Способ выявления повреждения мембран эритроцитов



Способ выявления повреждения мембран эритроцитов
Способ выявления повреждения мембран эритроцитов
Способ выявления повреждения мембран эритроцитов
Способ выявления повреждения мембран эритроцитов

 


Владельцы патента RU 2487356:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт общей реаниматологии имени В.А. Неговского" Российской академии медицинских наук (RU)

Настоящее изобретение относится к медицине и описывает способ выявления повреждений мембран эритроцитов, при котором пробу крови подвергают воздействию электропорации вначале в прямом, а затем в перпендикулярном направлении электрического поля напряженностью 1100 В/см и длительностью импульса 6 мс и при увеличении скорости гемолиза по сравнению с нормой выявляют повреждения мембран эритроцитов. Способ позволяет повысить точность определения. 4 ил., 2 пр.

 

Изобретение относится к медицине, в частности к гематологии, к лабораторным способам выявления степени скрытого повреждения эритроцитов и изучения физико-химического состояния консервированных эритроцитов.

Наиболее известным способом изучения состояния мембраны эритроцитов является способ осмотической резистентности эритроцитов в средах с нарастающей гипотоничностью («Физиология человека» под ред. Р.Шмидта и Г.Тевса из-во год изд. том 2, стр.425). Измеряют степень гемолиза (фотометрическим методом) в зависимости от концентрации раствора хлористого натрия. У здорового человека 50% эритроцитов гемолизируются при концентрации хлористого натрия 4,3 г/л. При нарушениях структуры мембраны, обусловленных той или иной патологией организма, происходит отклонение от этого значения.

Недостатками способа являются его длительность и сложность, т.к. необходимо брать 10-20 проб и следить за их гемолизом, который может длиться до нескольких суток.

Другой известный способ определения степени повреждения эритроцитов в качестве повреждающего агента вместо хлористого натрия используют мочевину (А.С. №1220636, МПК G01N 33/49, 1986).

Указанный способ имеет те же самые недостатки, что и вышеуказанный.

Известен способ определения степени повреждения мембран эритроцитов, включающий центрифугирование исследуемой суспензии эритроцитов и определение концентрации гемоглобина в надосадочной жидкости (А.С. №1663549, МПК G01N 33Х49, 1991). В контрольном (нативном) образце суспензии эритроцитов определяют распределение клеток по объему. Осадок, полученный после центрифугирования, ресуспендируют в плазме и определяют в нем количество клеток, распределение которых идентично распределению клеток в контрольном образце. Степень повреждения в процентном выражении определяют как разность по отношению к образцу полностью лизированных клеток при - 196°C (повреждающий агент). Недостатками способа является его длительность и визуальный подсчет клеток.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ выявления повреждения мембран эритроцитов, заключающийся в том, что анализируемую пробу крови подвергают воздействию калиброванного пробойного импульсного электрического тока напряженностью 1800 В/см, длительностью импульса 6-10 мс и при увеличении скорости гемолиза по сравнению с нормой делают вывод о повреждении мембран эритроцитов.

Недостатком способа является его сравнительно невысокая точность.

Задачей изобретения является способ выявления повреждения мембран эритроцитов, позволяющий повысить точность выявления.

Поставленная задача решается способом, заключающимся в том, что анализируемую пробу крови подвергают воздействию электропорации вначале в прямом, а затем в перпендикулярном направлении электрического поля напряженностью 1100 В/см и длительностью импульса 6 мс и при увеличении скорости гемолиза по сравнению с нормой выявляют повреждение мембран эритроцитов.

Пробойному калиброванному электрическому воздействию подвергают как контрольную суспензию (нативную), так и исследуемую.

При проведении исследования в стандартных условиях, в частности при комнатной температуре (20-25°C), нет необходимости каждый раз определять электропорацию контрольной суспензии, можно сразу определять электропорацию исследуемой суспензии.

Оценку степени повреждения эритроцитов проводят на основе вычисления скорости уменьшения числа эритроцитов.

