Фармацевтическая композиция и способ терапии нейродегенеративных заболеваний, в частности бокового амиотрофического склероза

Группа изобретений относится к медицине и касается фармацевтической композиции для терапии нейродегенеративных заболеваний, в частности бокового амиотрофического склероза, содержащей в эффективном количестве аденовирусный вектор, выполненный в виде нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа со вставкой гена ангиогенина человека, продуцирующей в организме человека ангиогенин и нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа со вставкой гена фактора роста эндотелия сосудов человека, продуцирующей в организме человека фактор роста эндотелия сосудов, при этом ген ангиогенина человека и ген фактора роста эндотелия сосудов человека клонированы в две экспрессирующих кассеты одной нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа; способа терапии бокового амиотрофического склероза, заключающегося во введении человеку терапевтически эффективной дозы указанной фармацевтической композиции. Группа изобретений обеспечивает повышенную терапевтическую эффективность препарата и отсутствие нежелательных побочных эффектов у пациентов. 2 н. и 17 з.п. ф-лы, 7 пр., 4 ил., 2 таб.

 

Изобретение относится к области медицины, в частности неврологии, и касается фармацевтической композиции, для лечения нейродегенеративных заболеваний, в частности бокового амиотрофического склероза.

Боковой амиотрофический склероз (БАС, в литературе заболевание также обозначается как болезнь Шарко, болезнь Лу Герига, болезнь двигательного нейрона) - это хроническое прогрессирующее, клинически и генетически гетерогенное фатальное заболевание, которое характеризуется прогрессирующей гибелью двигательных нейронов головного и спинного мозга. Изменения затрагивают клетки передних рогов спинного мозга (шейный, грудной и поясничный сегменты), двигательные ядра ствола головного мозга, пирамидные нейроны двигательной зоны коры головного мозга. В результате гибели мотонейронов соответствующие мышечные волокна денервируются и атрофируются. Заболевание характеризуется клинической гетерогенностью, определяемой преимущественной дегенерацией конкретных субпопуляций мотонейронов, в связи с чем принято выделять бульбарную, шейно-грудную и пояснично-крестцовую, а также так называемую «высокую» формы болезни. Независимо от первичной области поражения болезнь со временем приобретает симметричный генерализованный характер.

В результате неуклонного прогрессирования БАС смерть от дыхательного паралича и других осложнений наступает в среднем через 3-5 лет от момента манифестации симптоматики.

В настоящее время этиология спорадической формы БАС остается не выясненной.

На сегодняшний день эффективных этиопатогенетических методов лечения БАС не разработано. Известно единственное зарегистрированное и доступное с 1995 года лекарственное средство для лечения БАС на основе 6-(trifluoromethoxy) benzothiazol-2-amine, выпускаемое под торговым названием Rilutek компанией Sanofi-Aventis (Патент США №5,527,814, Louvel E, 18.06.1996, Use of 2-amino-6-(trifluoromethoxy) benzothiazole for obtaining a medicament for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis.). Препарат оказывает многостороннее воздействие на механизм глутаматной нейротрансмиссии. Однако вопрос о его клинической пользе из-за высокой стоимости и низкой эффективности сохраняется. Данное лекарственное средство удлиняет ожидаемую продолжительность жизни пациентов в среднем на 2-3 месяца. Недостатком терапии с помощью Rilutek является необходимость двукратного ежедневного введения перорально (по 50 мг каждые 12 ч) в течение всей жизни пациента, при этом препарат не улучшает мышечной функции и не замедляет развитие симптомов болезни (Miller R.G. et. al., Riluzole for amyotrophic lateral sclerosis (ALS), motor neuron disease (MND), Cochrane Database Syst Rev (1): CD001447, doi:10.1002/14651858.CD001447.pub2. PMID 17253460, 2007 - Рилузол для бокового амиотрофического склероза - болезни моторного нейрона).

