Лиофилизированный препарат, содержащий гриппозную вакцину, и способ его получения

Группа изобретений относится к медицине и касается лиофилизированного препарата, содержащего гриппозную вакцину, полученного лиофилизацией водного раствора, содержащего (i) гриппозную вакцину, (ii) гидрофобную аминокислоту и (iii) аргинин и его кислотно-аддитивную соль; касается также способа получения лиофилизированного препарата, содержащего гриппозную вакцину, которую подвергают процессу обессоливания. Группа изобретений обеспечивает предоставление лиофилизированного препарата, в котором гриппозная вакцина проявляет повышенную устойчивость. 2 н. и 13 з.п. ф-лы, 3 табл.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к лиофилизированным препаратам, содержащим гриппозную вакцину. Конкретнее, настоящее изобретение относится к лиофилизированному препарату, в котором гриппозная вакцина проявляет повышенную устойчивость. Настоящее изобретение также относится к способу получения лиофилизированного препарата.

Предшествующий уровень техники

Грипп представляет собой заболевание, вызываемое вирусами гриппа, инфицирующими дыхательные органы. В целом, у индивидуума, инфицированного вирусом гриппа, вирус после латентного периода примерно от 1 до 2 дней вызывает лихорадку до 38ºС или выше, которая сопровождается общими симптомами, такими как головная боль, общее недомогание и суставные и мышечные боли. За ними следуют респираторные симптомы, такие как кашель и мокрота, но состояние обычно улучшается в пределах недели. Однако когда гриппозная инфекция поражает таких индивидуумов, как пожилые люди, маленькие дети, беременные женщины, пациенты с хроническими заболеваниями органов дыхания или сердечно-сосудистой системы, сахарным диабетом или пациентов, страдающих хронической почечной недостаточностью, могут развиться тяжелые и иногда смертельные осложнения, такие как пневмония и бронхит. Кроме того, грипп, который вызывает серьезные проблемы со здоровьем, является также высокозаразным, и за короткий период времени становятся инфицированными множество людей, приводя к огромным социальным и экономическим потерям.

Введение гриппозных вакцин является самым эффективным способом предотвращения ущерба здоровью, вызванного гриппозными инфекциями, и снижения социальных и экономических потерь. Препараты гриппозной вакцины, такие как жидкие препараты для применения в виде инъекций и замороженные препараты для применения в виде носовых капель, были известны в прошлом; однако пока не выпускались сухие препараты с удовлетворительной устойчивостью (см., например, непатентный документ 1).

Когда гриппозные вакцины распределяются в форме жидких препаратов, они должны всегда поддерживаться при низких температурах во время распространения и хранения для предотвращения инактивации вакцины; то есть необходимы цепочки холодовых воздействий. Кроме того, когда вакцины распределяются в форме замороженных препаратов, необходимо поддерживать вакцины в замороженном состоянии во время распространения и хранения для поддержания устойчивости препаратов. Таким образом, гриппозные вакцины, изготовленные в виде жидких или замороженных препаратов, требуют совершенного контроля температуры во время транспортировки и хранения (см. непатентный документ 2), затрудняя распространение этих препаратов в областях с нехваткой электроэнергии или поддержание активности гриппозных вакцин без наличия транспортных средств, обеспечивающих условия низкой температуры.

Для преодоления таких недостатков жидких или замороженных препаратов было бы эффективно распределять гриппозные вакцины в форме сухих препаратов. Хотя недавно была предложена методика, относящаяся к лиофилизированным препаратам гриппозных вакцин, при которой гриппозные вакцины изготавливаются в виде препаратов с добавлением лактозы или трегалозы, нигде не указана устойчивость таких препаратов (см. непатентный документ 3).

Подобно другим вакцинам, гриппозные вакцины высоковосприимчивы к теплу и, как известно, теряют активность при высоких температурах или при температурах ниже их точки замерзания (см. непатентный документ 2). Даже если гриппозные вакцины просто высушены или лиофилизированы, их активность проблематично снижается со временем во время производства или хранения. Еще не найдена методика преодоления этой проблемы, и к настоящему времени не сообщалось об успешных примерах внедрения в практику сухих препаратов гриппозных вакцин.

Раскрытие изобретения

Проблемы, решаемые изобретением

Настоящее изобретение было создано с учетом указанных выше методик предшествующего уровня техники. Задачей настоящего изобретения является предоставление лиофилизированного препарата, в котором гриппозная вакцина проявляет значительно повышенную устойчивость.

Средства для решения проблем

Автор изобретения провел обширное исследование для преодоления указанных выше проблем и обнаружил, что лиофилизированный препарат, в котором гриппозная вакцина проявляет значительно повышенную устойчивость, может быть получен лиофилизацией водного раствора, который соответствует следующим условиям (А) до (С) при получении лиофилизированного препарата, содержащего гриппозную вакцину:

(А) включены (i) гриппозная вакцина, (ii) гидрофобная аминокислота и (iii) аргинин и его кислотно-аддитивная соль;

(В) пропорция компонента (iii) составляет от 20 до 85% масс. относительно общего количества полученного в результате лиофилизированного препарата; и

(С) рН доводится до уровня от 8 до 10 путем регулирования отношения аргинина к его кислотно-аддитивной соли, которые образуют компонент (iii).

