Способ определения адгезии staphylococcus spp. к фибронектину и фибриногену

Авторы патента:

C12Q1/14 - стрептококки; стафилококки

Владельцы патента RU 2490329:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Роспотребнадзора (RU)

Изобретение относится к области микробиологии. Предложен способ количественного определения адгезии Staphylococcus spp. к фибронектину и фибриногену, в ходе которого исследуемую культуру стафилококка инкубируют в лунках полистиролового планшета с отдельно иммобилизованными белками фибронектином, фибриногеном в жидкой среде 199 в течение 60±15 минут, далее удаляют не адгезированные бактерии трехкратной отмывкой средой 199 с твин-20 и определяют количество адгезированных стафилококков или путем учета выросших клеток в питательной среде по оптической плотности среды, или путем подсчета клеток, высеянных на плотную питательную среду из серии десятикратных разведений, или путем определения активности бактериальных ферментов у адгезированных штаммов. Благодаря хорошей воспроизводимости результатов, высокой чувствительности, удобству проведения реакции непосредственно в лунках планшета и возможности определения показателя специфической адгезии штаммов к фибронектину и фибриногену изобретение может быть использовано в медицинской бактериологии для количественной оценки адгезивных свойств стафилококков к белкам человека фибронектину (Fn) и фибриногену (Fb) для характеристики вирулентных свойств in vitro по уровню специфической адгезии к данным белкам. 3 табл., 3 пр.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в медицинской бактериологии для количественной оценки адгезивных свойств стафилококков к белкам человека фибронектину (Fn) и фибриногену (Fb), для характеристики вирулентных свойств in vitro no уровню специфической адгезии к данным белкам.

Вирулентные виды стафилококков, в частности патогенный вид S. aureus, экспрессируют на поверхности микробной клетки рецепторы к фибронектину и фибриногену.

Прототипом данного изобретения является "Способ определения адгезии Staphylococcus spp. к гемопротеинам" (патент на изобретение №2393229 от 27.06.2010, приоритет от 29.12.2008 г.).

Отличительной особенностью данного способа от прототипа является определение адгезии к двум протеинам и определение уровня специфической адгезии к этим белкам в сравнении с контролем (неспецифической адгезии к полистиролу). Данный способ адгезии не требует поддержания условий и расходных реагентов, необходимых для работы с клеточными культурами тканей, на модели которых проводится оценка адгезии условно-патогенных бактерий, которые предложены в качестве подобных способов определения адгезии, например, Способ определения адгезии Streptococcus pneumoniae путем контакта срезов легких мышей с пневмококком (RU, (21) 96100972 МПК C12Q 1/14, 1/20. (22) 1996.01.16. (54) Способ определения адгезии Streptococcus pneumoniae и ее блокирования.

Целью заявленного изобретения является разработка стандартизуемого способа, позволяющего количественно определять показатель специфической адгезии стафилококков к белкам человека (фибронектину и фибриногену) для характеристики их вирулентного потенциала.

Сущность изобретения состоит в том, что исследуемую культуру стафилококка инкубируют в лунках полистиролового планшета с отдельно иммобилизованными белками фибронектином, фибриногеном и в лунках, не содержащих иммобилизованных белков, в жидкой среде 199 в течение 60±15 минут, далее удаляют не адгезированные бактерии трехкратной отмывкой средой 199 с твин-20 и определяют адгезированные стафилококки:

1) путем учета выросших клеток в питательной среде по оптической плотности среды, или

2) путем подсчета клеток, высеянных на плотную питательную среду из серии десятикратных разведений, или

3) путем определения активности бактериальных ферментов у адгезированных штаммов.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа количественной оценки специфической адгезии к фибронектину и фибриногену, характеризующегося хорошей воспроизводимостью результатов, высокой чувствительностью, удобством проведения реакции непосредственно в лунках планшета и возможностью определения показателя специфической адгезии штаммов к фибронектину и фибриногену.

Преимущества заявленного к патентованию способа определения адгезии Staphylococcus spp. к фибронектину и фибриногену является определение показателя специфической адгезии штаммов стафилококка, принадлежащих к различны вирулентным или авирулентным типам к данным белкам человека, высокая чувствительность способа за счет регистрации ферментативной активности адгезированных бактерий.

