Комплексные соединения германия с производными азотистых оснований пуринового ряда, способы их получения и содержащие их лекарственные средства
Владельцы патента RU 2487878:
ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "ВДС ФАРМА" (RU)
Изобретение относится к разработке лекарственных средств, предназначенных для профилактики и/или лечения вирусных заболеваний, вызванных, в частности, герпес-вирусами. Предложены комплексные соединения германия, имеющие общую структурную формулу (I): Gex[AD][CA]y[AA]z (I), где AD - производное азотистого основания пуринового ряда, обладающее противовирусной активностью; СА - гидроксикарбоновая кислота; АА - аминокислота, выбранная из α-аминокислот, где х=1÷2, y=2÷4, z=0÷2, при этом все СА в комплексном соединении являются одинаковыми или разными, все АА в комплексном соединении являются одинаковыми или разными. Также предложены способ получения комплексных соединений германия, лекарственное и иммуностимулирующее средство. Изобретение позволяет получить комплексные соединения германия, обладающие высокой противовирусной и иммуностимулирующей активностью. 4 н. и 14 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 табл., 7 пр.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к медицине и фармакологии, а именно к разработке лекарственных средств, предназначенных для профилактики и/или лечения различных вирусных заболеваний, в частности, вызванных герпесвирусами, а также используемых в составе комплексной противораковой и иммунотерапии.
Изобретение относится к новым комплексным соединениям германия с производными азотистых оснований пуринового ряда (нуклеозидными аналогами), гидроксикарбоновыми кислотами и, предпочтительно, аминокислотами. В частности, изобретение относится к комплексным соединениям германия с производными аденина и/или гуанина, предпочтительно используют ацикловир, валацикловир, ганцикловир, пенцикловир, видарабин и др.
Предложенные соединения обеспечивают высокий уровень биологической, в частности, противовирусной активности в отношении герпесвирусов, например вирусов простого герпеса 1 и 2 типа, включая резистентные штаммы, например, ацикловир-резистентные штампы.
Предшествующий уровень техники
В настоящее время некоторые производные азотистых оснований используются в качестве лекарственных средств для лечения и профилактики различных вирусных инфекций, в частности, инфекций, вызванных вирусом герпеса, в том числе в составе комплексной терапии при лечении ВИЧ-инфицированных и онкологических больных, а также при трансплантации органов. Например, производные гуанина используются в качестве противовирусных препаратов, в частности, для лечения инфекций, вызванных вирусом герпеса.
Герпес является наиболее распространенным заболеванием человека, возбудителем которого является вирус герпеса. Известны 8 типов герпесвирусов, среди которых наиболее известны вирус простого герпеса 1 и 2 типа (ВПГ-1 и ВПГ-2), вирус Варицелла-Зостер (ВГЧ-3), вирус Эпштейн-Барра (ВГЧ-4), цитомегаловирус (ВГЧ-5) и другие. В мире значительная часть населения заражена вирусами герпеса в виде латентной инфекции. Вирус герпеса находится в нервных клетках инфицированного человека постоянно, но клинически заболевание проявляется только в период обострения, т.е. активного размножения возбудителя. ВПГ-1 служит причиной таких заболеваний как кератит, «простуда на губах», энцефалит; ВПГ-2 вызывает инфекции гениталий; ВГЧ-3 вызывает болезни ветряной оспы и опоясывающего лишая; ВГЧ-4 является причиной инфекционного мононуклеоза; ВГЧ-5 - цитомегаловирусный гепатит, колит, пневмонит.
Для того чтобы лечить заболевания, вызванные вирусами герпеса, применяют лекарственные средства, которые при регулярном приеме способны эффективно подавлять симптомы заражения вирусом, его размножение и развитие. Широкое распространение в качестве такого средства получил ацикловир, который является производным гуанина, и который препятствует размножению вируса в клетках. Однако ацикловир эффективно препятствует размножению вирусов при использовании его в больших дозах, в частности, при приеме указанного препарата внутрь его используют в количестве до 4000 мг/сут. При этом увеличение разовой дозировки ацикловира приводит к уменьшению его биодоступности, что может вызывать медикаментозное токсическое воздействие на организм. Еще одним недостатком ацикловира является его низкая растворимость в воде: 1,3 мг/мл при 25°С и 2,5 мг/мл при 37°С, при этом ацикловир практически нерастворим в гидрофобных системах. Поэтому при приеме ацикловира внутрь существует вероятность образования мелких кристаллов в моче (Mason W.J., Nickols Н.Н., Crystalluria from acyclovir use, N. Engl. J. Med., 2008, 358: e14) и появления нефротоксичности. Кроме этого в последнее время все чаще появляются штаммы герпесвирусов, устойчивые к ацикловиру, особенно у людей со сниженным иммунитетом.
Валацикловир представляет модифицированную форму ацикловира и обладает большей эффективностью и биодоступностью: 54% против 15-20% для ацикловира. Тем не менее валацикловир, как и ацикловир, эффективен только в больших дозах 1000-4000 мг/сут.
Известны также другие производные гуанина, например пенцикловир и ганцикловир, которые обладают активностью против вирусов простого герпеса 1 и 2 типа (ВПГ-1 и ВПГ-2), вируса Варицелла-Зостер, вируса Эпштейн-Барра, цитомегаловирусных инфекций и которые используются для лечения и профилактики инфекций, вызванных этими вирусами, в том числе для лечения и профилактики лиц с ослабленным иммунитетом, например, больных СПИДом, а также онкологических больных и при трансплантации органов. Общим недостатком пенцикловира и ганцикловира, является их невысокая растворимость в воде (пенцикловира - 0,17%, ганцикловира - 0,43%,), а также низкая биодоступность (1,5% и 5% соответственно).
Противовирусные препараты должны обладать следующими свойствами:
проникать в клетку, обладать минимальной цитотоксичностью, действовать избирательно, не вызывать привыкания и не накапливаться в организме. Поэтому одно из направлений в создании новых лекарственных форм заключалось в поисках соединений, которые в сочетании с уже известными препаратами улучшают их противовирусную активность. В патенте ЕР 0477871 (1992 г., МПК А61К 31/52) раскрывается антивирусная композиция, обладающая селективной и синергетической активностью по отношению к вирусам простого герпеса 1 и 2 типа. Антивирусная композиция состоит, по крайней мере, из двух соединений, представляющих производные гуанина: оксетаноцин Г (OXT-G), ацикловир (ACV), карбоциклический оксетаноцин Г (C-OXT-G).
Было проведено изучение влияния антивирусных композиций на репродукцию вируса простого герпеса 1 и 2 типа (ВПГ-1 и ВПГ-2) в культуре клеток Vero. Монослойные культуры клеток Vero выращивали в питательной среде Игла с добавлением 10% сыворотки крови телят при температуре 37°С. После чего их заражали вирусом ВПГ-1 и ВПГ-2. Далее, в культуральную среду зараженных клеток вносили производные гуанина как в отдельности, так и в комбинациях друг с другом и определяли концентрации, которые предотвращали развитие вирусиндуцированного цитопатического эффекта на 50% ( ИД50). Показано, что композиции, состоящие из двух соединений, достигают значений ИД50 при более низких концентрациях, чем это необходимо для каждого компонента в отдельности. Например, сочетание ацикловира (0,04-0,4 мкг/мл) с оксетаноцином Г (0,4-5,4 мкг/мл) или с карбоциклическим оксетаноцином Г (0,01-0,2 мкг/мл) обеспечивает синергетический эффект по отношению к вирусу ВПГ-1, а сочетание ацикловира (0,1-3,4 мкг/мл) с оксетаноцином Г (0,4-4 мкг/мл) или с карбоциклическим оксетаноцином Г (0,04-0,54 мкг/мл) обеспечивает синергетический эффект по отношению к вирусу ВПГ-2.
