Способ определения антител к оппортунистическим инфекциям в ликворе детей

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ определения антител к оппортунистическим инфекциям в ликворе детей. Используют диагностический набор определения антител в крови и полистирольные планшеты. Цельный ликвор в количестве 10 мкл разводят в соотношении 1:100. Пробу инкубируют при 37°С в течение 40-45 мин. Вторичную инкубацию с конъюгатом антитела проводят при 37°С-38°С в течение 55-60 мин. По изменению критического значения оптической плотности определяют наличие антител в ликворе. Способ обеспечивает определение антител у детей в небольшом отобранном объеме ликвора (10 мкл) и может найти применение в диагностике оппортунистических инфекций детей. 4 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к вирусологии, и может быть использовано для определения антител к оппортунистическим инфекциям в ликворе детей.

Хронические инфекционные болезни у детей занимают значительное место среди острых инфекционных состояний, с этой проблемой сталкиваются все врачи, в том числе педиатры.

В последние годы привлекают внимание исследователей и врачей различных специальностей, так отмечается увеличение частоты внутриутробного инфицирования (ВУИ), вызываемого герпес-вирусами, вирусами краснухи, парвовирусами В19, хламидиями, микоплазмами, токсоплазмами, грибами и стрептококками групп А и В.

Возбудители этих инфекций способны поражать различные органы и системы, формировать тяжелую патологию. Активация данных инфекций у ребенка может происходить в различных органах и системах. При ослаблении иммунитета происходит активизация значительных количеств оппортунистических микробов, соотношение «спящих» и активных смещается в сторону последних, нарастает клиническая картина. В этот момент при правильной диагностике лечение будет максимально эффективным. Знание особенностей оппортунистических инфекций помогает выбрать правильную и эффективную лечебную тактику.

Современные методы диагностики, в частности определение антител в крови методом ИФА и определение ДНК возбудителя методом ПЦР, продемонстрировали, что инфицированность людей оппортунистическими инфекциями достигает 90-99%.

Наибольшее значение для врача имеет место определения антител в центральной нервной системе, как основного показателя тяжести инфекционного процесса.

Современные уровни лабораторной диагностики позволяют выявлять большое количество возбудителей или антител к ним, маркирующих их присутствие, но не всегда позволяют характеризовать этиологическую значимость обнаруженных возбудителей, и только обнаружение в ЦСЖ возбудителя или выработанных им антител является «золотым» стандартом этиологической расшифровки заболевания.

В настоящее время известен способ определения антител к оппортунистическим инфекциям методом твердофазного иммуноферментного анализа в крови (Таранов А.Г. «Лабораторная диагностика в акушерстве и гинекологии». Справочник, Москва, 2004.) Метод позволяет при использовании аккредитованных тест-систем выявление иммуноглобулинов класса IgМ и IgG к различным вирусам в сыворотке (плазме) крови человека, однако полностью исключает использование ЦСЖ, как объекта исследования, т.е. данная тест-система имеет ограниченное использование.

Также известна методика определение антител в реакции иммуноферментного анализа для ликвородиагностики сифилиса («Приказ Минздрава РФ от 26.03.2001 №87 о совершенствовании серологической диагностики сифилиса»). Для диагностики антител к сифилису в ликворе используется тест-система, предназначенная для определения антител в крови. Однако такое определение антител возможно только при диагностике сифилиса, поскольку используется специфическая тест-система. Перенос данной схемы исследования на тест-системы, предназначенные для определения оппортунистических инфекций в ликворе - не возможен в связи с отсутствием адекватных результатов.

Наиболее близким к предлагаемому авторами способу определения антител к оппортунистическим инфекциям в ликворе детей является способ определения антител в ликворе при различных инфекциях, включающих только краснуху (H.Reiber, 1995, Lab.Med. 19:444-462 und H.Reiber, J.B.Peter 2001, J.Neurol. Sci. 184:101-122).

