лоренцевых кривых для более точной обработки экспериментальных данных.

После этого строят градуировочный график ССДК=f(CSeист). Чем больше различий между ССДК и CSeист, тем больше влияние описанных выше факторов. Концентрацию селена в крови находят по градуировочному графику (фиг.3).

Способ определения концентрации селена в крови, включающий получение сыворотки крови, превращение Se(VI) в Se(IV), получение селено-диазолового комплекса, его экстракцию и измерение флуоресценции при длине волны возбуждения λвозб=366 нм, построение градуировочного графика, выполненного на основе измерений стандартных растворов, отличающийся тем, что к полученной 1 мл сыворотке крови добавляют 2,5 мл 0,1 N раствора НС1, в течение 30 мин смесь постепенно нагревают до 60°С, пока объем не достигнет 1 мл, затем в предварительно остуженную смесь добавляют 2,5 мл 2,3-диаминонафталина (ДАН), 1 мл ЭДТА и 50 мл 0,1 N НСl, полученную смесь нагревают при температуре 80°С в течение 20 мин, затем смесь остужают до температуры 37°С и экстрагируют 10 мл раствора циклогексана, затем проводят измерения спектров флуоресценции смеси (λрег=480÷600 нм) и производят обработку спектральных кривых, используя метод Гауссово-Лоренцевых кривых.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, и найдет широкое применение для объективной диагностики эндометриоидных кист яичников (ЭКЯ). .

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии, и может быть использовано при лечении инфекционно-воспалительных заболеваний. .
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для дифференциальной диагностики острого пиелонефрита. .
Изобретение относится к медицине, в частности к неврологии, и может быть использовано для прогнозирования исхода у пациентов с травматическими внутричерепными гематомами в течение первых 10 суток нейрореанимационного периода.
Изобретение относится к медицине, а именно к неонатологии, и может быть использовано для прогнозирования манифестации внутриутробной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа, у новорожденных детей, рожденных от матерей с персистирующей герпесвирусной инфекцией во время беременности.

Изобретение относится к биологии, экологии, токсикологической и санитарной химии, а именно к способу определения н-бутилового эфира 2-[4-(5-трифторметилпиридил-2-окси)фенокси]пропионовой кислоты в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидемстанций, химико-токсикологических, ветеринарных и экологических лабораторий.
Изобретение относится к судебной медицине и может быть использовано для определения причины смерти. .

Изобретение относится к медицине и описывает способ диагностики синдрома эндогенной интоксикации, включающий забор крови, определение молекул средней массы (МСМ) в сыворотке крови путем прямой спектрометрии депротеинизированного супернатанта, полученного после осаждения белков раствором трихлоруксусной кислоты, при длинах волн ( ) 280 нм и 254 нм, где дополнительно определяют МСМ при 238 нм, рассчитывают индекс средних молекул как сумму частного от деления значения МСМ при 280 нм к аналогичному значению при 254 нм и частного от деления значения МСМ при 238 нм к аналогичному значению при 280 нм и при значении индекса средних молекул более 4,5 диагностируют эндогенную интоксикацию.
Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностическим методам, и касается способа диагностики процесса созревания клеток эритроидного ряда при беременности, осложненной обострением герпес-вирусной инфекции, в третьем триместре гестации.

Изобретение относится к области биологии и медицины. .
Изобретение относится к области медицины, а точнее к клинической химии и, в частности, к способам определения наличия экзогенных стероидов в организме
Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии, и может быть использовано для прогнозирования повышенного риска формирования у ребенка 3-7 лет хронической оториноларингологической патологии
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для определения антибактериального потенциала хитозана в отношении стафилококков путем оценки активации хитозановым полимером ферментативного разрушения клеток бактерий

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной и клинической офтальмологии, аналитической химии и может быть использовано для экспресс-диагностики проникающих и непроникающих травм роговицы при отсутствии клинических данных

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической биохимии, цитологии, патоморфологии, и может быть использовано для определения энергетической активности клеток костного мозга (ККМ)

Изобретение относится к области исследования или анализа материалов, в том числе ксенобиотиков, путем разделения образцов материалов на составные части с использованием хроматографии и масс-спектрометрии, а точнее к способам идентификации и определения в живом организме веществ, запрещенных к применению, и может быть использовано например в допинговом контроле лошадей
Изобретение относится к медицине, в частности, к экспериментальной гематологии, а именно к способу оценки развития сингенного перевивного миелобластного лейкоза у мышей линии AKR/JY

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и аллергологии, и может быть использовано для диагностики реактивного изменения специфического иммунитета у детей в условиях химической контаминации. Для этого производят отбор пробы крови у детей, проживающих в условиях химической контаминации. Затем выполняют клинико-лабораторные исследования крови на содержание вредных химических соединений. Далее у детей проводят ультразвуковое исследование селезенки для оценки ее эхоструктуры с использованием датчика частотой не менее 10 МГц. При наличии в ультразвуковом срезе селезенки гипоэхогенных однородных округлых включений размером 0,3-1,0 мм, расположенных на расстоянии 1,5-2 мм друг от друга, а также при одновременном превышении концентрации вредного химического соединения в крови по сравнению с его референтным значением диагностируют реактивные изменения специфического иммунитета у детей. Изобретение обеспечивает создание информативного, безопасного и точного способа ультразвуковой диагностики при одновременной простоте и доступности для широкого практического применения. 3 пр., 3 табл., 5 ил.
Наверх