Способ осуществляется следующим образом: суспензию культуры стафилококка в концентрации 1 млн. м.т./мл инкубируют в лунках полистиролового планшета с отдельно иммобилизованными фибронектином и фибриногеном, а также в лунках полистиролового планшета, не содержащих иммобилизованные белки, в жидкой питательной среде 199 в течение 1 часа, далее удаляют неадгезированные бактерии трехкратной отмывкой средой 199 с твин-20 и последующим определением количества адгезированных стафилококков путем учета выросших клеток в питательной среде, или путем подсчета клеток, высеянных на плотную питательную среду из серии десятикратных разведении, или путем определения активности бактериальных ферментов у адгезированных штаммов. Адгезивная активность выражается в условных единицах.

На базе лаборатории иммунологии и микробиологии ФБУН «КНИИЭМ» Роспотребнадзора проведен анализ адгезивности клинических изолятов стафилококков, выделенных со слизистой носа, кожи и из мокроты пациента с очаговой бронхопневмонией (штамма S. aureus И-78) и эталонного штамма S. aureus ATCC №25923 патентуемым способом. Было установлено, что клинические штаммы золотистого стафилококка, выделенные со слизистой носа, кожи и мокроты пациента с очаговой бронхопневмонией, характеризуются достоверно высокими показателями адгезии к данным протеинам по сравнению со штаммами, выделяемыми с поверхности кожи и слизистых в норме.

Примеры осуществления способа определения адгезии staphylococcus spp. к фибронектину и фибриногену:

Пример 1. Определение адгезивной способности стафилококков, выделенных со слизистых, кожи и мокроты при воспалительных процессах. Исследуемую культуру стафилококка разводили до концентрации 1 млн м.т. на 1 мл 199 средой и вносили в объеме 200 мкл в лунки полистиролового 96-луночного планшета с иммобилизованным фибронектином (Fn), фибриногеном (Fb), и в лунки полистиролового планшета, не иммобилизованные белками (К-контроль), инкубировали в термостате при 37°С в течение 1 часа, далее удаляли содержимое лунок и отмывали трехкратно 199 средой, содержащей 0,05% твин-20, и физиологическим раствором, лунки осушали и в каждую лунку вносили по 150 мкл субстратного раствора (0,03% раствор H₂O₂), через 10 минут вносили 50 мкл 4% раствора молибдата аммония и исследовали фотометрически при 414 нм на малогабаритном фотометре для иммуноферментного анализа АИФР-01 «Униплан», определяли показатели: ОП (Fn), ОП (Fb) и ОП (К) контроль. Параллельно трем пробам определяли фоновую оптическую плотность - ОП (Ф), для этого в лунки полистиролового планшета, не иммобилизованные белками, не вносили пробы культуры стафилококка, а добавляли 150 мкл субстратного раствора (0,03% раствор H₂O₂) и 50 мкл 4% раствора молибдата аммония, фотометрировали при 414 нм. Установка на ноль фотометра проводилась по лункам, содержащим 150 мкл дистилированной воды и 50 мкл 4% раствора молибдата аммония.

Расчет показателя адгезии штаммов проводили по формуле:

ПА (Fb)=(ОП (Fb)-ОП (К))-ОП (Ф) - показатель специфической адгезии к фибриногену.

ПА (Fn)=(ОП (Fn)-ОП (К))-ОП (Ф) - показатель специфической адгезии к фибронектину.

Результаты испытания адгезии клинических штаммов стафилококков и эталлоного штамма S. aureus ATCC №25923 данным способом представлены в таблице 1.

Пример 2. Определение адгезивной способности стафилококков проводили аналогично примеру 1, но для определения количества адгезированных клеток после этапа отмывки в каждую лунку планшета вносили эту же среду с глюкозой, инкубировали в течение 5 часов в термостате при 37°С. После инкубации лунки фотометрировали при 595 нм на малогабаритном фотометре для иммуноферментного анализа АИФР-01 «Униплан». Определяли показатели оптической плотности, в исследуемых лунках: ОП (Fn), ОП (Fb) и ОП (Ф) - оптическую плотность в лунке, в которую клеточная культура не вносилась. Показатель адгезии (ПА) рассчитывали по формуле:

ПА(Fn)=(OП(Fn)-ОП(К))-ОП(Ф)

ПА(Р)=(ОП(Pb)-ОП(К))-ОП(Ф)

Результаты представлены в таблице 2.