Настоящее изобретение было осуществлено внесением дополнительных усовершенствований на основании этих данных.

В итоге, настоящее изобретение предоставляет лиофилизированный препарат, содержащий гриппозную вакцину, как изложено ниже.

Абзац 1. Лиофилизированный препарат, содержащий гриппозную вакцину, полученный лиофилизацией водного раствора, содержащего (i) гриппозную вакцину, (ii) гидрофобную аминокислоту и (iii) аргинин или его кислотно-аддитивную соль; причем отношение компонента (iii) к общему количеству лиофилизированного препарата составляет от 20 до 85% масс.; и отношение аргинина к его кислотно-аддитивной соли находится в таком диапазоне, что рН водного раствора составляет от 8 до 10.

Абзац 2. Лиофилизированный препарат согласно абзацу 1, где гриппозная вакцина подвергается процессу обессоливания.

Абзац 3. Лиофилизированный препарат согласно абзацу 1, где (ii) гидрофобная аминокислота представляет фенилаланин или комбинацию фенилаланина, по меньшей мере, с одним из валина, лейцина и изолейцина.

Абзац 4. Лиофилизированный препарат согласно абзацу 1, где пропорция (ii) гидрофобной аминокислоты составляет от 14 до 75% масс. общего количества лиофилизированного препарата.

Абзац 5. Лиофилизированный препарат согласно абзацу 1, где (iii) аргинин и его кислотно-аддитивная соль представляют соответственно аргинин и его гидрохлорид.

Абзац 6. Лиофилизированный препарат согласно абзацу 1, где пропорция кислотно-аддитивной соли аргинина составляет от 1 до 20 частей по массе относительно 1 части по массе аргинина.

Абзац 7. Лиофилизированный препарат согласно абзацу 1, где общее количество компонентов (i)-(iii) составляет от 80 до 100% масс. относительно общего количества лиофилизированного препарата.

Абзац 8. Лиофилизированный препарат согласно абзацу 1, который растворяется для получения инъекционного раствора перед применением.

Абзац 9. Лиофилизированный препарат согласно абзацу 1, который представляет фармацевтический препарат для транспульмонального введения.

Абзац 10. Лиофилизированный препарат согласно абзацу 1, который представляет собой фармацевтический препарат для интраназального введения.

Кроме того, настоящее изобретение также предоставляет способ получения лиофилизированного препарата, содержащего гриппозную вакцину, как изложено ниже.

Абзац 11. Способ получения лиофилизированного препарата, содержащего гриппозную вакцину, включающий:

первую стадию получения водного раствора, содержащего (i) гриппозную вакцину, (ii) гидрофобную аминокислоту и (iii) аргинин и его кислотно-аддитивную соль; причем содержание (i) гриппозной вакцины в водном растворе эквивалентно 20 до 80% масс. относительно общего количества полученного лиофилизированного препарата; и рН водного раствора составляет от 8 до 10; и

вторую стадию лиофилизации полученного водного раствора.

Абзац 12. Способ согласно абзацу 11, где (i) гриппозная вакцина подвергается процессу обессоливания.

Абзац 13. Способ согласно абзацу 11, где (ii) гидрофобная аминокислота представляет фенилаланин или комбинацию фенилаланина, по меньшей мере, с одним из валина, лейцина и изолейцина.

Абзац 14. Способ согласно абзацу 11, где содержание (ii) гидрофобной аминокислоты в водном растворе, используемом на первой стадии, эквивалентно от 14 до 75% масс. относительно общего количества лиофилизированного препарата.

Абзац 15. Способ согласно абзацу 11, где (iii) аргинин и его кислотно-аддитивная соль представляют соответственно аргинин и его гидрохлорид.

Абзац 16. Способ согласно абзацу 11, где пропорция указанной кислотно-аддитивной соли аргинина в водном растворе, используемом на первой стадии, составляет от 1 до 20 частей по массе относительно 1 части по массе аргинина.

Абзац 17. Способ согласно абзацу 11, где общее содержание компонентов (i)-(iii) в водном растворе, используемом на первой стадии, эквивалентно от 80 до 100% масс. относительно общего количества полученного лиофилизированного препарата.

Эффекты изобретения

Лиофилизированный препарат по изобретению может устойчиво поддерживать активность гриппозной вакцины во время хранения, таким образом, облегчая распространение и хранение, по сравнению с предыдущими препаратами.

Кроме того, лиофилизированный препарат может применяться в виде инъекционного раствора растворением его в растворе для инъекций перед применением или в виде препарата для транспульмонального введения или интраназального введения в том виде, как он есть; следовательно, другое преимущество лиофилизированного препарата состоит в том, что его можно применять с различными способами введения.