В патенте РФ 2240792 (2004 г., МПК А61К 31/40) предложены композиции на основе нетропсина или его бис-производного с ацикловиром и ганцикловиром, обеспечивающие высокий уровень противовирусной активности в отношении вируса простого герпеса 1 типа (ВПГ-1).
Комбинации соединений нетропсинов с ацикловиром и ганцикловиром обеспечивают значительное усиление противогерпетического действия по сравнению с каждым из комбинируемых противовирусных веществ, взятых в отдельности. Так при сочетанном применении нетропсина (2,5 мкг/мл) и бис-нетропсина (0,15 мкг/мл) с ацикловиром, 50% ингибирование развития вирусиндуцированного цитопатического эффекта достигается при концентрации ацикловира 0,075 мкг/мл и 0,15 мкг/мл, что в 5 и 3 раза меньше, соответственно, чем при использовании только одного ацикловира (0,4 мкг/мл). Сочетание нетропсина и бис-нетропсина с ганцикловиром приводит к снижению концентрации ганцикловира в 5 раз.
В патенте США 6448227 (2002 г., МПК А61К 38/00) раскрыта смесь, содержащая S-ацетил глутатион и ацикловир, в качестве средства против вируса простого герпеса или вируса Варицелла-Зостер. Глутатион представляет трипептид γ-глутамилцистеинилглицин.
Показано, что S-ацетил глутатион является эффективным агентом против вируса простого герпеса (ВПГ-1) начиная с концентраций 0,35 мг/мл, ацикловир особенно эффективен при концентрациях 0,45 мкг/мл. Комбинация S-ацетил глутатиона и ацикловира приводит к сильному синергетическому действию против ВПГ-1. Например, если использовать S-ацетил глутатион (0,7 мг/мл) с ацикловиром (0,45 мкг/мл), то титр вируса не определяется.
Также показано, что композиции S-ацетил глутатиона (0,35 мг/мл) с тремя различными концентрациями ацикловира показывают заметный синергетический эффект против вируса Варицелла-Зостер, особенно сильный при концентрации ацикловира 0,9 мкг/мл.
В патенте РФ 2104032 (1998 г., МПК А61К 47/22) раскрыт способ усиления эффективности лекарственных средств с помощью германий-органических соединений производных герматрана. Было показано, что германий-органические соединения усиливают действие многих известных противовирусных препаратов, таких как производные адамантана (митадан, ремантадин), аналоги нуклеозидов (ацикловир, ганцикловир, видарабин, идоксуридин), производные тиосемикарбазона (метисадон), фоскарнет. Индекс лечебного действия возрастает в 4 раза при одновременном снижении токсичности препаратов и уменьшении побочных эффектов. Противовирусную активность композиций, состоящих из производных герматрана с фоскарнетом или ацикловиром, проверяли на самцах морских свинок, инфицированных простым вирусом герпеса ВПГ-2. Клинические исследования показали, что применение в композициях производных герматрана совместно с фоскарнетом или ацикловиром усиливает действие последних в 2-4 раза при лечении ВПГ-2.
В патенте ФРГ 10343365 (2005 г., МПК А61К 45/00) заявлены фармацевтические композиции ксантогенатов (дитиокарбонаты) в комбинации с противовирусными препаратами для лечения вирусных заболеваний. Ксантогенаты, особенно трициклодекан-9-ил-ксантогенат (D609), хорошо известны как вещества, обладающие противовирусной и противоопухолевой активностью.
Применение ксантогенатов в качестве противовирусных препаратов осложняется тем, что требуются высокие концентрации этих агентов для эффективного лечения живых организмов. В патенте демонстрируется, что использование производных ксантогенатов, таких как D609, в сочетании с ацикловиром приводит к усилению противовирусной активности. В присутствии низких неэффективных концентраций ксантогената, активность ацикловира на культуре клеток возрастала в 5 раз. В экспериментах на живых организмах, комбинация D609 и ацикловира обеспечивала выживание всех животных, инфицированных вирусом ВПГ-1.
Таким образом, задачу улучшения противовирусной активности известных препаратов в уровне техники предлагалось решать посредством получения антивирусных композиций, в состав которых входят несколько активных соединений, которые усиливают антивирусное действие препарата.
Авторы данного изобретения предлагают принципиально иной подход для решения задачи улучшения антивирусной активности известных соединений. По изобретению предложены комплексные соединения германия с производными азотистых оснований пуринового ряда, гидроксикарбоновыми кислотами и аминокислотами, при этом указанные комплексные соединения германия представляют собой индивидуальные химические соединения, обладающие улучшенными биофармацевтическими характеристиками, в частности, высокой растворимостью в воде по сравнению с соответствующими производными азотистых оснований, и проявляют более высокую противовирусную активность и иммуностимулирующую активность, чем соответствующие производные азотистых оснований.
Цели изобретения
Целью настоящего изобретения является предложение новых комплексных соединений германия с производными азотистых оснований пуринового ряда (нуклеозидными аналогами), гидроксикарбоновыми кислотами и, необязательно, но предпочтительно, аминокислотами, обладающих противовирусной активностью, в частности, в отношении герпесвирусов.
Другой целью изобретения является предложение новых комплексных соединений германия с производными азотистых оснований пуринового ряда (нуклеозидными аналогами), гидроксикарбоновыми кислотами и, необязательно, но предпочтительно, аминокислотами, обладающих более высокой противовирусной активностью, в частности, в отношении герпесвирусов, по сравнению с противовирусной активностью производных соответствующих азотистых оснований.
Другой целью изобретения является предложение новых комплексных соединений германия с производными азотистых оснований пуринового ряда (нуклеозидными аналогами), гидроксикарбоновыми кислотами и, необязательно, но предпочтительно, аминокислотами, которые имеют хорошую растворимость в воде.
Еще одной целью изобретения является разработка простого способа получения комплексных соединений германия с различными производными азотистых оснований пуринового ряда (нуклеозидными аналогами), различными по природе гидроксикарбоновыми кислотами, и различными по природе аминокислотами, которые устойчивы в твердом состоянии и легко могут быть переведены в водный раствор.
Другой целью изобретения является разработка такого способа получения комплексных соединений германия с производными азотистых оснований пуринового ряда (нуклеозидными аналогами), гидроксикарбоновыми кислотами и, необязательно, но предпочтительно, аминокислотами, который позволяет регулировать соотношение германия, производного азотистого основания пуринового ряда, гидроксикарбоновой кислоты и аминокислоты в комплексном соединении, то есть регулировать состав комплексного соединения.
Еще одной целью изобретения является предложение противовирусного лекарственного средства, содержащего в качестве активного компонента комплексное соединение германия с производными азотистых оснований пуринового ряда (нуклеозидными аналогами), гидроксикарбоновыми кислотами и, необязательно, но предпочтительно, аминокислотами.
Другой целью изобретения является применение комплексных соединений германия с производными азотистых оснований пуринового ряда (нуклеозидными аналогами), гидроксикарбоновыми кислотами и, необязательно, но предпочтительно, аминокислотами для получения лекарственного средства для улучшения иммунитета.
Еще одной целью изобретения является применение комплексных соединений германия с производными азотистых оснований пуринового ряда (нуклеозидными аналогами), гидроксикарбоновыми кислотами и, необязательно, но предпочтительно, аминокислотами для лечения и/или профилактики вирусных заболеваний, в частности, заболеваний, вызванных вирусом герпеса.
