Способ идентификации и дифференциации прокариотических организмов

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано для идентификации и дифференциации прокариотических микроорганизмов. Способ идентификации и дифференциации прокариотических микроорганизмов предусматривает амплификацию последовательности между копиями генов тРНК-Глю с помощью родоспецифичных праймеров. Указанная последовательность представляет собой hin-регион. Полученные продукты амплификации сравнивают с аналогичными характеристиками известных hin-регионов по количеству, длине и нуклеотидной последовательности. Применение изобретения позволяет осуществить идентификацию в образце как одного, так и одновременно несколько разных прокариотических микроорганизмов. 54 ил., 4 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа идентификации одного микроорганизма или одновременной идентификации нескольких различных микроорганизмов в образце по нуклеотидной последовательности hin-региона (от латинского Hin - уникальный, неповторимый), расположенного между копиями одноименных генов тРНК-Глю.

Основные молекулярно-биологические методы, используемые для дифференциации и идентификации организмов, можно разделить на три категории: методы, базируемые на рестрикции, на амплификации (ПЦР) и на совокупности последних.

К первой группе относится техника RFLP (Полиморфизм Длин Рестрикционных Фрагментов), которая заключается в фрагментировании нативной ДНК исследуемого организма с помощью ферментов рестриктаз и последующем разделении полученных фрагментов при помощи Пульс-Гель Электрофореза (PFGE) /Schwartz D.C., Cantor C.R. 1984. Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis. Cell. 37(1):67-75/. Обладая оригинальным принципом разделения фрагментов ДНК в геле, тем не менее данный метод весьма трудоемок на стадии получения и рестрикции целой нефрагментированной ДНК.

Ко второй группе относятся такие техники, как:

АР-ПЦР (случайная ПЦР, осуществляемая без знания нуклеотидной последовательности организма, основанная на геномном распределении случайных повторов) /Williams J.G-K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A, Tingey S.V. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucleic Acids Res. 18:6531-6535/;

- гер-ПЦР (техника представляет собой комплекс праймеров на часто повторяющиеся в геномах энтеробактерий последовательности, получившие названия Box, Rep, Eric) /Versalotic J., Koeuth Т., Lupski J.R. 1991. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes //Nucleic Acids Res. 19:6823-6831/;

- микросаттелитная ПЦР (техника, основанная на геномном распределении микросаттелитных последовательностей типа (GC)₄, (GTG)₅ и др.) /Epplen J.T., Ammer H., Epplen С. 1991. Oligonucleotide fingerprinting using simple repeat motifs: a convenient, ubiquitously applicable method to detect hypervariability for multiple purposes // In: DNA fingerprinting: approaches and applications. Eds.: G. Burke, G.Dolf, A.J.Jeffreys, and R.Wolff, Birkhauser, Basel. P.50-69; Toonen R. 1997. Microsatellites for Ecologists: Non-Radioactive Isolation and Amplification Protocols for microsatellite markers. Version 1. University of California; Ellegren H. 2004. MICROSATELLITES: SIMPLE SEQUENCES WITH COMPLEX EVOLUTION // Nature Reviews Genetics 5, No 6,435-445/;

- тРНК-ПЦР (tDNA-ILP) (техника, основанная на геномном распределении консервативных участков генов тРНК) /Welsh J., McClelland M. 1991. Genomic fingerprints produced by PCR with consensus tRNA gene primers // Nucleic Acids Res. 19:861-866/;

- IS-ПЦР (техника, основанная на геномном распределении последовательностей мобильных элементов, встречаемых в геноме исследуемого организма) /Mahillon J., Chandler M. 1998. Insertion sequences // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:725-774; George M.L.C., Bustamam M., Cruz W.T., Leach J.E., Nelson R.J. 1997. Movement of Xanthomonas oryzae pv. oryzae in southeast Asia detected using PCR-based DNA fingerprinting // Phytopathology. 87:302-309/;