Описание предпочтительных вариантов осуществления

В описании рН обозначает величину, измеренную при 25°С.

Лиофилизированный препарат по изобретению содержит (i) гриппозную вакцину, (ii) гидрофобную аминокислоту и (iii) аргинин и его кислотно-аддитивную соль; в который включена определенная пропорция компонента (iii), и отношение аргинина к его кислотно-аддитивной соли, составляющих компонент (iii), укладывается в определенный диапазон.

Гриппозные вакцины, подходящие в качестве гриппозной вакцины, используемой в лиофилизированном препарате по изобретению (далее иногда обозначаемые просто как «компонент (i)»), включают субъединичные вакцины, полученные после очистки вирусных частиц, выращенных в куриных эмбрионах, и гриппозные НА (гемагглютининовые) вакцины, которые представляют собой один тип расщепленной вакцины. Могут также использоваться гриппозные вакцины, полученные из тканевых культур. Альтернативно, могут также использоваться живые вакцины, полученные из ослабленных вирусов гриппа, компонентные вакцины, полученные из детоксифицированных вирусов гриппа при их интактной иммуногенности, или цельные вирусные частицы, полученные из инактивированных цельных вирусных частиц. Гриппозная вакцина для применения в настоящем изобретении может быть получена из любого или из обоих из штаммов А и В, но предпочтительно может быть получена из гриппозных вакцин и А и В штаммов.

В качестве гриппозной вакцины для применения в изобретении может использоваться гриппозная вакцина, полученная в соответствии с известным способом, или выпускаемая промышленностью гриппозная вакцина.

Когда полученная гриппозная вакцина или выпускаемая промышленностью гриппозная вакцина представлена в форме раствора или порошка и содержит соль, такую как буфер или консервант, гриппозная вакцина желательно подвергается предварительному процессу обессоливания для удаления соли. Когда гриппозная вакцина подвергается таким образом предварительному процессу обессоливания, то можно более эффективно повысить устойчивость гриппозной вакцины в лиофилизированном препарате по изобретению. Способ обессоливания гриппозной вакцины конкретно не ограничен, и его примеры включают ультрафильтрацию, осаждение, ионный обмен, диализ и им подобные. Для предотвращения снижения активности гриппозной вакцины во время процесса обессоливания обессоливание желательно проводится с использованием водного раствора, рН которого доводится до уровня от 8 до 10, а предпочтительно, от 8 до 9, щелочным веществом, таким как гидроксид натрия, гидроксид калия, аргинин или им подобным. В частности, раствор с таким же составом, как состав раствора, подвергнутого лиофилизации при получении лиофилизированного препарата, за исключением гриппозной вакцины, подходит в качестве раствора для использования в процессе обессоливания.

Пропорция компонента (i), используемая в лиофилизированном препарате по изобретению, может быть определена в соответствии со способом применения лиофилизированного препарата и тому подобным. Например, пропорция компонента (i) относительно общего количества лиофилизированного препарата составляет от 0,3 до 60% масс., предпочтительно, от 1 до 50% масс., предпочтительнее, от 2 до 40% масс., еще предпочтительнее, от 3 до 30% масс., а особенно предпочтительно, от 3 до 20% масс.

Определенные примеры гидрофильной аминокислоты, содержащейся в лиофилизированном препарате по изобретению (далее иногда обозначаемые просто как «компонент (ii)»), включают составляющие белок аминокислоты, такие как валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин и им подобные. В изобретении эти гидрофобные аминокислоты могут использоваться отдельно или в комбинации. В изобретении, например, фенилаланин или комбинация фенилаланина, по меньшей мере, с одним из валина, лейцина и изолейцина могут предпочтительно использоваться в качестве гидрофобных аминокислот.

Пропорция компонента (ii), используемая в лиофилизированном препарате по изобретению, может быть определена в соответствии с типом компонента (ii), со способом применения лиофилизированного препарата и тому подобным. Например, пропорция компонента (ii) относительно общего количества лиофилизированного препарата составляет от 14 до 75% масс., предпочтительно, от 20 до 75% масс., предпочтительнее, от 20 до 70% масс., еще предпочтительнее, от 25 до 65% масс., а особенно предпочтительно, от 30 до 60% масс.

Лиофилизированный препарат по изобретению, кроме того, содержит аргинин и его кислотно-аддитивную соль (далее иногда обозначаемые просто как «компонент (iii)»). Другими словами, лиофилизированный препарат по существу содержит комбинацию аргинина и его кислотно-аддитивную соль.

Кислотно-аддитивная соль аргинина для использования в изобретении конкретно не ограничена, пока она фармакологически приемлема, и ее примеры включают неорганические кислотно-аддитивные соли, такие как гидрохлориды, нитраты и сульфаты; и органические кислотно-аддитивные соли, такие как ацетат. Аргинин гидрохлорид указывается в качестве предпочтительного примера кислотно-аддитивной соли аргинина для использования в изобретении. В изобретении кислотно-аддитивная соль аргинина может использоваться отдельно или две или более кислотно-аддитивные соли аргинина могут использоваться в комбинации.