Электропорация клеток - процесс образования в мембранах сквозных пор под действием внешнего импульсного электрического поля Е. Она возникает, если наведенный трансмембранный потенциал Δφм выше некоторого критического значения потенциала пробоя мембраны Δφкр, то есть выполняется условие:

Δ ϕ м > Δ ϕ к р . ( 1 )

Величина Δφкр определяется свойствами мембраны, и в частности средним количеством повреждений, неоднородностей и других дефектов, присутствующих в ней в нормальном состоянии. В результате заболеваний структура мембран нарушается, а следовательно, увеличивается количество дефектов и величина Δφкр уменьшается.

Наведенный трансмембранный потенциал Δφм определяется величиной напряженности внешнего электрического поля:

Δ ϕ м = 1,5 r E cos Θ , ( 2 )

где r - радиус клетки; Θ - угол между радиус-вектором и вектором поля Е.

В кварцевую кювету помещены титановые электроды. Конструкция их установки позволяет располагать электроды либо вертикально (рис.2а), либо горизонтально (рис.2б). В кювету наливали 2,4 мл суспензии крови. Сопротивление суспензии R=100±5 Ом. Использовали импульс длительностью 6 мс с энергией 200 Дж, что соответствовало напряженности поля в растворе 1100 В/см.

Красные клетки крови - эритроциты имеют форму диска (дискоцит) в диаметре 7,5-8,2 мкм, по толщине 2 мкм. В зависимости от расположения клетки по отношению к вектору электрического поля на мембранах создается различный трансмембранный потенциал, в соответствии с формулой 2. Это показано на рис.1. Так клетка 1 расположена по вектору поля r=8 мкм и Δφv=660 мВ. Клетка 2 расположена поперек вектора поля, r=2 мкм, Δφм=165 мВ. Клетка 3 расположена под углом 45° к вектору поля, r=5,6 мкм, Δφм=462 мВ. Учитывая, что Δφкр=450-500 мВ, можно утверждать, что клетка 1 подвергается электропорации, на клетке 2 такой эффект невозможен, а клетка 3 может быть пробита с некоторой вероятностью (около 0,3-0,4).

При выполнении условия (1) в суспензии возникает осмотический гемолиз эритроцитов. Уменьшение количества эритроцитов, в результате их гемолиза n(t), приводит к уменьшению оптической плотности суспензии D(t). При малой концентрации раствора зависимость D(n) линейная:

D(t)=knl,

k - показатель ослабления, n - концентрация эритроцитов, l - толщина слоя суспензии.

Зависимость n(t) представляется экспоненциальной функцией вида:

n(t)=(n0-nост)ехр(-βt)+nост,

где β - константа скорости уменьшения числа эритроцитов, n0 - начальное число эритроцитов, nост - число негемолизированных эритроцитов. График D(t) называется кинетической кривой гемолиза. Зависимость D(t) регистрировали на спектрофотометре Apel PD-303 (Япония). Оценивали характерное время достижения D уровня 0,7 - Т0,7, константу скорости β уменьшения числа эритроцитов для любого заданного промежутка времени и nост.

Очевидно, что если пробой мембран осуществлять двумя последовательными взаимно перпендикулярными импульсами (рис.2), то количество пробитых эритроцитов будет больше, чем при пробое одним или двумя однонаправленными импульсами (рис.3). Следовательно, при пробое двумя последовательными взаимно перпендикулярными импульсами станет меньше число негемолизированных клеток, станет меньше величина nост. Иными словами, о качестве и количественных оценках электропорации можно судить по большей статистической популяции гемолизированных эритроцитов. Это приведет к более точной оценке разницы констант скоростей β, характерных для заболевания и после лечения, а следовательно и более точной диагностике, и более точной оценке эффективности проведенного лечения.

Пример 1.

В кювету для электропорации налили 2,4 мл суспензии контрольной крови пациента (Кр. В.В., 37 лет).