Открытие нейротрофической функции у хорошо известных факторов ангиогенеза - ангиогенина (Greenway M.J. et al., ANG mutations segregate with familial and 'sporadic' amyotrophic lateral sclerosis, Nat. Genet., 2006; №38, с.411-413 - Мутации в гене ангиогенина выделяют при семейной и "спорадической" формах бокового амиотрофического склероза.), а также фактора роста эндотелия сосудов (Lambrechts D. et al., VEGF is a modifier of amyotrophic lateral sclerosis in mice and humans and protects motorneurons against ischemic death, Nat. Genet., 2003, №34, с.383-394 - Фактор роста эндотелия сосудов является модификатором бокового амиотрофического склероза у мыши и человека и защищает мотонейроны от ишемической смерти) позволяет рассматривають нейротрофические факторы в числе наиболее перспективных соединений для лечения БАС (Завалишин ИА, Захарова М.Н. Нейродегенеративные болезни и старение. - М., 2001, с.354-399; Боковой амиотрофический склероз. Под ред. Завалишина И.А. - М., Евразия, 2007, с.354-423).

Важность ангиогенина при патогенезе БАС подтверждена в экспериментах на мышах линии B6SJL-Tg(SOD1*G93A)dl1Gur/J с мутацией G93A в гене СОД1 (верифицированной трансгенной модели БАС) (Gurney M.E. et al., Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation, Science, 1994, №264, с.1772 - Дегенерация двигательных нейронов у мышей, которые представляют мутации Cu, Zn супероксиддисмутазы человека). Было показано увеличение продолжительности жизни при введении им рекомбинантного ангиогенина (заявка на выдачу патента США, №2008/0045456).

Участие фактора эндотелия сосудов в патогенезе БАС также подтверждено экспериментально. При делеции промоторного элемента гена фактора роста эндотелия сосудов, определяющего реакцию на гипоксию, у трансгенных мышей наблюдается развитие синдрома поражения нижних мотонейронов, напоминающего БАС (Oosthuyse et al., Deletion of the hypoxia - response element in the vascular endothelial growth factor promoter causes motor neuron degeneration, Nat. Genet. - 2001, №2, с.131-138 - Удаление гипоксия - ответственного элемента в промоторе фактора роста эндотелия сосудов, вызывающего дегенерацию двигательных нейронов).

Известны фармацевтические композиции на основе ангиогенина человека, в том числе рекомбинантного происхождения (полученного в Ecoli), и методы их использования для терапии нейродегенеративных заболеваний, в частности БАС, позволяющие снизить проявления нейродегенеративных процессов у подопытных мышей и удлинить продолжительность их жизни (заявка на патент США №2008/0045456).

Недостатками данных фармацевтических композиций является необходимость ежедневного введения рекомбинантного ангиогенина (так как он представляет собой готовый протеин). Дорогая стоимость терапии.

Одним из наиболее перспективных и эффективных методов доставки генетического материала в органы и клетки-мишени являются вирусные векторы. Из-за отсутствия способности к интеграции с геномом хозяина аденовирусная система обеспечивает временную экспрессию трансгенов, что требует повторного введения вирусных конструкций с терапевтической целью. При этом важными факторами являются безопасность, малая токсичность аденовирусных векторов и высокий уровень экспрессии трансгенов в клетках-мишенях. Эти векторы, экспрессирующие различные терапевтические нейротрофические факторы, успешно применяли на различных моделях животных (Miagkov et al., Gene transfer of baculoviral p35 by adenoviral vector protects human cerebral neurons from apoptosis, DMA and cell biology, №23 (8), 2004, с.496-501 - Передача гена бакуловируса p35 с помощью аденовирусного вектора защищает ДНК нейронов головного мозга отапоптоза и цитология).