Краткое раскрытие изобретения
Заявленные цели достигаются тем, что предложены новые германий-органические комплексные соединения, содержащие производные азотистых оснований пуринового ряда (нуклеозидные аналоги), состав которых описывается следующей структурной формулой:
где AD - производное азотистого основания пуринового ряда, обладающее противовирусной активностью;
СА - гидроксикарбоновая кислота;
АА - аминокислота, которая может быть выбрана из различных α-аминокислот,
где х=1÷2, у=2÷4, z=0÷2,
при этом все AD в комплексном соединении являются одинаковыми или разными,
все СА в комплексном соединении являются одинаковыми или разными,
все АА в комплексном соединении являются одинаковыми или разными.
В качестве производных азотистых оснований пуринового ряда (нуклеозидных аналогов) используют производные аденина и/или гуанина, предпочтительно используют ацикловир, валацикловир, ганцикловир, пенцикловир, видарабин.
В качестве гидроксикарбоновой кислоты предпочительно используют лимонную, молочную и/или яблочную кислоту.
В качестве аминокислоты предпочтительно используют аргинин, глицин, лизин, треонин.
Комплексные соединения германия структурной формулы (I) представляют собой индивидуальные химические соединения, хорошо растворимые в воде, которые могут быть выделены в твердом виде.
Комплексные соединения германия структурной формулы (I), содержащие производные азотистых оснований пуринового ряда, проявляют высокую противовирусную и иммуностимулирующую активность.
Способ получения комплексных соединений германия структурной формулы (I) включает смешивание диоксида германия с водой для получения водной суспензии диоксида германия, добавление к полученной суспензии диоксида германия смеси гидроксикарбоновой кислоты, производного азотистого основания пуринового ряда, и необязательно, но предпочтительно, аминокислоты, нагревание полученной смеси при температуре 40-100°С в течение 3-14 часов для образования целевого продукта, удаление воды любым известным способом для получения порошкообразного продукта.
В способе по изобретению к водной суспензии диоксида германия может быть добавлена смесь нескольких различных по своей химической природе аминокислот и/или смесь различных по своей химической природе гидроксикарбоновых кислот, и/или смесь различных производных азотистых оснований пуринового ряда.
Подробное раскрытие изобретения
Получены новые германий-органические комплексные соединения, содержащие производные азотистых оснований пуринового ряда (нуклеозидные аналоги), состав которых описывается следующей структурной формулой:
где AD - производное азотистого основания пуринового ряда, обладающее противовирусной активностью;
СА - гидроксикарбоновая кислота;
АА - аминокислота, выбранная из различных α-аминокислот,
где х=1÷2, у=2÷4, z=0÷2,
при этом все AD в комплексном соединении являются одинаковыми или разными, все СА в комплексном соединении являются одинаковыми или разными, все АА в комплексном соединении являются одинаковыми или разными.
В структурной формуле (I) х может принимать значения 1 или 2, у может принимать значения 2, 3 или 4, z может принимать значения 0, 1 или 2, то есть x, у, z являются целыми числами.
В качестве производных азотистых оснований пуринового ряда (AD) используют производные аденина и/или гуанина, которые обладают противовирусной активностью, в частности, в отношении герпесвирусов. Такие производные хорошо известны в предшествующем уровне техники. Примерами таких соединений являются производные гуанина, относящиеся к цикловирам, такие как ацикловир (9-[(2-гидроксиэтокси)метил] гуанин), валацикловир (2-(гуанин-9-илметокси)этиловый эфир L-валина), ганцикловир (9-[(1,3-дигидрокси-2-пропокси)метил]гуанин), пенцикловир (9-[4-гидрокси-3-(гидроксиметил)бутил]гуанин) и др. По изобретению могут быть использованы также известные производные аденина, например, видарабин (9-β-D-рибофуранозиладенин). В уровне техники такие соединения называют также нуклеозидными аналогами. В настоящей заявке эти термины используются взаимозаменяемо.
Предпочтительно в качестве производных азотистых оснований пуринового ряда (AD) используют производные гуанина, которые обладают противовирусной активностью, в частности, в отношении герпесвирусов.
В качестве гидроксикарбоновых кислот (СА) в способе по изобретению могут быть использованы различные гидроксикарбоновые кислоты, такие как лимонная, молочная, яблочная и другие. Предпочтительно в способе используют лимонную кислоту.
В качестве аминокислот (АА) в способе по изобретению могут быть использованы любые α-аминокислоты, предпочтительными являются аргинин, глицин, лизин, треонин, наиболее предпочтительными являются аргинин и лизин.
Соединения структурной формулы (I) являются индивидуальными химическими соединениями, которые могут быть выделены в твердом состоянии виде аморфного порошка.
Индивидуальные химические соединения формулы (I) представляют собой германийорганические соединения, содержащие в одной молекуле несколько биологически активных составляющих, таких как германий и производное азотистого основания, которое проявляет противовирусную активность. Это обеспечивает предложенным соединениям высокую противовирусную и иммуностимулирующую активность. Наличие в комплексном соединении гидроксикарбоновой кислоты и аминокислоты обеспечивает соединениям высокую растворимость в воде. Кроме того, аминокислоты и гидроксикарбоновые кислоты увеличивают биологическую активность комплексных соединений формулы (I). Для получения соединений формулы (I) предложен простой способ, содержащий минимальное количество стадий.
Способ по изобретению характеризуется тем, что диоксид германия смешивают с водой для получения водной суспензии. К перемешиваемой водной суспензии диоксида германия добавляют производное азотистого основания, гидроксикарбоновую кислоту и аминокислоту или производное азотистого основания и гидроксикарбоновую кислоту. По способу может быть добавлено не одно, а несколько различных производных азотистого основания, не одна, а несколько соединений различных гидроксикарбоновых кислот, не одна, а несколько различных аминокислот. Смесь перемешивают при 40-100°С в течение 3-14 часов для получения раствора целевого продукта, затем удаляют воду любым известным способом и получают целевой продукт в виде белого аморфного порошка.
В качестве диоксида германия может быть использован диоксид германия как α-модификации, который нерастворим в воде, так и β-модификации, который растворяется в воде. Предпочтительно использовать диоксид германия α-модификации, который не растворяется в воде, и при смешивании с водой образует суспензию диоксида германия в воде.
В качестве производных азотистых оснований пуринового ряда (AD) используют производные аденина или гуанина, которые обладают противовирусной активностью, в частности, в отношении герпесвирусов. Предпочтительно по способу используют производные гуанина, относящиеся к цикловирам, такие как ацикловир (9-[(2-гидроксиэтокси)метил] гуанин), валацикловир (2-(гуанин-9-илметокси)этиловый эфир L-валина), ганцикловир (9-[(1,3-дигидрокси-2-пропокси)метил]гуанин), пенцикловир (9-[4-гидрокси-3-(гидроксиметил)бутил]гуанин). В другом осуществлении в способе по изобретению используют известные производные аденина, например, видарабин (9-β-D-рибофуранозиладенин).
В качестве гидроксикарбоновых кислот (СА) в способе по изобретению могут быть использованы гидроксикарбоновые кислоты, такие как лимонная, молочная, яблочная и другие. Предпочтительно в способе используют лимонную кислоту.
В качестве аминокислот (АА) в способе по изобретению могут быть использованы любые α-аминокислоты, предпочтительными являются аргинин, глицин, лизин, треонин, наиболее предпочтительными являются аргинин и лизин.