- ПЦР анализ с праймерами на целевые гены (такими генами могут быть гены домашнего хозяйства (housekeeping) (gyrB, rpoD, dnaK, fyuA, atpD, recA, ginll, rpoB и др.) /Berg Т., Tesoriero L., Hailstones D.L. 2005. A multiplex real-time PCR assay for detection of Xanthomonas campestris from brassicas. // Letters in Appl. Microbiology. 42(6):624-630; Parkinson N., Aritua V., Heeney J., Cowie C., Bew J.D., Stead D. 2007. Phylogenetic analysis of Xanthomonas species by comparison of partial gyrase В gene sequences // Int. J. of Syst. and Evol. Microbiology. 57:2881-2887; Maiden M.C., Bygraves J.A., Feil E. 1998. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:3140-3145); Vinuesa P., Rojas-Jiménez K., Contreras-Moreira В., Mahna S.K., Nandan Prasad В., Мое H., Babu Selvaraju S., Thierfelder H., Wemer D. 2008. Multilocus sequence analysis for assessment of the biogeography and evolutionary genetics of four Bradyrhizobium species that nodulate soybeans on the asiatic continent // Applied and Environmental Microbiology. 74(22):6987-6996/, рибосомальный кластер (16S pPHK, межгенная область, расположенная между генами 16S pPHK и 23S pPHK, 23S pPHK) /Kolbert С.Р., Persing D.H. 1999. Ribosomal DNA sequencing as a tool for identification of bacterial pathogens // Curr.Opin. Microbiol. 2:299-305/, а также симбиотические гены (sym-гены, nod-гены) /Franssen H.J., Nap J.P., Bisseling T. 1992. Nodulins in root nodule development // Biological Nitrogen Fixation. P.598-624; Suominen L., Roos C., Lortet G., Paulin L., Lindström K. 2001. Identification and structure of the Rhizobium galegae common nodulation genes: evidence for horizontal gene transfer // Mol. Biol. Evol. 18(6):907-916/, гены патогенности (hrp) /Berg Т., Tesoriero L., Hailstones D.L. 2005. A multiplex real-time PCR assay for detection of Xanthomonas campestris from brassicas. // Letters in Appl. Microbiology. 42(6):624-630; Leite R.P. (Jr), Minsavage G.V., Bonas U., Stall R.E. 1994. Detection and identification of phytopathogenic Xanthomonas strains by amplification of DNA sequences related to the hrp genes of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria II//Appl. Environ. Microbiol. 60:1068-1077; Zaccardelli M., Campanile F., Spasiano A., Merighi M. 2007. Detection and identification of the crucifer pathogen, Xanthomonas campestris pv. campestris, by PCR amplification of the conserved Hip/type III secretion system gene hrcC // Eur. J. of Plant Pathology. 118(3):299-306/ и др.).

- секвенирование ДНК (определение и анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов) /Sanger F. et al. 1977. Nucleotide sequence of bacteriophage phi X174 DNA //

Nature. 265(5596):687-95/.

К третьей группе методов относятся:

- AFLP и его различные модификации (Vos, Р. et al. 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting // Nucleic Acids Res. 23:4407-4414; Savelkoul P.H.M., Aarts H.J.M., De Haas J., Dijkshoorn L., Duim В., Otsen M., Rademaker J.L.W., Schouls L., Lenstra J.A. 1999. Amplified-Fragment Length Polymorphism Analysis: the State of an Art // Journal of clinical Microbiology. 37(10):3083-3091), в т.ч. saAFLP (техника, основанная на сопоставлении длин амплифицированнах фрагментов, получаемых путем первоначального фрагментирования общей ДНК организма ферментами рестриктазами, затем легирования полученных рестрикционных фрагментов с короткими (10-30 п.о.) двухцепочечными нуклеотидными последовательностями (адаптерами) и последующей ПЦР с праймерами, нуклеотидные последовательности которых комплиментарны последовательностям адаптеров);

- ПЦР-RFLP (техника, основанная на сопоставлении длин рестрикционных фрагментов целевых генов, накопленных предварительно в большой концентрации путем ПЦР) /Gurtler V., Wilson V.A., Mayall B.C. 1991. Classification of medically important clostridia using restiction endonuclease site differences of PCR-amplified 16S rRNA // J.Gen. Microbiol. 137:2673-2679; Kostman J.R., Edlind T.D., LiPuma J.J., Stull T.L. 1992. Molecular epidemiology of Pseudomonas cepacia determined by polymerase chain reaction ribotyping // J.Clin. Microbiol. 30:2084-2087/.

У каждого из этих методов есть свои преимущества и недостатки, однако их совокупное использование позволяет обеспечить высокую достоверность идентификации и последующей дифференциации таксономических порядков разного уровня.

