Способ подготовки образцов биопленок микроорганизмов для исследования в сканирующем электронном микроскопе


 

G01N1/28 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание

Владельцы патента RU 2484446:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к способу подготовки образцов биопленок микроорганизмов для исследования в сканирующем электронном микроскопе. Способ включает фиксацию, промывку и обезвоживание, пропитку в камфене и высушивание при комнатной температуре. Перед фиксацией образца микроорганизмы культивировали на поверхности стерилизованной ячейки ячейковой упаковки с перфорациями по всему диаметру ячейки, погруженной в питательную среду. Образец с микроорганизмами фиксировали в течение 24 часов в смеси растворов параформальдегида и глутаральдегида на фосфатном буфере, pH 7,4, при температуре 4°С, а затем промывали в фосфатном буфере 20 минут и в дистиллированной воде 6 мин. После образец поэтапно обезвоживали в 70% 15 минут и по 10 минут в 80%, 96% и 100% этиловом спирте, пропитывали в камфене при t=60°C в течение 20 минут. Далее образцы высушивали на воздухе до полной возгонки камфена при комнатной температуре. Достигаемый при этом технический результат заключается в предотвращении деформации клеток и микрорельефа клеточной поверхности бактерий, а также пространственной структуры микропленок микроорганизмов и внеклеточного полимерного матрикса в процессе высушивания. 3 ил.

 

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и может быть использовано при проведении научно-исследовательских работ, связанных с изучением пространственной структуры биопленок микроорганизмов и ее внеклеточного полимерного матрикса.

Известны способы подготовки образцов биологических тканей к исследованию методом сканирующей электронной микроскопии путем высушивания с помощью метода перехода критической точки, методом замораживания-высушивания, высушивания в вакууме и путем высушивания на воздухе (Микроскопическая техника: Руководство / под ред. Д.С.Саркисова и Ю.Л.Перова. - М.: Медицина, 1996. - с.247-250).

Однако для осуществления данных методов необходимы специальное дорогостоящее оборудование и реактивы, в противном случае это приводит к грубой деформации структуры образца.

Известен способ подготовки образцов биологических тканей для исследования в сканирующем электронном микроскопе, включающий фиксацию, промывку и обезвоживание. После обезвоживания, не высушивая, образцы переносят в смесь дегидранта и камфена, затем последовательно пропитывают в двух порциях расплавленного камфена при температуре 51-60ºС, после пропитывания камфеном образец высушивают на воздухе (RU 2397472 С1).

Однако известный способ не позволяет исследовать структуру биопленок, образованных прокариотными организмами.

Задачей изобретения является предотвращение деформации клеток и микрорельефа клеточной поверхности бактерий, а также пространственной структуры биопленок микроорганизмов и внеклеточного полимерного матрикса в процессе высушивания для получения изображений методом сканирующей электронной микроскопии.

Указанный технический результат достигается тем, что перед фиксацией образца микроорганизмы культивировали на поверхности стерилизованной ячейки ячейковой упаковки с перфорациями по всему диаметру ячейки, погруженной в питательную среду, образец с микроорганизмами фиксировали в течение 24 часов в смеси растворов параформальдегида и глутаральдегида на фосфатном буфере, pH 7,4, при температуре 4ºС, промывали в фосфатном буфере 20 минут, в дистиллированной воде 6 мин, поэтапно обезвоживали в 70% 15 минут и по 10 минут в 80%, 96% и 100% этиловом спирте, пропитывали в камфене (С10Н16) при t=60°C в течение 20 минут, далее образцы высушивали на воздухе до полной возгонки камфена при комнатной температуре. Изобретение иллюстрируется подробным описанием, примером его практического использования и электронными сканограммами (см. фиг.1), на которых микроорганизмы расположены в виде структурированных, прикрепленных к поверхности сообществ - биопленок; а - пространственная структура биопленки микроорганизмов, увеличение ×650; б - внеклеточный полимерный матрикс биопленки микроорганизмов, увеличение ×5000; в - форма клеток и клеточной поверхности, увеличение ×8000.

Способ осуществляется следующим образом.

Для подготовки образцов биопленок микроорганизмов перед исследованием методом сканирующей электронной микроскопии микроорганизмы культивируют на поверхности ячейки диаметром 3 мм ячейковой упаковки с перфорациями (проколы сверху вниз) по всему диаметру ячейки. Ячейку погружают в суспензию микроорганизмов в питательной среде. После культивирования бактерий в условиях, соответствующих поставленной задаче, образец с микроорганизмами фиксировали в течение 24 часов в смеси растворов параформальдегида и глутаральдегида на фосфатном буфере, pH 7,4, при температуре 4°С. Затем их промывали в фосфатном буфере 20 минут (4 раза по 5 мин), в дистиллированной воде 6 минут (3 раза по 2 мин). Затем обезвоживали поэтапно в 70% 15 минут (3 раза по 5 мин) и по 10 минут в 80% (2 раза по 5 мин), 96% (2 раза по 5 мин), 100% (2 раза по 5 мин) этиловом спирте. Пропитывали в камфене (С10Н16) при t=60°C в течение 20 минут (2 раза по 10 мин). Далее образцы высушивали на воздухе до полной возгонки камфена при комнатной температуре. Затем осуществляли монтаж ячейки на держатель образца для сканирующего электронного микроскопа.

Подготовленные образцы исследуют в сканирующем электронном микроскопе.