Соотношение германия, производного азотистого основания пуринового ряда, гидроксикарбоновой кислоты и аминокислоты в комплексном соединении германия зависит от количества указанных компонентов, которые добавляют к водной суспензии диоксида германия. Регулируя соотношение между количеством диоксида германия и количеством производного азотистого основания пуринового ряда, гидроксикарбоновой кислоты и аминокислоты, можно получать комплексные соединения с различным соотношением германия, производного азотистого основания пуринового ряда, гидроксикарбоновой кислоты и аминокислоты. При добавлении производного азотистого основания пуринового ряда к водному раствору диоксида германия в стехиометрическом соотношении, образуется комплексное соединение, в котором мольное отношение между производным азотистого основания пуринового ряда и диоксидом германия составляет 1:1. Регулируя мольное отношение производного гуанина и диоксида германия, можно регулировать соотношение между германием и производным азотистого основания пуринового ряда в полученном комплексном соединении.
Аналогичным образом можно регулировать в комплексном соединении отношение германия к гидроксикарбоновой кислоте и аминокислоте. При добавлении гидроксикарбоновой кислоты (или аминокислоты) к водному раствору с диоксидом германия в стехиометрическом соотношении, образуется комплексное соединение, в котором мольное отношение германия к гидроксикарбоновой кислоте (или аминокислоте) составляет 1:1. При добавлении удвоенного количества гидроксикарбоновой кислоты (или аминокислоты) по отношению к стехиометрическому получают комплексное соединение с мольным отношением гидроксикарбоновой кислоты (или аминокислоты) к германию 2:1.
Более детально возможность получения по изобретению комплексных соединений германия с различным соотношением германия, производных азотистых оснований пуринового ряда, гидроксикарбоновых кислот и аминокислот продемонстрирована в примерах осуществления изобретения.
Регулирование состава комплексного соединения германия по изобретению позволяет получать комплексные соединения с различным содержанием производного азотистого основания пуринового ряда. Это является важным преимуществом предложенных комплексных соединений при их использовании в качестве лекарственных средств для лечения вирусных заболеваний, поскольку позволяет получать лекарственные средства с увеличенной или уменьшенной противовирусной активностью.
Температура, при которой проводят реакцию образования целевого комплексного соединения германия с производными азотистых оснований пуринового ряда, гидроксикарбоновыми кислотами и необязательно, но предпочтительно аминокислотами, составляет 40-100°С. Предпочтительной является температура 80-100°С, более предпочтительной является температура 85-100°С.
Время проведения реакции составляет 3-14 часов. Предпочтительно время реакции составляет 5-12 часов, еще более предпочтительно 6-8 часов.
Образование германийорганического комплексного соединения контролируется по полному растворению диоксида германия (в случае использования нерастворимого диоксида германия) и образованию прозрачного раствора. Могут быть использованы любые другие методы контролирования образования продукта, например, основанные на отборе и анализе проб.
Для выделения германийорганического комплексного соединения раствор фильтруют, а затем из раствора удаляют воду любым известным методом. Для этого может быть использован любой из известных методов, например, выпаривание воды, вакуумная дистилляция при нагревании или лиофильная (сублимационная) сушка. Целевые соединения получают в виде аморфного порошка.
Производные азотистого основания пуринового ряда, гидроксикарбоновые кислоты и аминокислоты могут быть добавлены к водной суспензии диоксида германия одновременно или при последовательном введении указанных компонентов. Порядок введения компонентов не оказывает существенного влияния на получаемый целевой продукт - комплекс германия с производными азотистого основания пуринового ряда, гидроксикарбоновыми кислотами и аминокислотами, если таковые добавляют.
Одним вариантом способа является способ, в котором к водной суспензии диоксида германия добавляют гидроксикарбоновую кислоту, нагревают полученную смесь при перемешивании при 80-100°С в течение 6-10 часов до образования прозрачного раствора, затем добавляют аминокислоту и производное азотистого основания пуринового ряда, в частности, гуанина, и продолжают нагревание при 80-100°С в течение 2-3 часов, раствор фильтруют и удаляют воду для получения комплексного соединения
Другим вариантом способа является способ, в котором к водной суспензии диоксида германия добавляют аминокислоту, нагревают полученную смесь при перемешивании при 80-100°С в течение 3-5 часов до образования прозрачного раствора, затем добавляют гидроксикарбоновую кислоту и производное азотистого основания пуринового ряда, в частности, гуанина, и продолжают нагревание при 80-100°С в течение 3-5 часов, раствор фильтруют и удаляют воду для получения комплексного соединения в твердом виде.
Еще одним вариантом способа является способ, в котором к водной суспензии диоксида германия добавляют аминокислоту и гидроксикарбоновую кислоту, нагревают полученную смесь при перемешивании при 80-100°С в течение 6-8 часов до образования прозрачного раствора, затем добавляют производное азотистого основания пуринового ряда, в частности, гуанина, и продолжают нагревание при 80-100°С в течение 2-3 часов, раствор фильтруют и удаляют воду для получения комплексного соединения в твердом виде.
Еще одним вариантом способа является способ, в котором к водной суспензии диоксида германия добавляют смесь аминокислоты, гидроксикарбоновой кислоты и производного азотистого основания пуринового ряда, в частности гуанина, нагревают полученную смесь при перемешивании при 80-100°С в течение 6-12 часов до образования прозрачного раствора, раствор фильтруют и удаляют воду для получения комплексного соединения в твердом виде.
Еще одним вариантом способа является способ, в котором к водной суспензии диоксида германия добавляют гидроксикарбоновую кислоту, нагревают полученную смесь при перемешивании при 80-100°С в течение 8-9 часов до образования прозрачного раствора. Затем добавляют производное азотистого основания пуринового ряда, в частности гуанина, и продолжают нагревание при 80-100°С в течение 2-3 часов, раствор фильтруют и удаляют воду для получения комплексного соединения в твердом виде.
Полученный продукт представляет собой белый аморфный порошок, который легко растворяется в воде. Следует отметить, что большинство производных гуанина, как правило, трудно растворимы в воде (за исключением вал ацикловира). Так растворимость в воде ацикловира составляет 2,5 мг/мл при 37°С, растворимость в воде ганцикловира составляет 4,3 мг/мл при 25°С, растворимость в воде пенцикловира составляет 1,74 мг/мл при 20°С, растворимость в воде валацикловира составляет 174 мг/мл при 25°С. Аналогично, производные аденина обладают ограниченной растворимостью в воде, например препарат видарабин плохо растворим в воде и используется в виде мази. Полученные по изобретению комплексные соединения германия обладают хорошей растворимостью в воде более 25 мас.% при 20°С, т.е. более 250 мг/мл при 20°С. Высокая растворимость полученных по изобретению комплесных соединений германия позволяет получить и использовать в качестве противовирусного лекарственного средства водные растворы с высокой концентрацией этих соединений без побочных явлений нефротоксичности.
Были изучены ЯМР и ИК-спектры различных комплексных соединений германия с производными азотистого основания пуринового ряда, в частности гуанина, гидроксикарбоновыми кислотами и аминокислотами, в случае использования таковых, которые были получены в соответствии с изобретением, а также был выполнен элементный анализ этих соединений. Полученные данные свидетельствуют, что комплексные соединения германия имеют общую структурную формулу:
где AD - производное азотистого основания пуринового ряда, обладающее противовирусной активностью, СА - гидроксикарбоновая кислота, АА - α-аминокислота, где х=1÷2, у=2÷4, z=0÷2, при этом x, у, z являются целыми числами, при этом все AD в комплексном соединении являются одинаковыми или разными, все СА в комплексном соединении являются одинаковыми или разными, все АА в комплексном соединении являются одинаковыми или разными.
Ниже даны примеры получения комплексных соединений германия с производными азотистого основания пуринового ряда, в частности производными гуанина и аденина, гидроксикарбоновыми кислотами и аминокислотами, в случае использования последних. Приведенные ниже примеры служат лишь для иллюстрации способа получения предложенных комплексных соединений германия и не предназначены для ограничения изобретения только ими.