Прототипом предложенной нами техники является методика, основанная на амплификации, секвенировании и/или рестрикции межгенного региона рибосомального кластера 16S pPHK и 23S рРНК, позволяющая одновременно определять, идентифицировать и дифференцировать различные таксоны прокариот /Jannes G., Rossau R., Van Heuverswyn H. 1995. Probes targeted to rRNA spacer region, methods and kids for using said probes, for the detection of respiratory tract pathogens. WO 96/00298/. Метод достаточно универсален, т.к. данный межгенный регион есть в наличии практически у всех микроорганизмов. Однако его существенным недостатком является высокий уровень изменчивости выбранного межгенного региона, что требует создания большой коллекции их последовательностей для создания таксон-специфичных праймеров. Однако это не гарантирует отсутствие неспецифичной амплификации с другими таксонами. А также затрудняет прогнозирование работоспособности таких праймеров на неизвестных еще представителях одного и того же таксона. К тому же данный межгенный регион может быть представлен в геноме одного и того же организма в нескольких копиях, отличающихся не только длиной, но и составом нуклеотидной последовательности, что весьма затрудняет идентификацию носителя таких межгенных регионов.

тРНК-ПЦР (tDNA-ILP) - методика ПЦР с использованием консенсусных праймеров, специфичных для нуклеотидных последовательностей генов тРНК бактерий, растений и животных / Welsh J., McClelland M. 1991. Genomic fingerprints produced by PCR with consensus tRNA gene primers // Nucleic Acids Res. 19:861-866/. Амплификация проходит в достаточно мягких условиях: температура отжига праймеров - 50°С, количество циклов - 40. Продукты такой реакции обычно разделяются в полиакриламидном геле, а секвенирование отдельных фрагментов ДНК проводят по средствам клонирования. В бактериальных геномах гены тРНК могут располагаться кластерами, состоящими из нескольких тандемно повторяющихся единиц /Green C.J., Void В. 1993. Staphylococcus aureus has clustered tRNA genes // J.Bacteriol. 175:5091-5096; Void B. 1985. Structure and organization of genes for transfer ribonucleic acid in Bacillus subtilis // Microbiol. Rev. 49:71-80/. Такие кластеры - полицистроны - обнаружены у Bacillus, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Escherichia, Mycoplasma, Acinetobacter. Однако не у всех бактерий гены тРНК организованы в кластеры и не всегда к ним можно подобрать консенсусные праймеры. Так для симбиотических бактерий родов Rhizobium, Sinorhizobium и фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas подход tDNA-ILP неприемлем, а большинство работ по применению данного метода направлены на клинические изоляты животных и человека /McClelland M., Petersen С., Welsh J. 1992. Length polymorphisms in tRNA intergenic spacers detected by using the polymerase chain reaction can distinguish streptococcal strains and species // J.din. Microbiol. 30:1499-1504; Muto A., Andachi Y., Yuzawa H., Yamao F., Osawa S. 1990. The organization and evolution of transfer RNA genes in Mycoplasma capricolum // Nucleic Acids Res. 18:5037-5043; Ehrenstein В., Bernards A.T., Dijkshoom L., Gemer-Smidt P., Towner K.J., Bouvet P.J.M., Daschner F.D., Grundmann H. 1996. Actinetobacter species identification by using tRNA spacer fingerprinting // J.Clin. Microbiol. 34:2414-2420; Alexander S.M., Grayson Т.Н., Chambers E.M., Cooper L.F., Barker G.A., Gilpin M.L. 2001. Variation in the Spacer Regions Separating tRNA Genes in Renibacterium salmoninarum Distinguishes Recent Clinical Isolates from the Same Location // J.Clin. Microbiol. 39(1):119-128/. Welsh и McClelland шли по пути создания универсальных праймеров для всех генов тРНК, присутствующих в геномах различных про- и эукариот, однако ввиду различий в нуклеотидном составе, приводящих при мягких условиях проведения ПЦР к появлению "случайных" продуктов, становится невозможным анализировать образцы ДНК в смеси.