В лиофилизированный препарат по изобретению общее количество компонента (iii) (т.е. общее количество аргинина и его кислотно-аддитивной соли) включается в пропорции от 20 до 85% масс. относительно общего количества лиофилизированного препарата. Такая пропорция компонента (iii) предотвращает снижение активности гриппозной вакцины во время хранения, посредством этого обеспечивая препарат с превосходной устойчивостью. Пропорция компонента (iii) относительно общего количества лиофилизированного препарата составляет предпочтительно от 20 до 80% масс., предпочтительнее, от 20 до 75% масс., еще предпочтительнее, от 25 до 70% масс., а особенно предпочтительно, от 30 до 65% масс.

Компонент (iii) удовлетворяет любые из этих пропорций и также является таким, что отношение аргинина к его кислотно-аддитивной соли подбирается так, чтобы рН водного раствора, подвергнутого лиофилизации, составлял от 8 до 10. Другими словами, аргинин является щелочным, а кислотно-аддитивная соль аргинина является кислотной, так что рН водного раствора, подвергнутого лиофилизации, регулируется в пределах этого диапазона путем регулирования отношения аргинина к кислотно-аддитивной соли аргинина, при условии что используемое количество компонента (iii) укладывается в любой из указанных выше диапазонов. Путем такого регулирования рН водного раствора, подвергнутого лиофилизации, в указанном выше диапазоне с использованием аргинина и его кислотно-аддитивной соли можно повысить устойчивость при хранении гриппозной вакцины. Предпочтительнее, отношение аргинина к его кислотно-аддитивной соли подбирается так, чтобы рН водного раствора, подвергнутого лиофилизации, составлял от 8 до 9. Используемый в настоящем описании термин «водный раствор, подвергнутый лиофилизации» означает водный раствор, подвергнутый лиофилизации, при получении лиофилизированного препарата, т.е. водный раствор, полученный добавлением всех компонентов лиофилизированного препарата по изобретению к очищенной воде. Водный раствор, подвергнутый лиофилизации, регулируется так, чтобы, например, общее количество лиофилизированного препарата (общее количество всех компонентов) на 1 мл водного раствора составляло от 0,2 до 20 мг, предпочтительно, от 0,4 до 20 мг, предпочтительнее, от 0,4 до 15 мг, еще предпочтительнее, от 0,6 до 12,5 мг, особенно предпочтительно, от 1 до 10 мг, хотя изобретение конкретно не ограничивается этими количествами.

Отношение аргинина к его кислотно-аддитивной соли в компоненте (iii) конкретно не ограничивается, пока рН водного раствора, подвергнутого лиофилизации, может быть в пределах указанного выше диапазона, и оно может определяться в соответствии с типом кислотно-аддитивной соли, используемым типом компонента (ii) и тому подобным. В частности, пропорция кислотно-аддитивной соли аргинина относительно 1 части по массе аргинина может, например, составлять от 1 до 20 частей по массе, предпочтительно, от 1 до 15 частей по массе, предпочтительнее, от 1,25 до 12,5 частей по массе, еще предпочтительнее, от 1,5 до 12,5 частей по массе, а особенно предпочтительно, от 2 до 10 частей по массе.

Лиофилизированный препарат по изобретению может содержать, в дополнение к компонентам (i)-(iii), гидрофильные аминокислоты, кроме аргинина (далее иногда обозначаемые просто как «компонент (iv)»), в таком диапазоне, чтобы не нарушать эффекты изобретения. Гидрофильная аминокислота может представлять собой любую аминокислоту с гидрофильной боковой цепью, независимо от того, является ли она составляющей белок аминокислотой или нет. Определенные примеры гидрофильных аминокислот включают основные аминокислоты, такие как лизин, гистидин и им подобные; нейтральные гидроксиаминокислоты, такие как серин, треонин и им подобные; кислотные аминокислоты, такие как аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота и им подобные; аминокислоты, содержащие амидную группу, такие как аспарагин, глутамин и им подобные; глицин, аланин, цистеин, тирозин и другие аминокислоты. Предпочтительными среди этих гидрофильных аминокислот являются аланин и глицин. Такие гидрофильные аминокислоты могут использоваться отдельно, или две или более из них могут использоваться в комбинации.

Когда такая гидрофильная аминокислота содержится в лиофилизированном препарате по изобретению, то пропорция гидрофильной аминокислоты также конкретно не ограничивается; но, например, пропорция гидрофильной аминокислоты относительно общего количества лиофилизированного препарата может составлять от 5 до 50% масс., предпочтительно, от 5 до 40% масс., предпочтительнее, от 5 до 30% масс., еще предпочтительнее, от 5 до 25% масс., а особенно предпочтительно, от 10 до 25% масс.