В первом опыте, на вертикально расположенные электроды подавали последовательно с интервалом 0,5 секунды два одинаковых импульса электрического поля (1100 В/см, 6 мс). Кинетическая кривая представлена на рис.3. В этом опыте β=0,058, nост=0,53.

Во втором опыте в кювету налили 2,4 мл суспензии крови того же пациента. Подавали два импульса электрического поля (1100 В/см, 6 мс) с интервалом 0,5 секунд. Первый импульс был подан на вертикальные электроды (как и в первом опыте), а второй на горизонтальные электроды. Во втором опыте: β=0,077, nост=0,21.

Таким образом, в первом опыте результат электропорации оценивался по 47% клеток, а во втором по 79%. Поэтому полученная величина константы скорости осмотического гемолиза во втором опыте имеет более точное значение.

Пример 2

Пациент (Агр. Е.П., 44 лет), диагноз: макроцитоз на фоне хронических заболеваний. Для проведения диагностических процедур с помощью электропорации отбирали пробы крови до и после лечения. Суспензию крови по 2,4 мл помещали к кювету с титановыми электродами. Эффективность лечения оценивали двумя способами: электропорацией двумя последовательными прямыми импульсами на вертикальные электороды и электропорацией двумя последовательными ортогональными импульсами. Обе эти процедуры были проведены до лечения (исходая проба) и после лечения.

Результат представлен на рис.4.

1. Два прямых импульса, исходная проба: β=0,046, nост=0,52. После лечения: β=0,027, nост=0,63.

2. Ортогональные импульсы, исходная проба: β=0,231, nост=0,17. После лечения β=0,086, nост=0,20.

Таким образом, при одном и том же заболевании одного и того же пациента в первом случае (прямые импульсы) разница констант скоростей до и после лечения Δβ=0,019, а во втором (ортогональные импульсы) Δβ=0,145. В случае оценки эффективности лечения ортогональными импульсами разница констант скоростей Δβ была в 7,63 раза больше, чем для прямых импульсов. То есть в первом случае диагностика проводилась по 48% эритроцитов до лечения и по 37% - после. Во втором случае (ортогональные импульсы) по 83% эритроцитов до лечения и по 80% - после. А именно этот показатель позволяет оценить эффективность проводимого лечения.

Представленные данные позволяют сделать вывод о том, что достигнута задача изобретения - повышение точности выявления повреждений мембран эритроцитов, что в свою очередь ведет к повышению точности диагностики.

Способ выявления повреждений мембран эритроцитов, заключающийся в том, что пробу крови подвергают воздействию электропорации в начале в прямом, а затем в перпендикулярном направлении электрического поля напряженностью 1100 В/см и длительностью импульса 6 мс и при увеличении скорости гемолиза по сравнению с нормой выявляют повреждения мембран эритроцитов.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для определения риска развития туберкулеза центральной нервной системы у ВИЧ-инфицированных больных туберкулезом органов дыхания.

Изобретение относится к области медицины, в частности к пульмонологии, для экспресс-диагностики бронхо-легочных заболеваний. .

Изобретение относится к области биохимии. .

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическим исследованиям в онкологии, и описывает способ прогнозирования возникновения рецидивов рака шейки матки, включающий биохимическое исследование суточной мочи больной, при котором в суточной моче определяют андростерон и этиохоланолон, вычисляют отношение между ними и при величине отношения 0,75 мг/сут и ниже прогнозируют рецидив болезни в первые 2 года, а при величине, превышающей 0,75 мг/сут, - длительный безрецидивный период до 10 лет и более.

Изобретение относится к области гидрометеорологии контроля окружающей среды и может быть использовано для определения концентрации нитратных соединений (взвешенных частиц) в атмосферном воздухе населенных мест.
Изобретение относится к медицине, а именно к общей хирургии, и используется для прогнозирования течения острого деструктивного панкреатита. .