Достоверность тестов, основанных на анализе нуклеиновых кислот, находится в существенной зависимости от чувствительности и специфичности используемых праймеров. Следовательно, краеугольным камнем подобного рода анализов является идентификация нуклеотидных последовательностей, являющихся уникальными для интересующей группы организмов. Большинство описанных в литературе и/или коммерчески доступных тестов, основанных на использовании нуклеиновых кислот, нацелено на определение только одного отдельного организма в биологическом образце. В силу того, что большинство биологических образцов обычно могут содержать большое число разнообразных организмов, требуется проведение большого числа отдельных анализов на каждый из них. Такого рода подход очень трудоемкий и требует больших материальных и временных затрат. Вследствие этого число тестов, реально проводимых в большинстве диагностических лабораторий для анализа отдельного образца, ограничено только несколькими, направленными на определение некоторых наиболее часто встречающихся организмов. Поэтому весьма удобно было бы иметь в распоряжении систему, способную быстро, легко проводить определение большого числа различных организмов одновременно, в одной пробирке. Чем большее число организмов может быть проверено в одном и том же анализе, тем более эффективной по стоимости будет такая процедура проверки.

Задачей изобретения является способ идентификации одного микроорганизма или одновременной идентификации различных микроорганизмов в образце.

Изобретение касается нуклеотидных последовательностей hin-региона, расположенного между копиями одноименных генов тРНК-Глю (Рис.1), которые предназначены для определения микроорганизмов в биологическом образце методом амплификации, рестрикции и/или секвенирования, а также праймеров нуклеиновых кислот, предназначенных для амплификации указанного межгенного региона микроорганизмов в биологическом образце. Настоящее изобретение также касается нуклеотидных последовательностей новых межгенных регионов, на основании которых могут быть получены подобные праймеры.

Качественными характеристиками hin-региона являются: количество амплифицируемых фрагментов, отражающее число копий гена тРНК-Глю, длины и последовательности ДНК. В нуклеотидной последовательности hin-региона могут также располагаться открытые рамки считывания (ORF), т.е. наименее изменчивые участки ДНК. Такой межгенный регион представляет собой относительно короткий (примерно от 200 до 1000 пар нуклеотидов) уникальный участок ДНК, присутствующий в геноме протеобактерий в единственной копии. Нуклеотидная последовательность гена тРНК-Глю, а также количество их копий консервативны на родовом уровне у биологического объекта, а иногда группы близких родов. Одним из наиболее ценных преимуществ hin-региона является то, что его последовательность уникальна на видовом уровне, что позволяет безошибочно определять таксономическое положение изучаемого объекта (Рис.2). При этом продуктами амплификации будут один, два и три фрагмента ДНК разной длины, что свидетельствует о количестве копий одноименных генов тРНК-Глю: две, три и четыре, соответственно (Рис.3). Таким образом, синтетические ДНК-молекулы, используемые в качестве праймеров для специфической реакции амплификации, подбираются на целевые последовательности генов тРНК-Глю изучаемых родов прокариот, имеющиеся в общедоступной международной базе генетических данных NCBI (Таблица 1). Например, для бактерий рода Xanthomonas это: 5'-АСАССАСССТТТСАС-3' и 5'-CTAGACGATGGGGAC-3' для рода Rhizobium это: 5'-GGAAGAGGGGTTCGACT-3' и 5'-AGAATGAAAATCTGGTG-3' а для рода Sinorhizobium - 5'-CGATTCCCGTTGGGCGT-3' и 5'-TTCCGCCGTGAAAGGGC-3' Вышеупомянутые свойства делают возможным создание "панелей праймеров", позволяющих одновременно определить набор организмов, которые могут присутствовать в конкретном типе биологического образца.

Предложенный межгенный регион (hin-регион) обладает высокой разрешающей способностью, позволяет идентифицировать прокариотические организмы, в том числе и близкородственные, вплоть до уровня группы штаммов, а также позволяет быстро и эффективно проводить диагностику целевых биологических объектов. Это является ценным критерием для его применения в качестве метода для экспресс-идентификации биологического объекта. К преимуществам метода Hin-регион ПЦР также относятся: большая информативность hin-региона по сравнению с аналогами (16S рРНК, gyrB и другими белок-кодирующими генами), воспроизводимость и достоверность получаемых результатов, простота и быстрота в исполнении и возможность автоматизации процесса.

Кроме того, будучи фланкированными консервативными нуклеотидными последовательностями копий генов тРНК-Глю, все межгенные регионы одного (иногда группы) рода могут быть одновременно амплифицированы с помощью одной пары праймеров. С другой стороны, на основании самих последовательностей межгенных регионов могут быть получены наборы специфических праймеров или зондов, позволяющих детектировать прокариотический организм на видовом уровне или уровне группы штаммов.