Кроме того, для того чтобы сделать эффект стабилизации гриппозной вакцины более значимым в лиофилизированном препарате по изобретению, общее количество компонентов (i)-(iii), в которое не включен компонент (iv), или общее количество компонентов (i)-(iv), в которое включен компонент (iv), составляет от 80 до 100% масс., предпочтительно, от 85 до 100% масс., предпочтительнее от 90 до 100% масс., еще предпочтительнее, от 95 до 100% масс., и особенно предпочтительно, 100% масс. относительно общего количества лиофилизированного препарата.

Лиофилизированный препарат по изобретению может также содержать следующие компоненты, пока не нарушаются эффекты изобретения: моносахариды, такие как глюкоза; дисахариды, такие как сахароза, мальтоза, лактоза и трегалоза; сахарные спирты, такие как манит; олигосахариды, такие как циклодекстрин; полисахариды, такие как декстран 40 и пуллулан; многоатомные спирты, такие как полиэтиленгликоль; соли жирных кислот, такие как капрат натрия; человеческий сывороточный альбумин; неорганические соли; желатин; поверхностно-активные вещества; буферы; и т.д. Поверхностно-активное вещество может быть анионным, катионным или не ионным, пока оно представляет собой поверхностно-активное вещество, обычно используемое в фармацевтических продуктах. Кроме того, лиофилизированный препарат по изобретению необязательно содержит адъювант.

Лиофилизированный препарат по изобретению получается добавлением заданных количеств компонентов (i)-(iii) к очищенной воде, добавлением компонента (iv) и, при необходимости, других компонентов и воздействием на смесь процесса лиофилизации. Конкретнее, лиофилизированный препарат по изобретению может быть получен посредством следующих первой и второй стадий:

первая стадия: получение водного раствора, содержащего: (i) гриппозную вакцину, (ii) гидрофобную аминокислоту и (iii) аргинин и его кислотно-аддитивную соль, где количество (iii) аргинина и его кислотно-аддитивной соли эквивалентно 20-85% масс. относительно общего количества полученного лиофилизированного препарата, и рН составляет от 8 до 10; и

вторая стадия: лиофилизация водного раствора, полученного на первой стадии, для получения лиофилизированного препарата.

Целевой лиофилизированный препарат может быть получен воздействием на водный раствор, полученный на первой стадии, процессом лиофилизации. Поэтому на первой стадии водный раствор, подверженный лиофилизации, получается так, что соотношение в водном растворе компонентов, отличных от компонента (компонентов), удаленных лиофилизацией, такое же, как соотношение компонентов в полученном препарате. Кроме того, рН водного раствора, полученного на первой стадии, доводится путем регулирования отношения аргинина к кислотно-аддитивной соли аргинина, как описано выше.

Сам лиофилизированный препарат по изобретению может представлять собой высушенное твердое вещество (лиофилизированную лепешку), полученное процессом лиофилизации, или может представлять собой порошок, полученный из высушенного твердого вещества.

Способ введения лиофилизированного препарата по изобретению конкретно не ограничивается. Например, препарат может быть растворен в разбавителе (растворе для инъекций) перед применением и подкожно введен в виде инъекции. Лиофилизированный препарат может быть также растворен в разбавителе для образования жидкого препарата и введен транспульмонально или интраназально в виде фармацевтического препарата для введения через легкие или введения в виде носовых капель. Кроме того, лиофилизированный препарат может быть изготовлен в виде порошка воздействием воздушного удара; поэтому, когда лиофилизированный препарат применяется в качестве фармацевтического препарата для введения через легкие или введения в виде носовых капель, он может вводиться транспульмонально или интраназально в том виде, как он есть, с использованием устройства для ингаляции сухого порошка, в котором может прилагаться воздушный удар.

Способ введения лиофилизированного препарата можно определить в зависимости от возраста и других параметров пациента, но препарат может вводиться, например, в количестве, эквивалентном 3-300 мкг гриппозной вакцины, однократно или дважды с интервалом примерно от 1 до 4 недель.

Когда лиофилизированный препарат вводится в том виде, как он есть, без растворения в разбавителе перед применением, он предпочтительно помещен в контейнер для каждой одной дозы (количества, вводимого за один раз) с учетом удобства применения. Когда лиофилизированный препарат вводится растворением в разбавителе перед применением, он может быть помещен в контейнер для каждой одной дозы, или множественные дозы препарата могут быть помещены вместе в один контейнер.

Лиофилизированный препарат содержит уменьшенное количество наполнителя, по сравнению с препаратами, содержащими гриппозные вакцины, которые ранее использовались в виде инъекций. Поэтому один признак препарата состоит в том, что количество препарата на контейнер невелико. В настоящем изобретении количество лиофилизированного препарата, помещенного в контейнер, конкретно не ограничивается, но составляет, например, от 0,1 до 10 мг, предпочтительно, от 0,15 до 8 мг, предпочтительнее, от 0,2 до 6 мг, еще предпочтительнее, от 0,25 до 5 мг, а особенно предпочтительно, от 0,3 до 5 мг.