В настоящем способе специфические к возбудителю антитела в ликворе выявляются при помощи соответствующих тестов SERION ELISA classic IgG. В ликворной диагностике предлагают исследовать пробы сывороток в разведении 1:400, а разведение ликвора 1:2. Разведение ликвора 1:2 предполагает взятие в исследование 100 мкл цельного ликвора, а при высоких концентрациях антител в крови и ликворе наиболее подходит разбавление ликвора 1:10 - по 20 мкл ликвора на каждые 180 мкл разбавляющего буфера (=1+9). Разбавленные пробы следует тщательно перемешать и замерить в двойном анализе. Инкубация комплекса антиген-антитело проводят во влажной камере при 37°С 60 мин, а на второй стадии комплекса «антиген-антитело-конъюгат «инкубация проводится во влажной камере при 30°С 30 мин.

Однако способ обладает рядом недостатков.

1. Использование 100 мкл цельного ликвора на 1 исследование не всегда возможно из-за большого количества материала, взятого у детей, а использование менее 100 мкл не дает результата.

2. Используется только для краснухи (не полный набор инфекций).

3. Отсутствие возможности определения иммуноглобулинов класса М и А. Определяют только G, что не является этиологически значимым при острых формах инфекций или реактивации инф.

4. Дороговизна импортных тест-систем, невозможность постоянного их приобретения (таможня), следовательно, неудобство по срокам использования.

Таким образом, известный способ не обеспечивает точности определения антител к оппортунистическим инфекциям в ликворе детей.

Технический результат настоящего изобретения состоит в повышении точности определения антител к оппортунистическим инфекциям в ликворе детей, за счет оценки этиологической значимости обнаруженных возбудителей.

Этот результат достигается тем, что в известном способе, включающем образование комплекса антиген-антитело на твердой фазе полистирольных планшет иммуноферментного анализа, использование диагностических наборов определения антител в крови, согласно изобретению цельный ликвор в количестве 10 мкл разводят в соотношении 1:100, пробу инкубируют при 37°С в течение 40-45 мин, вторичную инкубацию с конъюгатом проводят при 37°С-38°С в течение 55-60 мин и по изменению критического значения оптической плотности определяют наличие антител в ликворе.

Занимаясь многие годы диагностикой оппортунистических инфекций, авторы проводили лабораторные исследования ликвора с применением уже известных аккредитованных тест-систем для определения антител к оппортунистическим инфекциям методом твердофазного иммуноферментного анализа в сыворотке (плазме) крови человека, направленные на выявление иммуноглобулинов класса IgМ и IgG к различным вирусам. Мы показали, что использование данных тест-систем оказалось возможным не только для определения иммуноглобулинов в сыворотке (плазме) крови человека, но (при изменении технических условий постановки опыта) и для определения иммуноглобулинов в ЦСЖ.

Новым является то, что в отличие от прототипа, где возможно исследование только на краснуху, использование стандартных тест-систем предполагает увеличение спектра исследований ликвора ко всем известным возбудителям, определяемым имеющимися в арсенале лаборатории тест-системами.

В педиатрической практике не всегда возможно получение от недоношенного или новорожденного ребенка 100 мкл ЦСЖ, и авторы эмпирическим путем выбрали наиболее адекватное количество исследуемого материала в минимальном объеме 10 мкл, позволяющее выявлять иммуноглобулины к искомым вирусам, что делает возможным обследование ребенка любой массы тела, необходимое врачу для установления этиологии заболевания и определения степени тяжести инфекционного процесса, поскольку проникновение вируса в центральную нервную систему является одним из неблагоприятных признаков, требующих незамедлительного медикаментозного и аппаратного вмешательства.

В отличие от прототипа, где предлагается только определение иммуноглобулина класса G, авторы имеют возможность определять иммуноглобулины класса А, М и G, которые для данных детей являются наиболее этиологически значимыми, поскольку позволяют не только установить фазу инфекционного процесса, но и связать их с материнскими антителами.