Наборы праймеров к hin-региону позволяют проводить идентификацию прокариот, у которых данная последовательность фланкирована 2 и более копиями тРНК-Глю генов. В настоящий момент можно проводить идентификацию, как минимум, следующих групп или видов бактерий:

Таким образом, задачей настоящего изобретения является подбор таксон-специфичных праймеров или наборов таких праймеров, имеющих своей мишенью последовательность hin-региона и которые позволяют достоверно проводить определение и идентификацию, по меньшей мере, одного и предпочтительно более чем одного организма в биологическом объекте.

Задачей настоящего изобретения также является получение новых последовательностей hin-региона, на основании которых могут быть сконструированы таксон-специфичные праймеры.

Кроме того, принципиальная задача настоящего изобретения состоит в отборе на основании данных по последовательностям hin-региона специфичных праймеров и наборов праймеров, позволяющих проводить определение и идентификацию конкретных панелей организмов, принадлежащих общему таксону, или организмов, возможно присутствующих в образце того же типа.

Процедура подбора обычно состоит из теоретической и экспериментальной частей. Прежде всего, различные межгенные последовательности необходимо сравнить с соответствующими последовательностями "ближайших соседей" или межгенными последовательностями других микроорганизмов, возможно присутствующих в данном образце. Для этого требуется определение нуклеотидной последовательности межгенной области. На основании такого сравнения могут быть определены области несовпадения, из которых готовят праймеры с желаемыми гибридизационными свойствами. Кроме того, специфичность и чувствительность зондов необходимо проверить на большой коллекции штаммов как принадлежащихк определяемому таксону, так и к другим таксонам.

Нуклеотидный состав зонда существенен, поскольку пары оснований G-C имеют большую температурную стабильность по сравнению с парами оснований А-Т ввиду наличия между основаниями дополнительной водородной связи. Следовательно, гибриды нуклеиновых кислот с более высоким содержанием G-C будут более стабильными при высоких температурах.

Список отобранных праймеров из последовательностей hin-региона, описанных в настоящем изобретении, приведен в Таблице 1. Ниже изложены следующие определения терминов и выражений, используемых в различных воплощениях настоящего изобретения.

Термин "межгенный регион" относится к последовательности ДНК, фланкированной копиями одноименных генов тРНК.

Термин "таксон" может относиться к полному роду или подгруппе внутри рода, виду или даже внутривидовой разновидности (подвиды, серовары, патовары, биовары и т.п.).

Термин "ближайший сосед" означает таксон, о котором известно или о котором предполагается, что он наиболее близок к интересуемому организму в терминах гомологии ДНК, и который необходимо отличить от интересуемого организма.

Термин "специфичная амплификация" или "специфические праймеры" означает, что указанные праймеры амплифицируют только межгенный регион тех организмов, для которых они были разработаны, но не других организмов.

Термин "чувствительность" означает число ошибочных отрицательных результатов: т.е. чувствительность 99% предполагает, что из 100 определяемых штаммов 1 был пропущен.

Термин "специфичность" означает число ошибочных положительных результатов: т.е. специфичность 98% предполагает, что на 100 определяемых штаммов 2 оказываются принадлежащими к организмам, для определения которых данный тест не предназначался.

Термин "разрешающая способность метода" означает предельный уровень таксона, ниже которого образцы уже не могут быть различимы с использованием данного метода.

Термин "воспроизводимость" означает, что результат, полученный в серии повторностей, будет стабильным и одинаковым.

Термин "достоверность" означает согласованность результатов, полученных данным методом и альтернативными методами, при этом результаты объективно отражают свойства биологического объекта, а не носят случайный характер.

Термин "праймер" относится к одноцепочечной олигонуклеотидной последовательности ДНК, способной выступать в роли точки инициации для синтеза нуклеотидной цепи, комплементарной копируемой цепи ДНК. Длина праймера и последовательность нуклеотидов должны быть такими, чтобы обеспечивать отжиг с последующим синтезом праймер-удлиненных продуктов. Желательно, чтобы праймер содержал 15-25 нуклеотидов. Специфичная длина и последовательность праймера зависят от сложности исследуемых ДНК-мишеней, а также от таких условий использования праймера, как температура и ионная сила раствора.