Практическое использование способа иллюстрируется следующим примером. Для исследования взяли стерилизованные ячейки ячейковой упаковки, перфорировали по всему диаметру ячейки и погрузили в суспензию микроорганизмов в питательной среде (питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ-агар)). После культивирования бактерий в условиях, соответствующих поставленной задаче, образец с микроорганизмами фиксировали в течение 24 часов в смеси растворов параформальдегида и глутаральдегида на фосфатном буфере, pH 7,4, при температуре 4°С. Затем их промывали в фосфатном буфере 4 раза по 5 мин, в дистиллированной воде 3 раза по 2 мин. Затем поэтапно обезвоживали в 70% - 3 раза по 5 мин, в 80% - 2 раза по 5 мин, 96% - 2 раза по 5 мин, 100% - 2 раза по 5 мин этиловом спирте. Пропитывали в камфене (С10Н16) при t=60°C - 2 раза по 10 мин. Далее образцы высушивали на воздухе до полной возгонки камфена при комнатной температуре. После чего осуществляли монтаж ячейки на держатель образца для сканирующего электронного микроскопа.

После напыления серебром в ионном напылителе IB-6 препараты исследовали при помощи сканирующего электронного микроскопа JSM-840 (Япония). В подготовленном образце сохранены: форма клеток, микрорельеф клеточной поверхности, пространственная структура сформировавшейся биопленки и внеклеточного полимерного матрикса (Фиг.1 а, б, в).

Предложенный способ используется в ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. академика Г.А.Илизарова» Минздравсоцразвития России в научно-клинической лаборатории микробиологии и иммунологии. Способ позволил получить изображения как отдельных клеток в процессе развития биопленки, так и пространственной структуры биопленки микроорганизмов без деформации размеров, формы клеток, клеточной поверхности и нарушения связей между клетками.

Способ подготовки образцов биопленок микроорганизмов для исследования в сканирующем электронном микроскопе, включающий фиксацию, промывку и обезвоживание, пропитку в камфене, высушивание при комнатной температуре, отличающийся тем, что перед фиксацией образца микроорганизмы культивируют на поверхности стерилизованной ячейки ячейковой упаковки, с перфорациями по всему диаметру ячейки, погруженной в питательную среду, образец с микроорганизмами фиксируют в течение 24 ч в смеси растворов параформальдегида и глутаральдегида на фосфатном буфере, pH 7,4, при температуре 4°С, промывают в фосфатном буфере 20 мин, в дистиллированной воде 6 мин, поэтапно обезвоживают в 70% 15 мин и по 10 мин в 80%, 96% и 100%-ном этиловом спирте, пропитывают в камфене при t=60°C в течение 20 мин, далее образцы высушивают на воздухе до полной возгонки камфена при комнатной температуре.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии и неонатологии, касается прогнозирования тяжести течения бронхолегочной патологии у новорожденных детей, находящихся на искусственной вентиляции легких, а также диагностики гастроэзофагеального рефлюкса посредством выявления пепсина в трахеобронхиальном аспирате с определением степени его активности.
Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике, пульмонологии и педиатрии. .

Изобретение относится к биологии, экологии, токсикологической и санитарной химии, а именно к способу определения н-бутилового эфира 2-[4-(5-трифторметилпиридил-2-окси)фенокси]пропионовой кислоты в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидемстанций, химико-токсикологических, ветеринарных и экологических лабораторий.

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии и гистологической лабораторной диагностике. .
Изобретение относится к медицине, в частности к ранней диагностике развития различных форм клещевого энцефалита. .
Изобретение относится к области биохимии. .
Изобретение относится к инфекционным болезням и предназначено для быстрой оценки степени активности хронического гепатита у больных хроническим гепатитом С. .

Изобретение относится к области биофармакологии, биотехнологии, медицины и косметологии и может быть использовано в лечебно-профилактических учреждениях косметологического профиля.

Изобретение относится к микробиологии и клинической лабораторной диагностике. .

Изобретение относится к биологии, а именно к палеогенетике, и может быть использовано в судебно-медицинской практике при проведении идентификации костных останков, а также в археологии при проведении радиоуглеродного датирования костного материала.

Изобретение относится к сигнализатору паров кислоты, который может быть использован для измерения концентрации паров кислоты и сигнализации о содержании в рабочей зоне при химической обработке (травлении) металлоизделий при повышенных температурах раствора.

Изобретение относится к сигнализатору паров кислоты, который может быть использован для измерения концентрации паров кислоты и сигнализации о содержании в рабочей зоне при химической обработке (травлении) металлоизделий при повышенных температурах раствора.

Изобретение относится к устройствам для дисперсного анализа и одновременного измерения объемной активности аэрозольной и газовой фракций радиоактивных аэродисперсных систем, содержащих радиоактивный рутений, оно может быть использовано в промышленности и для санитарно-гигиенической оценки воздушной среды, а также для оценки эффективности работы пылеулавливающего оборудования и средств индивидуальной защиты (СИЗ) органов дыхания.

Изобретение относится к изокинетическому зонду, в частности, для анализа загрязнения газов, вырабатываемых авиационным двигателем. .

Изобретение относится к зонду для размещения датчика или пробоотборника для металлических расплавов. .

Изобретение относится к области специальной техники, связанной с обеспечением безопасности при проведении работ по отбору высокотоксичных экологически опасных продуктов из герметичной камеры.

Изобретение относится к устройству для послойного отбора проб снега для выявления загрязнения снежного покрова, связанного с морозным конденсированием техногенных эмиссий при их осаждении из приземного слоя воздуха при образовании инея и изморози, а также изучения послойной динамики изменчивости геохимических параметров снега, связанной с сублимационным метаморфизмом снежной толщи при формировании снежного покрова.

Изобретение относится к экстракционно-вольтамперометрическому способу определения цинка, кадмия, свинца и меди, позволяющего осуществлять поэлементный мониторинг природных вод и водных экосистем.

Изобретение относится к способу рентгенофлуоресцентного определения микроэлементов и может быть использовано при анализе природных вод и техногенных растворов
Наверх