Известны фармацевтические композиции на основе нейротрофических факторов, одним из которых является фактор роста эндотелия сосудов, и методы их применения, улучшающие выживаемость нейронов. Получение рекомбинантного фактора роста эндотелия сосудов человека возможно осуществлять с помощью вирусных векторов, в том числе аденовирусных. Опыты проводились на мышах (заявка на патент США №2011/0212055).

Известен способ лечения БАС с помощью рекомбинантного ангиогенина, прошедший доклинические испытания на мышах, с мутацией G93A в гене СОД1, в результате которых им вводили ангиогенин в спинной мозг и обнаружили удлинение сроков жизни, а также снижение канцерогенного эффекта по сравнению с системным введением. Лечение мышей в течение 50 дней удлиняло продолжительность жизни с 127 до 138 дней (заявка на патент США №2008/0045456).

Известны также фармацевтические композиции и методы применения ангиогенина, в том числе с использованием вирусных векторов, которые снимают, улучшают течение или замедляют один или более из присущих БАС симптомов:

- дегенерацию двигательных нейронов;

- мышечную слабость;

- атрофию мышц;

- образование непроизвольных мышечных сокращений;

- лобно-височную деменцию;

- уменьшение продолжительности жизни.

Опыты проводились на мышах.

(заявка на патент США №2011/0078804). Наиболее близким способом профилактики и/или лечения нейродегенеративных болезней, в частности БАС, того же назначения к заявляемому изобретению по совокупности признаков является терапевтическое применение рекомбинантного ангиогенина. В соответствии с известным способом введение ангиогенина в экспрессионной аденовирусной конструкции осуществляется мышам различными методами в пределах доз 0.0001-30 мг/кг массы тела, что позволяет улучшить двигательные функцию мышц и удлинить жизнь.

Фармацевтическую композицию и способ использования на основе аденовирусного вектора, экспрессирующего ген ангиогенина человека выбран авторами за прототип, как наиболее близкое решение по совокупности признаков и по назначению к заявляемому изобретению, служащую для лечения нейродегенеративных заболеваний, в частности БАС.

К причинам, препятствующим достижению лечебного эффекта при использовании данных композиций по прототипу, относятся:

- низкий терапевтический эффект;

- отсутствие терапевтических доз для человека;

- отсутствие данных по безопасности применяемых терапевтических доз для человека.

Хотя исследования вышеуказанных композиций, содержащих или рекомбинантный ангиогенин, или рекомбинантный фактор роста эндотелия сосудов, показали обнадеживающие результаты при лечении БАС, их существенными недостатками являются лишь незначительное ослабление симптоматики и удлинение сроков жизни подопытных животных, а также отсутствие клинических исследований.

Соответственно представленным выше данным, изыскание новых фармакологических композиций на основе нейротрофических факторов, а также разработка способов их применения для лечения и/или профилактики БАС человека являются своевременными и актуальными задачами, так как медицине остро необходимы безопасные и более выгодные экономически препараты, не только значительно удлиняющие продолжительность жизни пациента, но и улучшающие ее качество за счет ослабления или снятия симптоматики.

Задачей данного изобретения является создание биобезопасной, терапевтически эффективной, удобной для применения и экономически выгодной фармацевтической композиции, обладающей нейротрофическим действием. Создание конкретного способа применения фармацевтической композиции для терапии нейродегенеративных заболеваний, в частности бокового амиотрофического склероза

Задача реализуется за счет того, что создана фармацевтическая композиция для терапии нейродегенеративных заболеваний, в частности бокового амиотрофического склероза, содержащая аденовирусный вектор, экспрессирующий ген ангиогенина человека, при этом она содержит в эффективном количестве аденовирусный вектор, выполненный в виде нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа со вставкой гена ангиогенина человека, продуцирующей в организме человека ангиогенин и нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа со вставкой гена фактора роста эндотелия сосудов человека, продуцирующие в организме человека фактор роста эндотелия сосудов, причем ген ангиогенина человека и ген фактора роста эндотелия сосудов человека клонированы в две экспрессирующие кассеты одной нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа, а композиция дополнительно содержит формулирующий буфер. Заявленная фармацевтическая композиция содержит нереплицирующихся наночастиц 1,16×1011 физических частиц на мл формулирующего буфера. Терапевтически эффективную дозу нереплицирующихся наночастиц берут на 3 мл формулирующего буфера. Форма выпуска препарата может быть 1 мл. Форма выпуска препарата может быть также 3 мл. В фармацевтической композиции в качестве гена фактора роста эндотелия сосудов человека берут ген фактора роста эндотелия сосудов 121 изоформы.