Термин "Real-time ПЦР" означает реакцию амплификации с количественным и качественным определением образующихся в ходе нее продуктов.

Используемый метод амплификации представляет собой полимеразную цепную реакцию /Saiki R., Gelfand D., Stoffel S., Scharf S., Higuchi R., Horn G., Mullis K., Erlich H. 1988. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase // Science. 239:487-491/.

"Образцом" может быть любой биологический материал, взятый как из природных источников (почва, вода, растительные ткани), так и полученных в лабораторных условиях (чистые культуры клеток, в т.ч. растительные).

Определение и идентификация материала-мишени могут быть проведены с использованием одного из методов секвенирования, описанных в литературе и известных специалистам в данной области.

Перед изучением новых штаммов бактерий необходимо на представительной выборке уже идентифицированных бактерий провести «hin-регион ПЦР» и составить базу данных специфичных последовательностей для каждого вида внутри интересующего рода.

Стадии проведения анализа:

1. Выделение ДНК из биологического объекта.

2. Подбор температурных и временных условий и проведение ПЦР с парой праймеров PF и PR, специфичных для данного рода (таксон-специфичные праймеры на уровне рода). Для достижения высокой специфичности амплификации рекомендуется использовать Hot-start полимеразу. Для сокращения времени на проведение анализа можно увеличить приборную скорость нагревания и охлаждения реакционной смеси путем уменьшения ее объема (до 1-2 мкл) и перевода процесса на микроплашечный уровень с возможностью детекции продуктов амплификации в реальном времени.

3. Визуализация полученных в ходе амплификации ПЦР-продуктов hin-региона в 1.5%-ном агарозном геле или с помощью Real-time ПЦР, или с помощью проведения фрагментарного анализа на генетических анализаторах.

4. Возможным, но не обязательным является фрагментирование полученных продуктов в ходе ПЦР амплификации hin-региона при помощи ферментов рестриктаз, предпочтительно с четырехосновным сайтом узнавания, и последующее электрофоретическое разделение продуктов рестрикции в 4.0%-ном агарозном геле.

5. Ферментативная очистка продукта ПЦР при помощи щелочной алкалинфосфатазы (SAP) и Exonuclease I.

Реакционная смесь: SAP - 0,05 ед; 10× SAP-буфер - 0,35 мкл; Exol - 0,5 ед; ПЦР-продукт - 10 мкл; стерильная вода - до 20 мкл.

Температурно-временной профиль: 37°С - 30 мин, 80°С - 15 мин.

6. Прямое секвенирование с одним из таксон-специфичных праймеров.

7. Сравнение полученной последовательности ДНК с имеющейся базой данных и составление заключения.

Пример 1: Идентификация фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas

Xanthomonas spp. способны вызывать заболевания по меньшей мере 124 видов однодольных и 268 видов двудольных растений, включая наиболее важные сельскохозяйственные культуры семейств Пасленовых, Сложноцветных, Крестоцветных, Злаковых и многих других / Leyns F., Cleene M.D., Swings J.-G., Ley J.D. 1984. The host range of the genus Xanthomonas // Botanical review. 50:308-356; Vauterin L., Swings J. 1997. Are classification and phytopathological diversity compatible in Xanthomonas // J. of Industrial Microbiol. and Biotech. 19(2):77-82/. В результате внедрения индустриальной технологии растениеводства, включающей применение гибридных семян от международных производителей, распространения однородных генотипов сельскохозяйственных культур по различным регионам мира, централизованного выращивания рассады и механизированной обработки посевов, вредоносность бактериозов усиливается и расширяет границы своего распространения. Объект исследования является сложным: таксономия рода Xanthomonas представляется спорной, поскольку не существует явного соответствия между физиологическими и генетическими свойствами многочисленных клональных групп внутри этого рода, а взаимоотношения различных патовариантов внутри отдельных видов слабо изучены. Само понятие вида бактерии отличается от общей концепции вида в микробиологии ввиду того, что патогенность бактерий рода Xanthomonas на сходных растениях не доказывает их генетическую близость /Liao C.-H., Wells J.M. 1987. Association of pectolitic starins of Xanthomonas campestris with soft rot of fruits and vegetables at retail markets // Phytopatology. 77:418-422/. В связи с этим задача обнаружения, идентификации и диагностики данных фитопатогенов становится все более важной.