Увеличение времени инкубации на стадии образования комплекса «антиген-антитело-коньюгат» до 60 мин, в предлагаемом авторами способе, в отличие от прототипа, где предлагается инкубировать исследуемый материал 30 мин, является необходимым, поскольку авторы используют малый объем исследуемого материала (10 мкл), и увеличение времени инкубации до 60 мин создает условия для образования прочного комплекса, не подвергающегося трансформации при последующих мероприятиях при проведении исследования.

Предлагаемый способ осуществляется следующим способом. У пациента производят забор исследуемого материала (10 мкл) спиномозговую жидкость (СМЖ). При нейроинфекции неясной этиологии в диагностику включаются сразу несколько наборов тест-систем Вектор-Бест, предназначенных для диагностики антител в сыворотке (плазме) крови человека методом твердофазного иммуноферментного анализа. Одномоментно в исследовании диагностируются иммуноглобулины класса IgM и IgG к вирусу простого герпеса 1 и 2 типов, к цитомегаловирусу, к вирусу Эпштейна-Барр, к вирусу краснухи, к вирусу клещевого энцефалита, к токсоплазмозу и др.

Специфические к возбудителю антитела в ликворе (СМЖ) выявляются при помощи соотвествующих тестов - наборов реагентов, и, следуя инструкции, приложенной к набору (для сыворотки) в ликворной диагностике, мы предлагаем выбрать другие параметры постановки опыта: 1) Предварительное разбавление ликвора 1:10 (10 мкл ликвора на 100 мкл разбавляющего буфера). Разбавленные пробы тщательно перемешать.

2) Внести контрольные образцы -1 лунка - 100 мкл К (+)

- 2 лунка - 100 мкл К (-) -.

В остальные лунки внести по 90 мкл раствора для разведения сывороток и по 10 мкл предварительно разведенных ликворов - тщательно перемешать. Внесение образцов необходимо производить быстро, в течение времени не более 10 мин.

3) Планшет заклеить пленкой и инкубировать в термостате в течение 40-45 мин при температуре 37°С.

4) По окончании инкубации снять липкую пленку и с помощью промывочного устройства промыть лунки планшета 5 раз промывочным раствором. По окончании промывки остатки влаги из лунок тщательно удалить, постукивая перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге.

5) Внести во все лунки по 100 мкл коньюгата. Планшет заклеить пленкой и инкубировать в термостате в течение 55-60 мин при температуре 37°С.

6) По окончании второй инкубации удалить содержимое лунок и промыть планшет 5 раз промывочным раствором. Планшетки подсушить, постукивая по фильтровальной бумаге.

7) Внести во все лунки по 100 мкл раствора ТМБ и инкубировать в защищенном от света месте в течение 25 мин при температуре 18°С-25°С.

8) Внести во все лунки по 100 мкл стоп-реагента.

Измерить величину оптической плотности растворов в лунках стрипов на спектрофотометре вертикального сканирования в двухволновом режиме: при основной длине волны 450 нм и длине волны сравнения в диапазоне 620-655 нм.

В вирусологической лаборатории проводилось обследование 98 сывороток крови и ликвора больных с различной нейропатологией, находящихся в клинике НИИДИ. Исследования проводились при использовании цельного ликвора, взятого в объеме 10 мкл и разведенного в соотношении 1:100 с последующей инкубацией при 37°С в течение 45 мин с вторичной инкубацией при 37°С 55-60 мин.

Пример 1

В клинике НИИДИ на отделении нейроинфекций находилась больная Л.Ю. 17 лет с диагнозом рассеянный склероз № б/л 2843. При вирусологическом обследовании биологического материала больной, взятого в объеме 10 мкл (метод ИФА), были получены следующие результаты:

	Герпес 1	Герпес 1	ЦМВ	ЦМВ	Герпес 2	Герпес 6
Антитела*	IgM	IgG	IgM	IgG	IgG	IgG
1 кровь	0	0	0	0	0	-
2 кровь	0	0	1.057	0	0	-
Ликвор	0	0	1,145	0	0	1,300
* Цифровой уровень антител указан в единицах оптической плотности

Лабораторный диагноз: смешанная вирусная инфекция (ЦМВ + герпес 6 типа). Таким образом, только предлагаемый авторами способ позволяет установить наличие антител к герпесу 6 типа в ликворе, что свидетельствует о наличии сочетанной герпес-вирусной инфекции.