Пример 1
В круглодонную колбу, снабженную мешалкой и термометром, загружают 3,12 г (0,03 моль) α-диоксида германия и 12,6 г (0,06 моль) моногидрата лимонной кислоты и 200 мл дистиллированной воды. Суспензию перемешивают при нагревании (85-95°С) в течение 8-9 часов до образования прозрачного раствора. Затем добавляют 2,61 г (0,015 моль) аргинина и 3,38 г (0,015 моль) ацикловира и перемешивают при нагревании (85-95°С) в течение 2 часов. Далее раствор охлаждают, фильтруют и удаляют воду на роторном испарителе. Получают 19,5 г (95%) белого аморфного порошка.
Для комплексного соединения германия, полученного по примеру 1, были получены и проанализированы ЯМР и ИК-спектры, а также были получены данные элементного анализа. На рис.1. представлен 1Н ЯМР спектр в D2O комплексного соединения германия с аргинином, лимонной кислотой и ацикловиром. На рис.2 представлен ИК-спектр комплексного соединения германия с аргинином, лимонной кислотой и ацикловиром. Данные элементного анализа, полученного по примеру 1 соединения, представлены в таблице 1. Далее соединение, полученное по примеру 1, обозначают как WDS-1.
Пример 2.
В круглодонную колбу, снабженную мешалкой и термометром, загружают 3,12 г (0,03 моль) α-диоксида германия, 12,6 г (0,06 моль) моногидрата лимонной кислоты, 4,5 г (0,06 моль) глицина, 9,73 г (0,03 моль) валацикловира и 250 мл дистиллированной воды. Суспензию перемешивают при нагревании (85-95°С) в течение 10-12 часов. Образовавшийся прозрачный раствор охлаждают, фильтруют и удаляют воду на роторном испарителе. Получают 27,1 г (94%) белого аморфного порошка. Данные элементного анализа представлены в таблице 1. Далее соединение обозначают как WDS-2.
Пример 3.
В круглодонную колбу, снабженную мешалкой и термометром, загружают 3,12 г (0,03 моль) α-диоксида германия, 12,6 г (0,06 моль) моногидрата лимонной кислоты, 7,6 г (0,03 моль) пенцикловира и 250 мл дистиллированной воды. Суспензию перемешивают при нагревании (85-95°С) в течение 7-9 часов до образования прозрачного раствора. Затем добавляют 5,22 г (0,03 моль) аргинина и перемешивают при нагревании (85-95°С) в течение 2 часов. Далее раствор охлаждают, фильтруют и удаляют воду на роторном испарителе. Получают 26 г (95%) белого аморфного порошка. Данные элементного анализа представлены в таблице 1. Далее соединение обозначают как WDS-3.
Пример 4.
В круглодонную колбу, снабженную мешалкой и термометром, загружают 3,12 г (0,03 моль) α-диоксида германия, 7,14 г (0,06 моль) треонина и 250 мл дистиллированной воды. Суспензию перемешивают при нагревании (85-95°С) в течение 5-7 часов. Затем добавляют 7,65 г (0,03 моль) ганцикловира, 8,04 г (0,06 моль) яблочной кислоты и смесь перемешивают при нагревании (85-95°С) в течение 3 часов. Далее раствор охлаждают, фильтруют и удаляют воду на роторном испарителе. Получают 23,1 г (93%) белого аморфного порошка. Данные элементного анализа представлены в таблице 1. Далее соединение обозначают как WDS-4.
Пример 5.
В круглодонную колбу, снабженную мешалкой и термометром, загружают 3,12 г (0,03 моль) α-диоксида германия, 2,46 г (0,015 моль) моногидрата лизина, 12,6 г (0,06 моль) моногидрата лимонной кислоты и 200 мл дистиллированной воды. Суспензию перемешивают при нагревании (85-95°С) в течение 6-7 часов до образования прозрачного раствора. Затем добавляют 3,38 г (0,015 моль) ацикловира и перемешивают при нагревании (85-95°С) в течение 2 часов. Далее раствор охлаждают, фильтруют и удаляют воду на роторном испарителе. Получают 19,2 г (94%) белого аморфного порошка.
ЯМР и ИК-спектры полученного по примеру 5 соединения приведены на рис.3 и 4 соответственно. Данные элементного анализа представлены в таблице 1. Далее соединение обозначают как WDS-5.
Пример 6.
В круглодонную колбу, снабженную мешалкой и термометром, загружают 3,12 г (0,03 моль) α-диоксида германия и 12,6 г (0,06 моль) моногидрата лимонной кислоты и 200 мл дистиллированной воды. Суспензию перемешивают при нагревании (85-95°С) в течение 8-9 часов до образования прозрачного раствора. Затем добавляют 3,38 г (0,015 моль) ацикловира и перемешивают при нагревании (85-95°С) в течение 2 часов. Далее раствор охлаждают, фильтруют и удаляют воду лиофильной сушкой. Получают 16,9 г (94%) белого аморфного порошка. Данные элементного анализа представлены в таблице 1. Далее соединение обозначают как WDS-6.
Пример 7.
В круглодонную колбу, снабженную мешалкой и термометром, загружают 3,12 г (0,03 моль) α-диоксида германия и 12,6 г (0,06 моль) моногидрата лимонной кислоты и 200 мл дистиллированной воды. Суспензию перемешивают при нагревании (85-95°С) в течение 8-9 часов до образования прозрачного раствора. Затем добавляют 8,55 г (0,03 моль) моногидрата видарабина и перемешивают при нагревании (85-95°С) в течение 2 часов. Далее раствор охлаждают, фильтруют и удаляют воду лиофильной сушкой. Получают 20,5 г (95%) белого аморфного порошка. Данные элементного анализа представлены в таблице 1. Далее соединение обозначают как WDS-7.
| Таблица 1. | |||||||||||
| Данные элементного анализа полученных композиций. | |||||||||||
| Пример | Соединение | Формула соединения | MM | Найдено, % | Вычислено, % | ||||||
| С | H | Ge | N | С | Н | Ge | N | ||||
| 1 | WDS-1 | Ge2[Arg][Citr]4[Acv] | 1305 | 34,62 | 3,91 | 11,32 | 9,45 | 34,97 | 3,78 | 11,13 | 9,66 |
| 2 | WDS-2 | Ge[Gly]2[Citr]2[Vcv] | 927 | 37,34 | 4,73 | 7,98 | 11,86 | 37,56 | 4,56 | 7,83 | 12,08 |
| 3 | WDS-3 | Ge[Arg][Citr]2[Pcv] | 880 | 38,01 | 4,81 | 8,37 | 14,19 | 38,20 | 4,69 | 8,25 | 14,32 |
| 4 | WDS-4 | Ge[Thr]2[Mal]2[Gcv] | 830 | 35,96 | 4,84 | 8,89 | 11,68 | 36,17 | 4,73 | 8,75 | 11,81 |
| 5 | WDS-5 | Ge2[Lys][Citr]4[Acv] | 1277 | 35,56 | 3,98 | 11,49 | 7,53 | 35,74 | 3,87 | 11,37 | 7,68 |
| 6 | WDS-6 | Ge2[Citr]4[Acv] | 1130 | 33,83 | 3,27 | 12,97 | 6,03 | 34,01 | 3,12 | 12,84 | 6,19 |
| 7 | WDS-7 | Ge[Citr]2[Vdrb] | 720 | 36,51 | 3,62 | 10,17 | 9,55 | 36,70 | 3,50 | 10,08 | 9,72 |
| Arg - аргинин, Gly - глицин, Lys - лизин, Thr - треонин, Citr - лимонная кислота, Mal - яблочная кислота, Acv - ацикловир, Vcv - валацикловир, Gcv - ганцикловир, Pcv - пенцикловир, Vdrb - видарабин |
Острая токсичность
Определение острой токсичности новых соединений, полученных, в частности, согласно примерам 1, 5 и 6 проводили на нелинейных белых мышах-самцах массой 18-20 г при однократном внутрижелудочном (в/ж) введении в дозах 1000, 2000, 3000, 4000 и 5000 мг/кг 20% водного раствора по 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; и 0,5 мл на 20 г массы мыши соответственно. Введение каждого из соединений проводили в отдельности. В течение 14 дней после введения каждого из соединений не обнаружено признаков интоксикации, отставания прироста массы тела и гибели животных. В интервале исследованных доз не наблюдалось какого-либо нарушения движений животных, рефлексов и поведения. Анатомические исследования не обнаружили изменений в легких, почках, селезенке и других органах. Для мышей величина LD50 для исследованных соединений составила более 5000 мг/кг, что позволяет отнести их к IV классу опасности в соответствии с классификацией опасности веществ по степени воздействия на организм по ГОСТу 12.1.007-76 или к V классу токсичности (практически нетоксичным веществам) по Hodge, Sterner (1943).