Пример 3. Определение адгезивной способности стафилококков проводили аналогично примеру 1, но для определения количества адгезированных клеток после этапа отмывки средой 199 с твином-20 в каждую лунку планшета вносили эту же среду с глюкозой, инкубировали в течение 5 часов в термостате при 37°С. После инкубации в термостате из лунки отбирали по 50 мкл питательной среды, готовили десятикратные разведения на стерильном физиологическом растворе и из каждого разведения высевали методом газона на кровяной агар. Через 12 часов подсчитывают количество колоний на чашках и рассчитывают количество КОЕ/мл в соответствии с разведением. Результаты исследования адгезии изолятов стафилококка представлены в таблице 3.

Таблица 1
Показатели адгезии штаммов стафилококка, к примеру 1
Вид микроорганизма	ПА(Fn), М±m	ПА(Fb), М±m
S. aureus (со слизистой носа носителей)	0,81±0,07	0,52±0,06
S. aureus (кожа пациентов с АтД)	0,9±0,06	0,76±0,05
S. aureus (со слизистой пациентов с CAP)	0,73±0,05	0,63±0,05
S. aureus И-78	0,87±0,09	0,71±0,07
S. aureus ATCC N 25923	0,48±0,07	0,5±0,02
S. epidermidis (со слизистой носа здоровых лиц)	0,28±0,07	0,42±0,3
S. epidermidis (с кожи здоровых лиц)	0,82±0,05	0,91±0,05

Таблица 2
Показатели адгезии штаммов стафилококка, к примеру 2
Вид микроорганизма	ПА(Fn), М±m	ПА(Fb), М±m
S. aureus (со слизистой носа носителей)	0,67±0,07	0,71±0,02
S. aureus (со слизистой пациентов с CAP)	0,54±0,05	0,5±0,02
S. aureus И-78	0,88±0,09	0,75±0,03
S. aureus ATCC N 25923	0,68±0,04	0,7±0,02
S. epidermidis (со слизистой носа здоровых лиц)	0,35±0,07	0,27±0,2
S. epidermidis (кожа здоровых лиц)	0,22±0,05	0,31±0,03
S. hominis (кожа здоровых лиц)	0,14±0,02	0,15±0,02

Таблица 3
Показатели адгезии штаммов стафилококка к примеру 3
Вид микроорганизма	ПА(Fn) (КОЕ/на мл)	ПА(Fb) (КОЕ/на мл)	ПА(Ф) (КОЕ/на мл)
S. aureus (со слизистой носа носителей)	2,3×10⁶	2,8×10⁶	1,0×10²
S. aureus (кожа пациентов с АтД)	3,3×10⁶	2,1×10⁶	1,2×10²
S. aureus (со слизистой пациентов с CAP)	4,0×10⁶	3,6×10⁶	2,0×10²
S. aureus И-78	4,0×10⁶	5,1×10⁶	2,0×10²
S. aureus ATCC N 25923	3,8×10⁶	4,0×10⁶	1,0×10²
S. epidermidis (со слизистой носа здоровых лиц)	1,0×10⁶	2,0×10⁶	1,2×10²
S. epidermidis (кожа здоровых лиц)	1,1×10⁶	2,0×10⁶	1,2×10²

Способ количественного определения адгезии Staphylococcus spp. к фибронектину и фибриногену, в ходе которого исследуемую культуру стафилококка в концентрации 1 млн м. т. инкубируют в лунках полистиролового планшета с отдельно иммобилизованными белками - фибронектином и фибриногеном, в питательной среде 199 в течение 60±15 мин, далее удаляют не адгезированные бактерии трехкратной отмывкой средой 199 с твин-20 и определяют количественный показатель адгезии исследовательских штаммов стафилококков отдельно к фибриногену-ПA(Fb) и фибронектину ПА (Fn) по формулам (№1 или №2):
ПА(Fb)=(ОП(Fb)-ОП(К))-ОП(Ф) №1;
ПА(Fb)=(ОП(Fn)-ОП(К))-ОП(Ф) №2,
где ОП(Fn), ОП(Fb) - оптическая плотность в лунках планшета с иммобилизованными белками - фибронектином и фибриногеном соответственно; ОП(К) - оптическая плотность в лунках планшета с не иммобилизованными белками; ОП(Ф) - фоновая оптическая плотность, измеряемая при определении активности каталазы у адгезированных штаммов, и которая составляет оптическую плотность субстратного раствора (150 мкл 0,03% раствора Н₂О₂ и 50 мкл 4% раствора молибдата аммония) при 414 нм; для этого проводят учёт выросших клеток в питательной среде по оптической плотности среды с помощью фотометра, или проводят подсчет колоний клеток, высеянных на плотную питательную среду из серии десятикратных разведений, или определяют активность каталазы у адгезированных штаммов стафилококков.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к ДНК-технологиям. .

Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления bifidobacterium longum subspecies longum в заквасочных культурах, используемых при призводстве кисломолочных продуктов // 2473698

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к ДНК-технологиям. .

Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления streptococcus thermophilus в заквасочных культурах при производстве твердых сыров // 2455363

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к ДНК-технологиям. .

Способ определения адгезии staphylococcus spp. к гемопротеинам // 2393229

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в медицинской бактериологии для количественной оценки адгезивных свойств стафилококков, выделенных от человека и объектов окружающей среды при его бактериологической идентификации, для характеристики его вирулентных свойств in vitro по уровню адгезии к биополимерным молекулам.

Среда для дифференциальной диагностики энтеробактерий // 2376386

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для ускоренной индикации и дифференциации энтеробактерий. .

Селективная культуральная среда для выделения и выявления видов рода streptococcus // 2342435

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для идентификации видов Streptococcus по появлению трех разных оттенков выявляемых микроорганизмов и появлению испускания флуоресценции в дополнение к изменениям окраски среды.

Способ определения патогенных стафилококков по плазмокоагулирующей активности // 2332461

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической лабораторной диагностике инфекционных заболеваний. .

Способ видовой дифференциальной диагностики стафилококков // 2331073

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии и эпидемиологии. .

Способ видовой дифференциальной диагностики стрептококков группы в и группы d // 2327161

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии и эпидемиологии, и может быть использовано при бактериологической диагностике. .

Способ оценки результатов хирургической санации очага воспаления больных хроническим остеомиелитом // 2304781

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторным исследованиям при травматологической патологии. .

Способ определения адгезии золотистого стафилококка // 2510024

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для определения адгезии золотистого стафилококка. Для этого исследуют чистую культуру золотистого стафилококка в концентрации 1 млрд/мл. Определяют среднее количество микробов, адгезированных на одном эритроците при подсчете не менее 25 эритроцитов. При этом в качестве субстрата адгезии используют эритроциты барана в концентрации 100 млн/мл, которые предварительно отмывают 50-ти % формалина. Изобретение обеспечивает качественную и количественную экспресс-диагностику определения степени выраженности адгезивных свойств стафилококков.

Способ ускоренного выращивания золотистого стафилококка для диагностики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи // 2511031

Изобретение относится к области биохимии и клинической микробиологии. Проводят выращивание золотистого стафилококка Staphylococcus aureus на питательной среде, содержащей желточно-солевой агар. На стадии подготовки к анализу в питательную среду вводят стимуляторы роста Staphylococcus aureus в виде водных растворов в концентрациях 10-4-10-6 вес.%. В качестве стимуляторов роста используют следующие соединения: трис(2-гидроксиэтил)аммоний 4-хлорфенил-сульфанилацетат или трис(2-гидроксиэтил)аммоний 2-хлорфенилоксиацетат или трис(2-гидроксиэтил)аммоний 2-метил-4-хлорфенилоксиацетат или трис(2-гидроксиэтил)аммоний 1-бензилиндол-3-ил-сульфонилацетат. Изобретение позволяет ускорить выращивание золотистого стафилококка для диагностики инфекций, сокращая время выращивания с 48 до 6-9 часов по сравнению с контролем на стандартной питательной среде (ЖСА). 2 табл., 7 пр.

Способ определения антилизоцимной активности стафилококков // 2567642

Изобретение относится к области клинической микробиологии. Исследуемую культуру стафилококков выращивают в условиях постоянного встряхивания, в качестве контроля используют смесь бульона и культуры без лизоцима, проводят двукратное измерение оптической плотности опытных и контрольных лунок через 2 и 4 часа инкубации и об уровне антилизоцимной активности судят по степени выраженности признака у определенного штамма стафилококков, которую рассчитывают по формуле: где K - коэффициент антилизоцимной активности стафилококков; VК - объем бульонной культуры исследуемого штамма; VЛ - объем раствора лизоцима исходной концентрации; CЛ - концентрация лизоцима; MО4 - среднее значение оптической плотности опытных лунок с бульонной культурой исследуемого штамма с лизоцимом через 4 часа инкубации, ед. оптической плотности; MО2 - среднее значение оптической плотности опытных лунок с бульонной культурой исследуемого штамма с лизоцимом через 2 часа инкубации, ед. оптической плотности; MК4 - среднее значение оптической плотности контрольных лунок с бульонной культурой исследуемого штамма без лизоцима через 4 часа инкубации, ед. оптической плотности; MК2 - среднее значение оптической плотности контрольных лунок с бульонной культурой исследуемого штамма без лизоцима через 2 часа инкубации, ед. оптической плотности. При значении K<0,49 определяют низкую степень выраженности АЛА, K в пределах 0,5-2,49 - определяют среднюю степень выраженности АЛА, K>2,5 - определяют высокую степень выраженности АЛА стафилококков. Использование данного способа позволяет повысить точность определения АЛА. 3 пр.