Пример 2

В клинике НИИДИ на отделении нейроинфекций находился больной С.А. 15 лет с диагнозом вирусная инфекция неясной этиологии № б/л 3189.

При вирусологическом обследовании биологического материала больного (метод ИФА) были получены следующие результаты:

	Герпес 1	Герпес 1	ЦМВ	ЦМВ	Герпес 2	Герпес 6
Антитела*	IgM	IgG	IgM	IgG	IgG	IgG
1 кровь	0	2,419	0	0	0	0
2 кровь	0	2,236	0	0	0	0
Ликвор	0	0,317	0	0	0	0
* Цифровой уровень антител указан в единицах оптической плотности

Лабораторный диагноз: герпес 1 типа с проникновением вируса в ЦНС.

Метод позволил констатировать проникновение антител к герпесу 1 типа в ЦНС и дал возможность прогнозировать тяжесть инфекционного процесса.

Пример 3

В клинике НИИДИ на отделении нейроинфекций находился больной Р.Д. 7 лет с диагнозом серозный менингит неясной этиологии.

При вирусологическом обследовании биологического материала больного (метод ИФА) были получены следующие результаты:

	Герпес 1	Герпес 1	ЦМВ	ЦМВ	Герпес 2	Герпес 6
Антитела*	IgM	IgG	IgM	IgG	IgG	IgG
1 кровь	0	0	0	0	0	0,496
2 кровь	0	0	0		0	0,469
Ликвор	0	0	0	0	0	0,507
* Цифровой уровень антител указан в единицах оптической плотности

Лабораторный диагноз: серозный менингит, этиологически связанный с вирусом герпеса 6 типа, являющимся нейротропным вирусом и подтверженным нашим методом.

Сравнительная таблица использования тест-системы прототипа (тест-система Serion Elisa classic IgG) и предлагаемого авторами способа (Тест-система Вектор-Бест для определения антител класса IgG) для определения антител в ликворе (n=84 чел).

Нозологическая форма	Ликвор в объеме 100 мкл	Ликвор в объеме 10 мкл
Краснуха (прототип)	+*	-
Краснуха (предложенный способ)	+	+
ЦМВ (прототип)	-	-
ЦМВ (предложенный способ)	+	+
Герпес 6 типа (прототип)	-	-
Герпес 6 типа (предложенный способ)	+	+
Герпес 2 типа (прототип)	-	-
Герпес 2 типа (предложенный способ)	+	+
• Обнаруживались антитела класса IgG

Способ имеет большую медико-социальную значимость, отличается простотой и доступностью, не требует дорогостоящих тест-систем и оборудования. Основным преимуществом данного способа является возможность точного обнаружения проникновения вируса в ЦНС и в дальнейшем прогнозировать не только течение болезни, но и ее исход.

Предлагаемый авторами способ определения антител к оппортунистическим инфекциям в ликворе детей может стать не только общедоступным, но и экспрессным, поскольку используемые тест-системы отечественного производства в пересчете на одно исследование не являются затратными и обеспеченность данными тест-системами любой вирусологической лаборатории, занимающейся иммуноферментным анализом, налажена во всех регионах России.

Способ определения антител к оппортунистическим инфекциям в ликворе детей, включающий образование комплекса антиген-антитело на твердой фазе полистирольных планшет иммуноферментного анализа, с использованием диагностических наборов определения антител в крови, отличающийся тем, что цельный ликвор в количестве 10 мкл разводят в соотношении 1:100, пробу инкубируют при 37°С в течение 40-45 мин, вторичную инкубацию с конъюгатом проводят при 37-38°С в течение 55-60 мин и по изменению критического значения оптической плотности определяют наличие антител в ликворе.