В экспериментах также не было выявлено кожно-раздражающего, кожно-резорбтивного и сенсибилизирующего действий исследуемых веществ.
Исследуемые вещества не накапливаются в организме и не обладают кумулятивными свойствами. При внутрижелудочном введении нелинейным мышам в течение 14 дней в дозе 1000 мг/кг не было отмечено гибели животных, изменений массы тела, коэффициентов массы паренхиматозных органов (печени, почек, селезенки) у животных опытной группы по сравнению с показателями у животных контрольной группы.
Биофармацевтические характеристики
Растворимость лекарственных средств в биожидкостях ЖКТ (желудочный сок, кишечный сок) является важным биофармацевтическим свойством. Был изучен ряд биофармацевтических характеристик некоторых полученных новых соединений, в частности WDS-1 и WDS-5 в сравнении с ацикловиром. Испытание проводили согласно требованиям нормативной документации Европейского Медицинского Агентства (Guidance on the Investigation of Bioequivalence. European Medicines Agency (EMA). Committee for Medicinal Products of Human Use (CHMP), 2010).
Для этого изучали водную растворимость указанных соединений при различных значениях рН, соответствующих физиологическим жидкостям ЖКТ (желудочный сок - рН 1,2, сок двенадцатиперстной кишки - рН 4,4, сок тонкого кишечника - рН 6,8).
Одной из характеристик биофармацевтической растворимости, позволяющей описать лекарственное вещество (ЛВ) как вещество с «высокой» или «низкой» растворимостью, является отношение дозы к растворимости (Dose/Solubility Ratio, D/S). Отношение дозы к растворимости определяют по формуле: максимальная доза (D) (мг) / водная растворимость (S) (мг/мл). Если значение D/S≤250 мл, то ЛВ характеризуется "высокой" растворимостью в соответствующем водном растворе.
Важно отметить, что биофармацевтическая растворимость не является постоянной величиной для конкретного лекарственного вещества (ЛВ), а зависит от максимальной зарегистрированной дозировки ЛС немедленного высвобождения системного действия. В данных экспериментах отношение дозы к растворимости рассчитывалось на основании максимальной дозировки ацикловира, зарегистрированной к медицинскому применению в РФ в лекарственной форме - таблетки (800 мг).
Еще одним биофармацевтическим показателем является растворимость в биорелевантных средах. Это среды растворения, максимально приближенные к внутренним жидкостям человеческого организма (кишечный, желудочный сок) по химическому составу и по физико-химическим свойствам (рН, осмоляльность, буферная емкость, поверхностное натяжение). Моделирование физиологических условий достигается путем использования в составе данных сред поверхностно-активных веществ - лецитина и натрия таурохолата. Существует 2 основных вида биорелевантых сред - искусственный кишечный сок натощак (Fasted State Simulated Intestinal Fluid (FaSSIF)) и после еды (Fed State Simulated Intestinal Fluid (FeSSIF)). Различия в растворимости вещества в данных средах могут приниматься во внимание при оптимизации режима дозирования (натощак или после еды). Если максимальная дозировка лекарственного вещества полностью растворяется в 250 мл каждой из данных сред, можно говорить о его «высокой» биорелевантной растворимости.
Критерием, позволяющим оценить всасывание растворенного вещества через мембрану тонкого кишечника вещества, является проницаемость - доля вещества, проникшего через стенку кишечника. Физико-химическим свойством молекулы, вносящим наибольший вклад в ее проницаемость, является липофильность. Мерой липофильности, используемой при косвенной оценке кишечной проницаемости, является коэффициент распределения октанол-вода (partition coefficient) - логарифм отношения концентраций неионизированной субстанции в системе двух несмешивающихся жидкостей - н-октанол и вода (log Р). Косвенным критерием «высокой» (более 90%) кишечной проницаемости является следующий критерий: если коэффициент распределения log Р превышает таковой для стандартной субстанции - метопролола (для которого log Р=1,72), то кишечная проницаемость считается высокой. Полученные в экспериментах результаты представлены в таблице 2
| Таблица 2. | |||
| Биофармацевтические характеристики соединений WDS-1 и WDS-5 в сравнении с ацикловиром | |||
| Растворимость, мг/мл | |||
| среда растворения | ацикловир | WDS-1 | WDS-5 |
| рН1,2 | 3,5 | >32 | >64 |
| рН 4,4-4,5 * | 2,6 | >32 | >64 |
| рН 6,8 | 2,4 | >32 | >64 |
| FaSSIF | 1,44 | >32 | >64 |
| FeSSIF | 1,38 | >32 | >64 |
| Отношение D/S, мл | |||
| рН 1,2 | <229 | <25 | <12,5 |
| рН 4,4-4,5 * | 308 | <25 | <12,5 |
| рН 6,8 | 333 | <25 | <12,5 |
| FaSSIF | 555,5 | <25 | <12,5 |
| FeSSIF | 579,7 | <25 | <12,5 |
| Растворимость («высокая»/«низкая») | |||
| рН 1,2 | «высокая» | «высокая» | «высокая» |
| рН 4,4-4,5 * | «низкая» | «высокая» | «высокая» |
| рН 6,8 | «низкая» | «высокая» | «высокая» |
| FaSSIF | «низкая» | «высокая» | «высокая» |
| FeSSIF | «низкая» | «высокая» | «высокая» |
| Коэффицент распределения октанол-вода | |||
| Log P | -1,57 | -1,57 | -1,66 |
| * 4,4 - для исследуемых субстанций, 4,5 - для ацикловира. |
Таким образом, биофармацевтическую растворимость полученных по изобретению комплексных соединений германия можно охарактеризовать как «высокую» во всем физиологическом диапазоне рН, соответствующих значениям рН в желудке, двенадцатиперстной кишке или начальном отделе тонкого кишечника. Следует отметить, что для комплексных соединений германия по изобретению величина растворимости не только количественно, но и качественно отличается от растворимости ацикловира. Так, величина растворимости комплексных соединений по изобретению не менее чем в 10 раз превышает таковую у ацикловира, кроме того, растворимость комплексных соединений германия по изобретению является «высокой» во всем изученном диапазоне рН, тогда как растворимость ацикловира при рН 4,4-4,5 и 6,8 является «низкой».