Культуральная среда для скрининга или обогащения метициллин-резистентных s. aureus // 2567807

Группа изобретений относится к культуральной среде и способу для скрининга метициллин-резистентных Staphylococcus aureus (MRSA) в культуральной среде. Культуральная среда содержит комбинацию цефалоспоринов, выбранную из группы, состоящей из цефотетана (СТТ) и цефтриаксона (CRO); цефотетана (СТТ) и цефподоксима (CPD); цефсулодина (CFS) и цефтриаксона (CRO); цефсулодина (CFS) и цефепима (FEP); и цефотетана (СТТ) и цефтиофура (XLN). При этом каждый цефалоспорин присутствует в концентрации от 1 мг/л до 10 мг/л. Способ для скрининга MRSA включает инокуляцию указанной культуральной среды подлежащими тестированию бактериями, культивирование указанных бактерий в культуральной среде в условиях, которые обеспечивают возможность роста стафилококков, и идентификацию присутствия или отсутствия MRSA. Группа изобретений обеспечивает высокую чувствительность и специфичность при скрининге MRSA, а также быстрое выявление MRSA в пределах 18-24 ч. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 10 табл., 3 пр.

Способ получения питательной среды для выявления возбудителя некробактериоза животных // 2631795

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Способ получения питательной среды для выявления возбудителя некробактериоза животных предусматривает получение фильтрата культур стафиококка путем выращивания культур стафилокока на мясопептонном агаре с последующим культивированием в термостате при 37оС в течение 8-10 дней. Проводят инактивацию культуры стафилококка на водяной бане при температуре 90-95оС в течение 30 мин. Центрифугируют в течение 20 мин с последующим отделением надосадочной жидкости и дополнительной фильтрацией через фильтр Зейтца. Изобретение позволяет сократить сроки культивирования посевного материала и повысить чувствительность бактериологического исследования. 25 ил., 4 табл., 5 пр.

Способ получения питательной среды для транспортировки патологического материала, содержащего возбудитель некробактериоза животных // 2640251

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии. Способ получения питательной среды для транспортировки патологического материала, содержащего возбудитель некробактериоза животных, предусматривает получение фильтрата золотистого стафилококка путем высева суточной культуры золотистого стафилококка в мясопептонном бульоне с добавлением 10% хлорида натрия и культивирования в термостате при температуре 37°С в течение 8-10 дней с последующим инактивированием в водяной бане в течение 30 мин при температуре 90-95°С. Отделяют надосадочную жидкость центрифугированием при 1000 об/мин в течение 20 мин и фильтруют через фильтр Зейтца. Изобретение позволяет увеличить срок сохранения жизнеспособности возбудителя неробактериоза и повысить эффективность первичной диагностики и лечебно- профилактических мероприятий. 13 ил., 6 табл., 5 пр..

Способ получения трехмерных структур, используемых для детекции, выделения или подсчета микроорганизмов // 2644683

Изобретение относится к области микробиологии. Предложен способ получения трехмерных структур, используемых для детекции, выделения или подсчета микроорганизмов. Способ предусматривает растворение или суспендирование одного или более питательных веществ для стимуляции роста микроорганизмов в первом растворителе в количествах от 1 до 50 г/л и один или несколько специфических хромогенных или флуорогенных маркеров ферментативной активности для одного или нескольких микроорганизмов, растворенных в первом растворителе, для детекции специфических ферментативных активностей микроорганизмов. Осуществляют абсорбцию питательной композиции и одного или нескольких специфических хромогенных или флуорогенных маркеров ферментативной активности в одной или нескольких трехмерных структурах глин или природных керамических материалов с удельной поверхностью, равной 2×103-6×108 м2/м3, сформированных множеством нано-, микро- и макрополостей. Удаляют растворители. Изобретение обеспечивает детекцию, выделение или подсчет микроорганизмов, которые могут находиться в низкой концентрации в образце, в частности ниже чем 1 КОЕ/единицу образца. 23 з.п. ф-лы, 12 табл., 19 пр.