Штамм rhodococcus fascians, используемый для разложения нефти
Владельцы патента RU 2489483:
Федеральное государственное унитарное предприятие "Всероссийский нефтяной научно-исследовательский геологоразведочный институт" (ФГУП "ВНИГРИ") (RU)
Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, разрушающих нефть. Штамм Rhodococcus fascians 4-Г, выделенный из загрязненной мазутом почвы, отобранной с территории котельной, расположенной в поселке Горелово Ленинградской области, депонирован в Ведомственной Коллекции Полезных Микроорганизмов Сельскохозяйственного Назначения Россельхозакадемии (RCAM) (ГНУ ВНИИСХМ) под номером RCAM01140 и может быть использован для очистки загрязненных почв от нефти. Изобретение позволяет повысить качество очистки почв от нефти. 3 табл.
Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, разрушающих нефть, и которая может быть использована для очистки загрязненных почв.
Известен штамм Rhodococcus erythropolis для разложения нефти и нефтепродуктов (Патент РФ 2257409, МКИ C12N 1/20, В09С 1/10, опубл. 2004). Штамм депонирован как Rhodococcus erythropolis ВКПМ AC-1668. Штамм выделен из образца загрязненной нефтью почвы Республики Башкортостан, растет на многих натуральных и синтетических средах и обладает сравнительно высокой скоростью утилизации нефти и нефтепродуктов.
Следует отметить, что существенным недостатком рассматриваемого штамма является то, что данный микроорганизм не обладает способностью к биологическому окислению «тяжелых» и ароматических углеводородов и других видов вредных химических соединений, таких как спирты, альдегиды, технические масла, жиры и др.
Известен консорциум штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов Rhodococcus erythropolis IT BKM Ac-1769 и Pseudomonas fluorescens BKM В-6847 (Патент РФ 2428471, C12N 1/26, C02F 3/34, В09С 1/10, опубл. 2010), входящих в состав экобиопрепарата «Центрум-MMS», предназначенного для очистки от загрязнителей углеводородной природы, в первую очередь от нефти и горючесмазочных веществ и позволяющего повысить эффективность очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов.
Однако недостатком данного изобретения является то, что культивирование микроорганизмов различной таксономической и видовой принадлежности, а также различающихся по скорости роста, субстратной специфичности, температурному оптимуму роста приводит к их конкурентной борьбе и снижает их выживаемость, и как следствие усложняет и делает процесс выращивания более материально и энергозатратным.
Задачей данного изобретения является расширение арсенала средств и получение нового штамма, характеризующегося высокой скоростью утилизации нефти.
Для достижения поставленной задачи предложен штамм Rhodococcus fascians (4-Г), выделенный из загрязненной мазутом почвы, отобранной с территории котельной, расположенной в поселке Горелово, Ленинградской области. Штамм депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM) под номером RCAM01140.
Выделение штамма осуществлялось путем культивирования исходного образца загрязненной мазутом почвы в жидкой минеральной среде с добавлением углеводородов с последующим рассевом на мясопептонный агар (МПА) для получения изолированных колоний.
Идентификация штамма была осуществлена на основании изучения его культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик в соответствии с описанием, данным в определителе бактерий Bergey (Bergey's. Manual of Systematic Bacteriology. 1986. 8th ed V.2. Baltimore-Londone, William & Wilkins), а также на основании изучения последовательности генов 16S рРНК.
Культивирование в лабораторных условиях производилось на питательных средах следующего состава:
1) среда МПА (сахароза - 5,0 г/л; глюкоза - 5,0 г/л; МПА - 50 г/л; агар-агар - 8,0 г/л), рН среды 7,3-7,5 до стерилизации;
2) минеральная среда с С14-С17 для сохранения практической ценности культуры: (K2HPO4 - 0,5 г/л; KH2PO4 - 0,5 г/л; MgSO4 - 0,3 г/л; NH4H2PO4 - 1,0 г/л; пептон - 2,0 г/л; агар-агар - 15,0; после внесения среды в пробирки до стерилизации наслаиваем ~0,8 мл фракции жидких углеводородов С14-С17), рН среды 7,1-7,2 до стерилизации.