Примеры

Настоящее изобретение будет более детально описано ниже со ссылкой на примеры и им подобные, которые не предназначены для ограничения изобретения.

Справочный пример 1: Исследование условий обессоливания для гриппозных вакцин

Исследовали условия процесса обессоливания для растворов гриппозных НА вакцин. В частности, гриппозную НА вакцину “Seiken” (название продукта, выпускаемого компанией Denka Seiken, Лот № 308-А) использовали в качестве раствора гриппозной НА вакцины и подходящее количество этого раствора выливали в каждый концентратор Vivaspin емкостью 4 мл (выпускаемый компанией Sartorius) и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут. Каждый из растворов составов, показанных в таблице 1, затем добавляли в каждый концентратор Vivaspin и смеси центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут. Эту процедуру повторяли всего три раза.

Активность полученных обессоленных гриппозных НА вакцин (величину НА) измеряли в соответствии с описанным ниже способом.

Измерение активности гриппозных НА вакцин

Получение 5 об.% суспензий куриных эритроцитов

Консервированную куриную кровь (поставляемую Nippon Biotest Labo.) помещали в пробирку и центрифугировали в течение 5 минут при 900 g с последующим удалением надосадочной жидкости и лейкоцитарного слоя. Затем к эритроцитам в пробирке добавляли разбавитель композиции, показанный ниже (раствор 1/200 моль/л хлорида натрия, забуференный фосфатом (рН 7,2)). Смесь перемешивали и в последующем центрифугировали для удаления супернатанта. Процедуру повторяли три раза. Эритроциты в пробирке отсасывали пипеткой и помещали в контейнер, содержащий разбавитель, и смешивали для получения 5 об.% суспензий куриных эритроцитов.

Композиция разбавителя

NaCl	8,5 г
Na2HPO4·12H2O	1,425 г
KH2PO4	0,135 г
Очищенная вода	1000 мл

2. Измерение величин НА

Каждую из порций по 50 мкл гриппозной НА вакцины с различными факторами разведения добавляли в микропипетку и затем в нее добавляли 50 мкл 5 об.% суспензий куриных эритроцитов (способ двухэтапного разведения). Образцы в микропланшете тщательно смешивали и оставляли стоять при комнатной температуре в течение часа, затем оценивали самый высокий фактор разведения среди образцов каждой гриппозной НА вакцины при полной агглютинации эритроцитов в качестве его величины НА.

Результаты показаны в таблице 1. Результаты подтвердили, что происходит снижение активности гриппозных НА вакцин, подвергнутых процессу обессоливания раствором с рН 7 или ниже; однако гриппозные НА вакцины, подвергнутые процессу обессоливания раствором с рН от 8 до 9, были способны сохранять стабильную активность.

Таблица 1
	Составы и рН растворов	Остаточная активность
Условие 1	0,5 мг Phe, добавленного в 0,5 мл очищенной воды; рН доведен NaOH до 3,0	12,5%
Условие 2	0,5 мг Phe, добавленного в 0,5 мл очищенной воды; рН доведен NaOH до 4,0	6,3%
Условие 3	0,5 мг Phe, добавленного в 0,5 мл очищенной воды; рН доведен NaOH до 5,7	12,5%
Условие 4	0,5 мг Phe, добавленного в 0,5 мл очищенной воды; рН доведен NaOH до 7,0	50%
Условие 5	Без добавления Phe в 0,5 мл очищенной воды; рН доведен NaOH до 7,0	50%
Условие 6	0,5 мг Phe, добавленного в 0,5 мл очищенной воды; рН доведен NaOH до 8,0	100%
Условие 7	Без добавления Phe в 0,5 мл очищенной воды; рН доведен NaOH до 8,0	100%
Условие 8	0,5 мг Phe, добавленного в 0,5 мл очищенной воды; рН доведен NaOH до 9,0	100%
#«Остаточная активность» в таблице 1 обозначает долю (%) величины НА после процесса обессоливания относительно величины НА перед процессом обессоливания.

Пример испытания 1:% Оценка устойчивости гриппозных вакцин

Гриппозную НА вакцину “Seiken” (название продукта, выпускаемого компанией Denka Seiken, Лот № 308-А) использовали в качестве раствора гриппозной НА вакцины и 1 мл (эквивалентен 90 мкг гриппозной НА вакцины) этого раствора выливали в каждый концентратор Vivaspin емкостью 4 мл (выпускаемый компанией Sartorius) и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут. Каждый из растворов составов, показанных в таблице 2, затем добавляли в каждый концентратор Vivaspin и смеси центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут. Эту процедуру повторяли всего три раза. Конечные растворы, полученные после такой концентрации и обессоливания (буферного обмена), имели составы, показанные в таблице 2, и их объем был доведен до первоначального объема (1 мл). Стеклянный флакончик заполняли 0,5 мл каждого из полученных растворов и растворы лиофилизировали для получения лиофилизированных продуктов.