Изучение полиморфизма ксантомонад по референсных маркерам очень подробно было проведено Пуниной Н.В., 2009 г. /Пунина Н.В., 2009. Оценка генетического разнообразия фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas sp. и разработка молекулярных маркеров для их диагностики. Автореф. дис…. канд. биол. наук. Москва. 27 с./. По результатам исследования самым перспективным таксономическим маркером, способным составить достойную конкуренцию «золотому стандарту 16S рРНК», был признан ген гиразы Б (gyrB). Филогенетическое дерево, построенное на основе сравнения его нуклеотидных последовательностей у 113 штаммов ксантомонад, достаточно полно отражает генетическое разнообразие популяции этих фитопатогенов (рис.53). Однако оставались трудно разделяемые группы штаммов, и необходимо было предложить технику ПЦР-фингерпринтинга на внутривидовом уровне.

Hin-регион амплифицировали с помощью имеющихся родоспецифичных праймеров (прямой праймер: ACACCACCCTTTCAC, SEQ ID NO 1; обратный праймер: TCTAGACGATGGGGAC, SEQ ID NO 2), используя полимеразную цепную реакцию для следующих видов:

- X.campestris,

- X.euvesicatoria,

- X.vesicatoria,

- X.perforanse,

- X.gardneri,

- X.axonopodis,

- X.fuscans,

- X.arboricola,

- X.albilineans

Секвенирование межгенного региона выполняли с помощью метода, дидезокситерминирующего рост цепи, определяя последовательность непосредственно ферментативно очищенных ПЦР-продуктов, объединенных с праймерами.

На рис.4-32 представлены нуклеотидные последовательности межгенных регионов различных описанных выше видов Xanthomonas. Полученные нуклеотидные последовательности сравнивали между собой и с последовательностями, уже известными из доступных банков данных. Соответствующие последовательности представлены на рис.4-14. Согласно полученной картине по результатам секвенирования протестированные штаммы могли быть отнесены к одному из следующих видов или видовых групп. Протестированные штаммы, принадлежащие каждой группе, представлены в таблице 2.

Исследование нуклеотидного полиморфизма hin-региона у 39 коллекционных штаммов ксантомонад показало большую, чем у гена гиразы Б, информативность, с сохранением топологии филогенетического древа (рис.54). На основании нуклеотидных последовательностей межгенного региона штаммов Xanthomonas sp. возможно подобрать и химически синтезировать ряд таксон-специфичных праймеров для каждого вида или группы штаммов ксантомонад.

Данный результат является иллюстрацией того, что использование таксон-специфичных праймеров, относящихся к межгенному региону, может быть полезным для дифференциации различных групп штаммов, принадлежащих одному виду по результатам классических методов идентификации, и что данные праймеры могут быть использованы для определения и описания новых видов среди ксантомонад. В данном случае с помощью праймеров SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2 можно определять все штаммы Xanthomonas spp., в то время, как с помощью таксон-специфичных праймеров для рода Xanthomonas можно проводить количественное определение каждой из групп штаммов в образце, например, на платформе Real-time ПЦР.

Пример 2: Идентификация симбиотических бактерий рода Rhizobium

Известно, что клубеньковые бактерий разделяют на две большие группы - быстро - и медленнорастущие, отличающиеся по характеру метаболизма углеводов и азотистых соединений, скорости роста и др. К первой группе относятся бактерии рода Rhizobium, в который входят ризобии, характеризующиеся широкой специфичностью и способностью инфицировать разные виды бобовых культур (например, Rhizobium leguminosarum, инфицирующие горох, вику, чину, чечевицу, бобы, клевер и фасоль), а также узкой специфичностью, например симбионты клевера. Данный род представляет собой особый интерес: имея сложную таксономическую структуру, ввиду частых межвидовых рекомбинаций между различными аллелями таксономически важных генов (таких, как 16S рРНК, dnaK, nod-гены), не всегда удается адекватно классифицировать изоляты ризобии. Это приводит к необходимости получения дополнительных генетических данных / Eardly B.D., Nour S.M., van Berkum P., Selander R.K. 2005. Rhizobial 16S rRNA and dnaK. genes: mosaicism and the uncertain phylogenetic placement of Rhizobium galegae // App.and Env. Mic. 71(3): 1328-1335; Suominen L., Roos С., Lortet G., Paulin L., Lindström K. 2001. Identification and structure of the Rhizobium galegae common nodulation genes: evidence for horizontal gene transfer // Mol. Biol. Evol. 18(6):907-916; Vinuesa P., Rojas-Jiménez K., Contreras-Moreira В., Mahna S.K., Prasad B.N., Мое H., Selvaraju S.B., Thierfelder H., Werner D. 2008. Multilocus sequence analysis for assessment of the biogeography and evolutionary genetics of four Bradyrhizobium species that nodulate soybeans on the asiatic continent // App.and Env. Mic. 74(22):6987-6996/. В настоящее время для классификации, идентификации и диагностики клубеньковых бактерий применяется совокупность фенотипических, биохимических и генотипических методов. Наиболее перспективными методами изучения и диагностики являются молекулярно-биологические.