Условия выращивания: на среде МПА 96 часов при 28ºС, на минеральной среде с углеводородами 96-120 часов при 28ºС.
Хранение штамма производят при периодическом пересеве на свежеприготовленные среды 1 раз в 3 месяца.
По морфологическим признакам штамм характеризуется как грамположительная палочка с закругленными концами размером (0,6-0,7)×(1-1,5) мкм, спор не образует, неподвижная.
Штамм Rhodococcus fascians 4-Г характеризуется следующими культурально-морфологическими особенностями. Колонии ярко-оранжевые, округлые, непрозрачные, выпуклые, мелкие с ровными краями, растет при 37ºС, растет при рН 5-6, растет в присутствии 1-4% NaCl, 1% лактата натрия, в присутствии LiCl, NaBr, К2ТеО3, обладает уреазой. Строгий аэроб. Реакция Фогеса-Проскауэра - отрицательная.
Данный штамм характеризуется следующими биохимическими характеристиками. Утилизирует стахиозу, D-раффинозу, α-D-лактозу, D-мелибиозу, D-фруктозу, D-галактозу, D-серин, D-сорбитол, D-маннитол, D-арабитол, глицерин, пектин, D-глюконовую кислоту, хиннойную кислоту, D-сахарную кислоту, L-молочную кислоту, лимонную кислоту, L-яблочную кислоту, бром-янтарную кислоту, β-гидрокси-D,L-масляную кислоту, α-кето-масляную кислоту, ацетоуксусную кислоту, пропионовую кислоту, уксусную кислоту, твин-40, является чувствительным к азтреонаму.
Применение на практике данного штамма обусловливается его физиолого-биохимическими особенностями. Штамм предназначен для ликвидации последствий загрязнения почвы нефтью.
Ниже приведены примеры биологического окисления нефти штаммом Rhodococcus fascians 4-Г.
Подготовленная для опытов садово-огородная почва была расфасована по 1,5 кг в лабораторные батарейные стаканы емкостью 5 литров каждый.
Загрязнение почвы нефтью осуществлялось непосредственно в стаканах. В качестве загрязнителя была выбрана нафтеново-ароматическая нефть, качественный состав которой приведен в Табл. 1. Навеска нефтяного загрязнителя в почву вносилась весовым методом и составляла ~30 г, или ~2,0 вес.% на почву. Стаканы с нефтезагрязненной почвой выдерживались в условиях лаборатории с периодическим рыхлением. Это способствовало более равномерному распределению нефтяного загрязнителя в почве и, по возможности, испарению его легких фракций.
В Табл.1 представлены результаты химико-битуминологического анализа средней пробы почв, загрязненных нефтью, вес.%. Нефть - нафтеново-ароматическая тяжелая нефть месторождения «Русское».
Экспериментальная оценка способности штамма микроорганизмов биодеградировать нефть и дизельное топливо проводилась в лабораторных условиях. В подготовленные почвенные образцы, предварительно расфасованные по 1,5 кг в лабораторные батарейные стаканы емкостью 5 литров каждый, и загрязненные нефтью вносили культуру микроорганизмов с титром 105-108 кл/мл.
Маточную культуру бактерий Rhodococcus fascians 4-Г выращивали на качалке (200 об/мин) при 28ºС в течение 48-72 часов в колбах со 100 мл одной из сред следующего состава, вес.%:
1. Пептон-1%
K2HPO4 - 0,15%
MgSO4 - 0,15%
Глицерин - 1%
Вода водопроводная - остальное до 100%
рН до стерилизации 7,6
2. Мясопептонный бульон с глюкозой (0,5 вес.%) и сахарозой (0,5 вес.%).
рН до стерилизации 7,6.