Биорелевантная растворимость комплексных соединений германия по изобретению в обоих биорелевантных средах FaSSIF и FeSSIF является «высокой», причем в 250 мл растворяется более 10 максимальных дозировок субстанции. Поскольку растворимость в обоих биорелевантных средах является высокой, то процесс приема пищи не будет являться лимитирующим при растворении субстанции в средах ЖКТ, а при оптимизации режима дозирования следует учитывать иные факторы (например, имеется ли раздражающее действие на стенку ЖКТ, разрушение соединения при приеме пищи и т.д.).
Коэффициент распределения log Р исследованных комплексных соединений германия по изобретению ниже такового у метопролола и соизмерим по величине с коэффициентом распределения log Р для ацикловира. Таким образом, кишечную проницаемость этих соединений можно охарактеризовать как «низкую». В то же время, с учетом высокой биофармацевтической растворимости этих соединений, которая обсуждалась выше и продемонстрирована в таблице 2, следует ожидать, что биодоступность комплексных соединений германия по изобретению будет более высокой, чем биодоступность ацикловира. Однако возможно, что лимитирующей стадией попадания соединений по изобретению в системный кровоток будет процесс всасывания через стенку кишечника.
В целом, при сходной с ацикловиром липофильности комплексные соединения по изобретению имеют значительно большую биорелевантную и биофармацевтическую растворимость, что может свидетельствовать об их более высокой биодоступности.
Противовирусная активность
(А) Изучение противовирусной активности комплексных соединений германия по изобретению в экспериментах in vitro.
Противовирусную активность новых соединений германия по изобретению, в частности WDS-1 и WDS-5, изучали в экспериментах in vitro на культуре клеток почек зеленых мартышек (VERO) в соответствии с общепринятыми методиками (Гуськова Т.А., Николаева И.С., Петерс В.В. Методические указания по изучению противовирусной активности фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М. - Минздрав РФ. ЗАО ИИА Ремедиум. - 2000. - С. 274-280.
Cotarelo М., Catalan P., Sanchez-Carrillo С, Menasalvas A., Cercenado Е. et al. Cytopathic effect inhibition assay for determining the in vitro susceptibility of herpes simplex virus to antiviral agents. J. Antimicrob. Chemother., 1999. - V.44. - P.705-708.
Kruppenbacher J.P., Klass R. and Eggers H.J. A rapid and reliable assay for testing acyclovir sensitivity of clinical herpes simplex virus isolates independent of virus dose and reading time. Antiviral Res., 1994. - V.23. - P. 11-22.
Flint S.J.; Enquist W., Racaniello V.R., and Skalka A.M. (2009). Virological Methods. Principles of Virology. ASM Press).
В качестве образцов сравнения использовали ацикловир и валацикловир соответственно.
Для изучения противовирусной активности в качестве тест-вируса использовали штамм вируса простого герпеса (ВПГ) 1-го антигенного типа, высокоустойчивый к ацикловиру (штамм «L2/R»).
Критериями оценки противовирусной активности являлись: способность предотвращать развитие индуцируемого вирусами цитопатического действия и ингибировать репродукцию вирусов в культуре клеток. Исследуемые образцы вносили в составе питательной среды через 1 час после инфицирования культуры клеток определенной дозой вируса (терапевтическая схема). Оценку противовирусной активности образцов и вирус-индуцированного цитопатического действия в культуре клеток проводили ежедневно методом световой микроскопии по степени изменения морфологии клеточного монослоя. Учет результатов осуществляли на 4-е сутки после контакта клеток с инфекционным материалом, после появления выраженного (100%) цитопатического действия в контрольных пробах (позитивный контроль). Наличие противовирусной активности у образцов германий-органических соединений по изобретению оценивали по разнице титров вируса в опыте по сравнению с контролем. Титр вируса определяли по Риду и Менчу (Reed, L.J.; Muench, Н. (1938). "A simple method of estimating fifty percent endpoints". The American Journal of Hygiene 27: 493-^-97). Если разность в титрах составляла ≤1,5 lg тканевой цитопатогенной дозы, вызывающей гибель 50% клеток монослоя ТЦД50 (TCD50 - tissue culture dose causes cytopathology in 50% of cultured cells), то соединение считали обладающим низкой противовирусной активностью, при разности, равной 1,5-2,0 lg, ТЦД50 соединение считали обладающим умеренной противовирусной активностью, при разности ≥2,0 lg ТЦД50 соединение имело выраженную ингибирующую активность в отношении ВПГ.
В данном эксперименте образец ацикловира в диапазоне концентраций от 500 до 100 мкг/мл достоверно снижал инфекционную активность вируса на величину в диапазоне от 2,0 lg до 1,0 lg. Образец валацикловира в концентрации 500 мкг/мл и 250 мкг/мл достоверно снижал инфекционную активность вируса ВПГ-1 "L2/R" на 1,5 lg. Образец комплексного соединения по изобретению WDS-1 в диапазоне концентраций, эквивалентной по ацикловиру от 400 до 160 мкг/мл, достоверно снижал инфекционную активность вируса ВПГ-1 "L2/R" в интервале 3,25-1,5 lg ТЦД50. Образец комплексного соединения по изобретению WDS-5 в диапазоне концентраций, эквивалентной по ацикловиру от 400 до 160 мкг/мл, достоверно снижал инфекционную активность вируса ВПГ-1 "L2/R" в интервале 1,75-1,0 lg ТЦД50.
(В) Изучение противовирусной активности комплексных соединений германия по изобретению в экспериментах in vivo.
(а) Изучение терапевтической противовирусной эффективности соединений по изобретению.
Для оценки терапевтической эффективности соединения по изобретению WDS-1, полученного с использованием ацикловира, в in vivo эксперименте была использована модель герпетического офтальмогерпеса (кератита) кроликов (Kaufman Н.Е., Martola E.L., Dohlman С. Н. The use of 5-iodo-2 -deoxyuridine (IDU) in the treatment of herpes simplex keratitis. Arch, Ophthalmol 1962; 68:235-239). Животных заражали с помощью пипетки на предварительно скарифицированную роговицу (с последующим втиранием) культуральной жидкостью, содержащую ВПГ-1 в дозе 10 ТЦИД50 (тканевых цитопатогенных инфекционных доз, вызывающее 50% поражение клеточного монослоя (TCID50 - 50%) tissue culture infectious dose). Лечение зараженных ВПГ кроликов начинали через 48 часов после инфицирования. Препарат вводили per os 6 раз в сутки в концентрации 10 мг/мл ежедневно в течение 8 дней.
Применение соединения по изобретению WDS-1 показало выраженное положительное лечебное воздействие и приводило к статистически достоверному уменьшению выраженности клинической картины офтальмогерпеса, снижению длительности заболевания, предотвращению развития осложнения герпесвирусной инфекции глаз менигоэнцефалитом по сравнению с аналогичными показателями в контрольной группе.
На рис.5 представлена динамика течения офтальмогерпеса у кроликов. Индекс лечебного действия соединения WDS-1 составил 42,9%. В группе кроликов, получавших соединение WDS-1, уже на 2-е сутки после начала лечения отмечали снижение тяжести воспалительного процесса, приводящее к быстрому снижению выраженности клинических проявлений. Наиболее быстро препарат проявляет активность в случае лечения эпителиальных кератитов. К 13-м суткам после инфицирования наблюдалось затихание клинических проявлений. Выживаемость животных в экспериментальной группе составила 100% на фоне хорошей переносимости в сравнении с 66,7% в контроле.