С целью создания быстрого и достоверного способа идентификации, дифференциации и изучения биоразнообразия популяционной структуры клубеньковых бактерий был предложен метод сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей их hin-региона. Такой подход позволяет быстро и эффективно проводить оценку популяции на перспективность использования отдельных симбиотических пар «микросимбионт - макросимбионт» в сельскохозяйственной практике и описывать генетическое разнообразия популяции клубеньковых бактерий с целью диагностики новых, паспортизации коммерчески ценных, выявления перспективных штаммов-продуцентов БАВ.

Hin-регион амплифицировали с помощью имеющихся праймеров (прямой праймер: GGAAGAGGGGTTCGACT, SEQ ID NO 3; обратный праймер: AGAATGAAAATCTGGTG, SEQ ID NO 4), используя полимеразную цепную реакцию для следующих видов:

- R.leguminosarum (в т.ч. bv.viceae, bv.trifolii, bv.phaseoli);

- R.phaseoli;

- R.giardinii;

- R.galegae.

Определение нуклеотидной последовательности межгенного региона выполняли с помощью генетического анализатора.

На рис.33-52 представлены нуклеотидные последовательности межгенных регионов различных перечисленных выше видов Rhizobium. Полученные нуклеотидные последовательности сравнивали между собой и с последовательностями, уже известными из доступных банков данных. Соответствующие последовательности представлены на рис.33-37. Согласно полученной картине по результатам секвенирования протестированные штаммы могли быть приписаны к одному из следующих видов или видовых групп. Протестированные штаммы, принадлежащие каждой группе, представлены в таблице 3.

Результаты электрофоретического разделения продуктов hin-регион ПЦР более 60 штаммов коллекции ризобий показали отличие данного таксономического маркера по длине. Классы hin-региона (генотипы) были выделены на основании различий в структуре и нуклеотидных последовательностях данного региона. Так, на основании различий в структуре нуклеотидных последовательностей hin-региона Rhizobium species всего было выявлено 9 видогрупп, 4 из которых внутри вида R.leguminosarum (Таблица 4). По результатам сравнения нуклеотидных последовательностей hin-региона исследуемых и типовых штаммов ризобий было подтверждено разделение на генотипы (видогруппы) по hin-региону, что соответствовало современным представлениям о таксономической структуре данного рода.

На основании нуклеотидных последовательностей межгенного региона штаммов Rhizobium spp. могут быть подобраны и синтезированы ряд таксон-специфичных праймеров для каждой интересующей группы штаммов.

С помощью праймеров SEQ ID NO 3 и SEQ ID NO 4 можно определять все штаммы Rhizobium spp., в то время как с помощью таксон-специфичных праймеров для рода Rhizobium можно проводить количественное определение каждой из групп штаммов в образце, например, на платформе Real-time ПЦР, изучая, например, состав природной популяции почвенных микроорганизмов.

Способ идентификации и дифференциации прокариотического микроорганизма, содержащего hin-регион, предусматривающий выделение и/или концентрирование ДНК, присутствующей в образце, амплификацию межгенного региона, визуализацию и секвенирование амплифицированных продуктов, а также сравнение полученных продуктов амплификации и их нуклеотидных последовательностей с известными, отличающийся тем, что в качестве межгенного региона используют нуклеотидную последовательность, расположенную между копиями генов тРНК-Глю, представляющую собой hin-регион, которую амплифицируют с помощью родоспецифичных праймеров и секвенируют, идентификацию и дифференциацию прокариотических микроорганизмов проводят при этом на основании количества, длины и нуклеотидной последовательности продуктов такой реакции, характеризующих hin-регион.