Опыты проводились при комнатной температуре (в среднем 18-20ºС) в течение 91 суток с периодическим перемешиванием и увлажнением по мере высыхания почвы. Увлажнение производилось стерильной водой; примерно раз в 3 недели увлажнение осуществлялось минеральной средой, содержащей К, Р, N и имеющей рН до стерилизации 7,1-7,2. Почва в контрольных опытах увлажнялась только стерильной водой.
Учет численности живых клеток микроорганизмов в эксперименте проводился общепринятым методом предельных разведении на элективных средах.
Мониторинг происходящих процессов очистки нефтезагрязненной почвы выполнялся по следующим параметрам:
- содержание нефтепродуктов, мг/кг.
- содержание и качественный состав хлороформенного экстракта.
Периодичность отбора почвы на эти виды анализов составляла, как правило, 2 недели; анализ проводился согласно ГОСТу 17.1.4.01-80 и РД 52.18.575-96.
В Табл.2 приведены результаты проведенного мониторинга - содержание нефтепродуктов (НП), вес.% от первоначального содержания в почве при очистке штаммом загрязнения, состав которого приведен в Табл.1. Дано в вес.% относительно их исходного содержания в нефтезагрязненной почве.
| Таблица 2 | ||||||
| Содержание нефтепродуктов (НП) в загрязненной почве в процессе очистки штаммом Rhodococcus fascians 4-Г | ||||||
| Загрязнитель | Содержание НП, вес.% от первоначального содержания в почве | |||||
| Продолжительность очистки, недели | ||||||
| 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 13 | |
| Нефтепродукты | ||||||
| Нефть | 0,0 | -27,3 | -40,0 | -48,3 | -57,7 | -60,5 |
Согласно данным Табл.2, за 13 недель продолжительности опыта содержание нефтепродуктов в загрязненных образцах почвы снижается на 60,5% от первоначального их содержания. Снижение содержания нефтепродуктов в образцах, загрязненных нефтью, наблюдается со 2 недели от начала постановки опытов.
В Табл.3 приведено содержание и качественный состав ХБА нефтезагрязненной почвы по образцам Табл.1 через 91 сутки от начала опытов очистки штаммом Rhodococcus fascians 4-Г.
Данные качественного состава ХБА - (хлороформенного битумоида α) образцов загрязненной почвы до очистки, представленные в Табл.1, в сравнении с данными по опытным образцам, представленными в Табл. 3, позволяют сделать анализ характера изменения группового и углеводородного состава хлороформенного битумоида α в процессе биологического окисления штаммом Rhodococcus fascians 4-Г.
Согласно результатам анализа, содержание ХБА в опытных образцах нефтезагрязненной почвы 1,92% при продолжительности опытов 91 сутки. Резко изменился и качественный состав ХБА опытного образца почвы, по сравнению с доопытным составом ХБА. Через 91 сутки после начала опытов по утилизации нефтяного загрязнения почвы отмечается снижение наиболее доступных для микроорганизмов его фракций. Наиболее доступной для биоокисления в составе нефтяного загрязнения является фракция масел. Содержание масел снизилось до 42,50% отн.
Исходя из представленных выше данных, следует, что штамм Rhodococcus fascians 4-Г RCAM01140 характеризуется высокой эффективностью в процессах утилизации нефти, и как следствие может быть использован для биологической очистки почв от данного загрязнителя.
Также следует отметить, что рассматриваемый штамм Rhodococcus fascians 4-Г RCAM01140 углеводородокисляющего микроорганизма, может быть использован в процессах биологического окисления нефтепродуктов, например дизельного топлива. Основанием для этого заключения является то, что в состав дизельного топлива и других нефтепродуктов, также как и в состав нефтей входят различные классы углеводородов, которые подвергаются биологической деградации микроорганизмами.
Штамм Rhodococcus fascians, депонированный в Ведомственной Коллекции Полезных Микроорганизмов Сельскохозяйственного Назначения Россельхозакадемии (RCAM) (ГНУ ВНИИСХМ) под регистрационным номером RCAM 01140 и используемый для разложения нефти.