При использовании соединения WDS-1 выделение вируса из смывов с глаз отмечалось у животных до 9-го дня после инфицирования, что было на 3 дня меньше, чем в группе контроля (таблица 3).
| Таблица 3. | ||||||
| Влияние соединения WDS-1 на репродукцию ВПГ-1 в образцах смывов с глаз, полученных у кроликов с офтальмогерпесом. | ||||||
| №/№ | Группа животных | Время после инфицирования, сутки / Титры вируса у животных с выделением вируса, lg ТЦД50/0,1 мл(М±м). | ||||
| 2-е | 5-е | 7-е | 9-е | 12-е | ||
| 1. | Контроль(плацебо) | 2,75±0,25 | 4,0±0,25 | 2,75±0,1 | 1,0±0.1 | 0,5±0,1 |
| 2. | «WDS-1» | 2,85±0,25 | 1,25±0,2 | 0,75±0,1 | 0,5±0,1 | 0 |
Как видно из таблицы 3, показатели титров вируса, выделенного у животных, получавших соединения WDS-1, на 5-е сутки после инфицирования были достоверно ниже титров вируса, выделенного у животных, получавших плацебо, и составили 1,25 lg ТЦД50/ОД мл и 4,0 lg ТЦД50/ОД мл соответственно. Высокие титры вируса у контрольных животных свидетельствуют о продолжении активной репродукции вируса, в том числе и в эпителии роговицы.
Результаты изучения влияния исследуемого вещества на частоту и уровень репродукции ВПГ-1 у животных с выделением вируса свидетельствуют о наличии у соединения WDS-1 специфического противовирусного действия.
(b) Изучение иммуностимулирующего действия соединений по изобретению.
Одновременно с определением влияния соединения по изобретению WDS-1 на течение экспериментальной герпетической инфекции глаз у кроликов нами проведено изучение у последних продукции специфических вируснейтрализующих антител (ВА) в реакции нейтрализации in vitro. До начала проведения эксперимента вируснейтрализующие антитела отсутствовали у всех животных. Через 14 дней после инфицирования, применение нового вещества у инфицированных животных приводило к достоверному увеличению индукции вируснейтрализующих антител (ВА). Так, у животных контрольной группы индекс нейтрализации (ИН), отражающий содержание вируснейтрализующих антител (ВА) в сыворотке крови, был равен 2,0 lg ТЦД50, в то время как у инфицированных животных на фоне применения WDS-1 составил 3,5 lg ТЦД50. Похожая тенденция наблюдалась и через 21 день наблюдений.
Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что комплексные соединения германия по изобретению обладают комбинированным механизмом противовирусного действия. Они не только проявляют ингибирующее действие на герпесвирусы, в том числе на ацикловир-устойчивые штаммы (в частности ВПГ-1 «L2/R»), но также одновременно стимулируют формирование и поддержание в течение длительного периода времени специфического гуморального иммунитета.
Комплексные соединения германия по изобретению могут быть использованы для лечения и профилактики различных инфекций, вызываемых, в частности, герпес-вирусами. Кроме того, комплексные соединения германия по изобретению могут быть использованы в качестве иммуностимулирующих средств. Вследствие комбинированного механизма действия предложенных по изобретению соединений лекарственные средства на их основе должны быть эффективны для лечения и профилактики лиц с ослабленным иммунитетом, например больных СПИДом, а также онкологических больных и при трансплантации органов.
Полученные соединения нетоксичны и обладают хорошими биофармацевтическими характеристиками, что позволяет разработать на их основе широкий спектр лекарственных средств, содержащих в качестве активного компонента предложенные по изобретению комплексные соединения германия в эффективных дозах. Лекарственные средства по изобретению могут быть выполнены в виде различных лекарственных форм: твердых (капсулы, таблетки), жидких (растворы для инъекций и приема вовнутрь, глазные капли) и мягкие (мази, гели, суппозитории) и др. и могут содержать в качестве дополнительных компонентов фармацевтически приемлемые носители и другие обычно используемые добавки.
1. Комплексные соединения германия, имеющие общую структурную формулу (I):
Gex[AD][CA]y[AA]z, (I)
где AD - производное азотистого основания пуринового ряда, обладающее противовирусной активностью;
CA - гидроксикарбоновая кислота;
AA - аминокислота, выбранная из α-аминокислот,
где х=1÷2, y=2÷4, z=0÷2,
при этом все AD в комплексном соединении являются одинаковыми или разными,
все СА в комплексном соединении являются одинаковыми или разными,
все АА в комплексном соединении являются одинаковыми или разными.
2. Комплексные соединения но п.1, где AD является производным гуанина или аденина.
3. Комплексные соединения по п.2, где производное гуанина выбрано из группы: ацикловир (9-[(2-гидроксиэтокси)метил]гуанин), валацикловир (2-(гуанин-9-илметокси)этиловый эфир L-валина), ганцикловир (9-[(1,3-дигидрокси-2-пропокси)метил]гуанин), пенцикловир (9-[4-гидрокси-3-(гидроксиметил)бутил] гуанин) или их смеси.
4. Комплексные соединения по п.2, где в качестве производного аденина выбран видарабин (9-β-D-рибофуранозиладенин).
5. Комплексные соединения по п.1, где аминокислоты АА выбраны из группы: аргинин, глицин, лизин, треонин или их смеси.
6. Комплексные соединения по п.1, где гидроксикарбоновые кислоты СА выбраны из группы: лимонная кислота, молочная кислота, яблочная кислота или их смеси.
7. Способ получения комплексных соединений германия по пп.1-6, включающий следующие стадии:
(a) смешивание диоксида германия с водой для получения водного раствора или водной суспензии;
(b) добавление к указанному водному раствору или водной суспензии
(i) по крайней мере одного соединения, являющегося производным азотистого основания пуринового ряда, обладающего противовирусной активностью, по крайней мере одной гидроксикарбоновой кислоты и по крайней мере одной аминокислоты
или
(ii) по крайней мере одного соединения, являющегося производным азотистого основания пуринового ряда, обладающего противовирусной активностью, и по крайней мере одной гидроксикарбоновой кислоты,
при этом указанные компоненты добавляют в любом порядке;
(c) нагревание полученной смеси при перемешивании при температуре 40-100°C в течение 3-14 ч;
(d) фильтрование полученного раствора;
(e) удаление воды из раствора с получением комплексного соединения.
8. Способ по п.7, в котором нагревание проводят при температуре 80-100°C, в течение 5-12 ч.
9. Способ по п.8, в котором нагревание проводят при температуре 85-100°C в течение 6-8 ч.
10. Способ по п.7, в котором нагревание при перемешивании проводят до образования прозрачного раствора.
11. Способ по п.7, в котором в качестве производного азотистого основания пуринового ряда, обладающего противовирусной активностью, используют производное гуанина и/или аденина.
12. Способ по п.11, в котором в качестве производного гуанина используют соединение, выбранное из группы: ацикловир (9-[(2-гидроксиэтокси)метил]гуанин), валацикловир (2-(гуанин-9-илметокси)этиловый эфир L-валина), ганцикловир (9-[(1,3-дигидрокси-2-пропокси)метил]гуанин), пенцикловир (9-[4-гидрокси-3-(гидроксиметил)бутил]гуанин) или их смеси.
13. Способ по п.11, в котором в качестве производного аденина используют видарабин (9-β-D-рибофуранозиладенин).
14. Способ но п.7, в котором в качестве аминокислоты используют аргинин, глицин, лизин, треопин или их смеси.
15. Способ по п.7, в котором в качестве гидроксикарбоновой кислоты используют лимонную кислоту, молочную кислоту, яблочную кислоту или их смеси.
16. Лекарственное средство, обладающее противовирусной активностью, содержащее в качестве активного компонента комплексное соединение германия по одному из пп.1-6.
17. Лекарственное средство по п.16, обладающее активностью против вируса герпеса, преимущественно против вирусов герпеса 1 и 2 типов.
18. Иммуностимулирующее средство, содержащее в качестве активного компонента комплексное соединение германия но одному из пп.1-6.