Таблица 2
	СоСоставы и величины рН растворов, использованных в примерах и сравнительных примерах
Пример 1	0,5 мг Phe, 0,5 мг Arg-HCl и 0,075 мг Arg, добавленных в 0,5 мл очищенной воды; рН 8
Пример 2	0,5 мг Phe, 0,3 мг Arg-HCl и 0,050 мг Arg, добавленных в 0,5 мл очищенной воды; рН 8
Пример 3	0,5 мг Phe, 0,2 мг Ile, 0,3 мг Arg-HCl и 0,057 мг Arg, добавленных в 0,5 мл очищенной воды; рН 8
Пример 4	0,5 мг Phe, 0,2 мг Val, 0,3 мг Arg-HCl и 0,055 мг Arg, добавленных в 0,5 мл очищенной воды; рН 8
Пример 5	0,5 мг Phe, 0,2 мг Leu, 0,3 мг Arg-HCl и 0,052 мг Arg, добавленных в 0,5 мл очищенной воды; рН 8
Пример 6	0,5 мг Phe, 0,2 мг Ala, 0,3 мг Arg-HCl и 0,052 мг Arg, добавленных в 0,5 мл очищенной воды; рН 8
Пример 7	0,5 мг Phe, 0,2 мг Gly, 0,3 мг Arg-HCl и 0,052 мг Arg, добавленных в 0,5 мл очищенной воды; рН 8
Сравнительный пример 1	0,5 мг Phe и подходящее количество NaOH, добавленных в 0,5 мл очищенной воды; рН 8
Сравнительный пример 2	0,5 мг Phe и 0,060 мг Arg, добавленных в 0,5 мл очищенной воды; рН 8
Сравнительный пример 3	0,3 мг Arg-HCl и 0,030 мг Arg, добавленных в 0,5 мл очищенной воды; рН 8
Сравнительный пример 4	0,5 мг Phe, 0,5 мг His и 0,30 мг Arg, добавленных в 0,5 мл очищенной воды; рН 8
# рН растворов, использованных в примерах 1-7, и Сравнительных примерах 2-4, доводили до 8, используя заданные количества компонентов без использования других регуляторов рН. NaOH добавляли к раствору, использованному в Сравнительном Примере 1, так, чтобы рН был 8 после добавления заданного количества его компонента.

Каждый из полученных лиофилизированных препаратов был герметично укупорен в стеклянный флакончик и хранился в течение 4 недель в темном месте при 25°С и относительной влажности 60%. Сразу после получения и через 1, 2, 3 и 4 недели после сохранения гриппозной НА вакцины в каждом лиофилизированном препарате проводили измерение величины НА в соответствии с тем же способом, который описан в Справочном примере 1.

Результаты показаны в таблице 3. В случаях использования растворов, содержащих фенилаланин, рН которых доводился до 8 только гидроксидом натрия и аргинином, было невозможно предотвратить снижение активности гриппозных НА вакцин во время хранения (Сравнительные примеры 1 и 2). Также в случае использования раствора, рН которого доводился до 8 посредством добавления аргинина и аргинина гидрохлорида без добавления фенилаланина, который представляет собой гидрофобную аминокислоту, было невозможно предотвратить снижение активности гриппозной НА вакцины (Сравнительный пример 3). Кроме того, в случае использования раствора, рН которого доводился до 8 с использованием комбинации фенилаланина, гистидина, который представляет собой основную аминокислоту, и аргинина, было невозможно предотвратить снижение активности гриппозной НА вакцины

Напротив, было обнаружено, что когда раствор для использования при получении лиофилизированного препарата соответствует условиям (1)-(3), изложенным ниже, то можно устойчиво поддерживать активность гриппозной НА вакцины в конечном лиофилизированном препарате:

(1) включены гидрофобная аминокислота, аргинин и кислотно-аддитивная соль аргинина; (2) отношение аргинина к кислотно-аддитивной соли аргинина подобрано так, что рН раствора составляет 8; (3) общее количество аргинина к кислотно-аддитивной соли аргинина подобрано так, чтобы оно равнялось или превышало заданную концентрацию в лиофилизированном препарате.