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения наличия повреждений синцитиотрофобласта плаценты у беременных с герпес-вирусной инфекцией.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для ранней диагностики острого коронарного синдрома без подъема сегмента ST (ОКС без ST).

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения влияния лимфоцитов на развитие дисфункции эндотелия.

Изобретение относится к медицине, а именно кардиологии, и может быть использовано для прогнозирования течения ишемической болезни сердца. .
Изобретение относится к медицине, а именно к способу диагностики недифференцированной дисплазии соединительной ткани у лиц молодого возраста
Изобретение относится к области медицины, конкретно к методам диагностики аутоиммунных заболеваний крови человека
Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии
Изобретение относится к медицине и предназначено для дифференциальной диагностики инфекционного и алкогольного гастроэнтеритов

Изобретение относится к медицинской технике, а именно к устройствам и способам исследования биомеханических свойств крови

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для прогнозирования развития респираторных болезней у новорожденных телят

Изобретение относится к клинической иммунологии, в частности к исследованию метаболической активности фагоцитов крови

Способ относится к лабораторным методам исследования в гематологии и физиологии и применяется для оценки α- и β2-адренореактивности эритроцитов человека по изменению их осмотической резистентности под влиянием адреналина и адреноблокаторов. Сущность изобретения состоит в том, что из 0,02 мл забранной крови, разведенной в 10 раз, готовят ряд из 11 пробирок, где первая пробирка содержит 0,2 мл дистиллированной воды (ДВ) с 2,5 мМ CaCl2 (контроль); следующие пять пробирок содержат 0,2 мл ДВ, в которых помимо 2,5 мМ CaCl2 содержится адреналин в соответствующей каждой пробирке концентрации (10-10, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6 г/мл); а остальные 5 пробирок, помимо 0,2 мл ДВ, 2,5 мМ CaCl2 содержат 10-6 г/мл адреноблокаторы (атенолол и ницерголин) и адреналин в соответствующей для каждой пробирки концентрации (10-10, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6 г/мл). Далее в каждую из пробирок добавляют по 0,02 мл крови, а через 45 сек - по 0,2 мл 6% раствора NaCI в соотношении 1:1. Производят расчет числа негемолизированных эритроцитов (ЧНЭ) в каждой пробирке. Повышение ЧНЭ означает доминирование α- АР, а снижение ЧНЭ - отражает доминирование β2-АР. 7 ил., 1 табл.
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для оценки индуцирующего действия цитомегаловирусной инфекции на характер течения беременности в первом триместре гестации. Для этого в периферической крови беременных определяют титр антител к цитомегаловирусу и содержание плацентарного лактогена. Способ позволяет достоверно оценить угрозу самопроизвольного выкидыша при нарастании титра антител к цитомегаловирусу до 1:800 и снижении содержания плацентарного лактогена до 0,5 мг/л. 2 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для выбора антибиотика при лечении инфекционно-воспалительных заболеваний. Для этого проводят измерение спонтанной и модифицированной антибиотиками люцигенин-зависимой хемилюминесценции цельной крови пациента. Затем рассчитывают коэффициент антибиотической модификации (КАМ), представляющий собой отношение разности площадей под кривой хемилюминесценции с антибиотиком (SАНТ) и под кривой спонтанной хемилюминесценции (SСП) к площади под кривой спонтанной хемилюминесценции (SСП), выраженный в процентах. Для лечения инфекционно-воспалительных заболеваний отбирают антибиотики, у которых положительные или отрицательные значения КАМ по модулю не превышают 10%. При этом оптимальным антибиотиком считают тот, у которого значение КАМ по модулю наиболее близко или равно «0». В случае совпадения положительных и отрицательных значений КАМ антибиотиков по модулю предпочтение отдается антибиотику с положительным значением. Использование данного способа позволяет осуществлять оптимальный подбор антибиотиков при лечении инфекционно-воспалительных заболеваний с учетом индивидуальных иммунологических особенностей пациентов. 2 пр.
Наверх