Способ терапии бокового амиотрофического склероза, заключается во введении человеку терапевтически эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей нереплицирующиеся наночастицы, включающие ген ангиогенина человека и ген фактора роста эндотелия сосудов человека, клонированых в две экспрессирующих кассеты одной нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа, при этом композиция дополнительно содержит формулирующий буфер. При этом человеку вводят фармацевтическую композицию с содержанием нереплицирующихся наночастиц 1,16×1011 физических частиц на мл формулирующего буфера. Полная терапевтически эффективная доза препарата составляет от 3,48×1011 до 7×1013 физических частиц на человека в формулирующем буфере. Введение фармацевтической композиции осуществляют внутримышечно. При этом введение фармацевтической композиции осуществляют в три мышцы (m.trapezius, m.deltoideus, m.quadriceps) билатерально. Введение фармацевтической композиции осуществляют 1 раз в 2 недели в течение всей жизни пациента. При этом начало терапии осуществляют в 2 этапа с увеличением терапевтической дозы, на первом этапе вводят 1/3 полной терапевтической дозы препарата, в 1 мышцу билатерально. На втором этапе вводят 2/3 полной терапевтической дозы препарата, при этом введение осуществляют в 2 мышцы билатерально.

Реализация изобретения.

Известно, что для клеточной пролиферации эндогенный ангиогенин нуждается в индукции другими ангиогенными протеинами, например, такими, как фактор роста эндотелия сосудов (Kishimoto К. et al., Endogenous angiogenin in endothelial cells is a general requirement for cell proliferation and angiogenesis, Oncogene, 2005, №24, с.445 - Эндогенный ангиогенин в эндотелиальных клетках является основным для клеточной пролиферации и ангиогенеза).

Изобретение основано на способности нейротрофических факторов - ангиогенина и фактора роста эндотелия сосудов, сочетание оказывать положительный нейротрофичесий эффект, заключающийся в замедлении дегенерации мотонейронов.

В качестве вектора для создания нереплицирующихся наночастиц, несущих гены ангиогенина и фактора роста эндотелия сосудов, был выбран геном аденовируса человека 5-го серотипа, что обосновано тем, что аденовирусные векторы способны к ретроградному аксональному транспорту (Boulis N.M. et al., Characterization of adenoviral gene expression in spinal cord after remote vector delivery, Neurosurgery, 1999, №45 (1), с.131-137 - Характеристика экспрессии гена аденовирусом после удаленной доставки гена).

Таким образом, уникальностью заявленной фармацевтической композиции по сравнению с прототипом является наличие в составе композиции нереплицирующихся наночастиц на основе генома аденовируса 5-го серотипа, представляющих собой вектор, содержащий вставки сразу двух генов: ангиогенина и фактора роста эндотелия сосудов в разных экспрессирующих кассетах.

Указанные единые технические, лечебные и экономические результаты при осуществлении заявленного изобретения достигаются за счет того, что нейротрофические белки человека ангиогенин и фактор роста эндотелия сосудов продуцируются в терапевтических концентрациях прямо в нервной ткани организма человека заявляемой комбинированной нереплицирующейся наночастицей на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа.