Таблица 3
	Составы лиофилизированных препаратов	Остаточная активность
Сразу после получения	Через 1 неделю	Через 2 недели	Через 4 недели
Пример 1	4,0% НА вакцины, 44,6% Phe, 51,4% Arg и Arg-HCl	100%	100%	100%	100%
Пример 2	5,0% НА вакцины, 55,9% Phe, 39,1% Arg и Arg-HCl	100%	-	100%	-
Пример 3	4,1% НА вакцины, 45,4% Phe, 18,1% Ile, 32,4% Arg и Arg-HCl	100%	-	100%	-
Пример 4	4,1% НА вакцины, 45,4% Phe, 18,2% Val, 32,3% Arg и Arg-HCl	100%	-	100%	-
Пример 5	4,1% НА вакцины, 45,6% Phe, 18,2% Leu, 32,1% Arg и Arg-HCl	100%	-	100%	-
Пример 6	4,1% НА вакцины, 45,6% Phe, 18,2% Ala, 32,1% Arg и Arg-HCl	100%	-	100%	-
Пример 7	4,1% НА вакцины, 45,6% Phe, 18,2% Gly, 32,1% Arg и Arg-HCl	100%	-	100%	-
Сравнительный пример 1	Примерно 8,3% НА вакцины, примерно 91,7% Phe, подходящее количество NaOH	100%	25%	6,3%	3,1%
Сравнительный пример 2	7,4% НА вакцины, 82,7% Phe, 9,9% Arg	100%	50%	25%	25%
Сравнительный пример 3	7,8% НА вакцины, 92,2% Arg и Arg-HCl	100%	-	25%	-
Сравнительный пример 4	4,2% НА вакцины, 46,5% Phe, 46,5% His, 2,8% Arg	100%	50%	12,5%	6,3%
# «Остаточная активность» в таблице 3 обозначает долю (%) величины НА лиофилизированного препарата после сохранения относительно величины НА лиофилизированного препарата сразу после получения. В таблице 3 единица % в колонке «Композиция лиофилизированных составов» обозначает % по массе. В таблице 3 «-» обозначает «не измерялось»

1. Лиофилизированный препарат, содержащий гриппозную вакцину, полученный лиофилизацией водного раствора, содержащего (i) гриппозную вакцину, (ii) гидрофобную аминокислоту и (iii) аргинин и его кислотно-аддитивную соль;
причем пропорция компонента (iii) аргинина и его кислотно-аддитивной соли относительно общего количества лиофилизированного препарата составляет от 20 до 85 мас.%; и пропорция аргинина к его кислотно-аддитивной соли находится в таком диапазоне, что рН водного раствора составляет от 8 до 10, при этом гриппозная вакцина подвергнута процессу обессоливания.

2. Лиофилизированный препарат по п.1, где (ii) гидрофобная аминокислота представляет собой фенилаланин и, необязательно, включен по меньшей мере один компонент, выбранный из валина, лейцина и изолейцина.

3. Лиофилизированный препарат по п.1, где пропорция (ii) гидрофобной аминокислоты составляет от 14 до 75 мас.% от общего количества лиофилизированного препарата.

4. Лиофилизированный препарат по п.1, где (iii) аргинин и его кислотно-аддитивная соль представляют соответственно аргинин и его гидрохлорид.

5. Лиофилизированный препарат по п.1, где пропорция кислотно-аддитивной соли аргинина составляет от 1 до 20 частей по массе относительно 1 части по массе аргинина.

6. Лиофилизированный препарат по п.1, где общее количество компонентов (i)-(iii) составляет от 80 до 100 мас.% относительно общего количества лиофилизированного препарата.

7. Лиофилизированный препарат по п.1, который растворяется для получения инъекционного раствора перед применением.

8. Лиофилизированный препарат по п.1, который представляет фармацевтический препарат для транспульмонального введения.

9. Лиофилизированный препарат по п.1, который представляет фармацевтический препарат для интраназального введения.

10. Способ получения лиофилизированного препарата, содержащего гриппозную вакцину, включающий:
первую стадию получения водного раствора, содержащего (i) гриппозную вакцину, (ii) гидрофобную аминокислоту и (ii) аргинин и его кислотно-аддитивную соль; причем содержание (iii) аргинина и его кислотно-аддитивной соли в водном растворе эквивалентно от 20 до 85 мас.% относительно общего количества полученного лиофилизированного препарата; и рН водного раствора составляет от 8 до 10; и
вторую стадию лиофилизации полученного водного раствора;
при этом гриппозную вакцину подвергают процессу обессоливания.

11. Способ по п.10, где (ii) гидрофобная аминокислота представляет собой фенилаланин и, необязательно, включен по меньшей мере один компонент, выбранный из валина, лейцина и изолейцина.

12. Способ по п.10, где содержание (ii) гидрофобной аминокислоты в водном растворе, используемом на первой стадии, эквивалентно от 14 до 75 мас.% относительно общего количества лиофилизированного препарата.

13. Способ по п.10, где (iii) аргинин и его кислотно-аддитивная соль представляют соответственно аргинин и его гидрохлорид.

14. Способ по п.10, где пропорция указанной кислотно-аддитивной соли аргинина в водном растворе, используемом на первой стадии, составляет от 1 до 20 частей по массе относительно 1 части по массе аргинина.

15. Способ по п.10, где общее содержание компонентов (i)-(iii) в водном растворе, используемом на первой стадии, эквивалентно от 80 до 100 мас.% относительно общего количества полученного лиофилизированного препарата.