Указанные единые технические, лечебные и экономические результаты при осуществлении изобретения по объекту «способ применения» достигаются за счет того, что заявляемый способ, также как известный способ профилактики и/или лечения нейродегенеративных заболеваний, осуществляют при помощи рекомбинантного нейротрофического белка ангиогенина, что подтвердили доклинические испытания. Особенность заявляемого способа заключается в том, что нейротрофические белки ангиогенин и фактор роста эндотелия человека продуцируются непосредственно в нервной ткани организма человека при внутримышечном введении нереплицирующихся наночастиц на основе генома аденовируса человека, содержащих две экспрессирующих кассеты со вставками генов ангиогенина и фактора роста эндотелия сосудов, а не вводятся в виде рекомбинантных белков или каждый ген в разных векторах, причем начало лечения осуществляется меньшими по сравнению с терапевтической дозами. Экспрессированные в организме человека ангиогенин и фактор роста эндотелия сосудов оказывают лечебное действие в качестве нейротрофического агента.

Для осуществления лечебного процесса создают фармацевтическую композицию на основе нереплицирующихся наночастиц, продуцирующих нейротрофические белки ангиогенин и фактор роста эндотелия сосудов.

Фармацевтическая композиция является исходным продуктом для приготовления различных лекарственных форм, применение которых определяется в зависимости от нейротрофического заболевания. Заявляемая фармацевтическая композиция содержащая нереплицирующиеся наночастицы со вставкой генов, кодирующих нейротрофические белки человека - ангиогенин и фактор роста эндотелия сосудов, прошла клинические испытания по изучению наличия нейротропного эффекта, канцерогенного действия, общетоксического действия, которые показали безвредность данной композиции и терапевтическую активность в качестве нейротрофического вещества, что иллюстрируется следующими примерами.

Для разработки заявленной фармацевтической композиции были решены следующие задачи:

- конструирование нереплицирующихся наночастиц на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа со вставкой генов ангиогенина и фактора роста эндотелия сосудов;

- разработка способа получения композиции с содержанием нереплицирующихся наночастиц, которое установлено исходя из терапевтических доз;

- определение минимальной терапевтической дозы и максимально переносимой дозы;

- показать экспрессию целевых генов в мотонейронах;

- показать клиническую эффективность и безопасность заявленного способа терапии.

Нижеприведенные примеры раскрывают поставленные задачи.

Пример 1

1) Конструирование нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа.

2) Получение фармацевтической композиции.

Для экспрессии генов ангиогенина и фактора эндотелия сосудов конструировали нереплицирующейся наночастицы с двухкассетной вставкой. Основой для создания таких нереплицирующихся наночастиц служила известная рекомбинантная плазмида, например pJM17 (Me Grory W.J., A simple technique for the rescue of early region I mutations into infectious human adenovirus type 5, Virology, №163 (2), 1988, с.614 - Простая техника для удаления раннего региона 1 в инфекционном аденовирусе человека 5 типа), с делециями в области Е1 аденовирусного генома человека 5 серотипа. Клонирование осуществляли методом гомологичной рекомбинации в клетках культуры и проводили с использованием общеизвестных лабораторных методик (например, Сэмбрук Д. и др. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984, стр.205-224, 387-420). Искусственно синтезированные кДНК гена ангиогенина человека и гена фактора роста эндотелия сосудов двумя последовательными субкпонированиями по выбранным сайтам рестрикции встраивали в общеизвестный шаттл-вектор, например pRcCMV (Invitrogen, San Diego, CA, № V 75020). Созданным двухкассетным плазмидным вектором pRcCMV - Ang - VGEF совместно с плазмидой pJM17 котранофецировали культуру клеток 293 (Graham F.L. et al., A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA, Virology, 1973, №52 (2), с.456-467 - Новая техника метода заражения ДНК аденовируса человека 5 серотипа). В результате гомологичной рекомбинации в клетках 293 (например, CLS, Germany, №300192) получили нереплицирующуюся наночастицу, несущую две экспрессирующих кассеты (расположенных в области Е1-делеции генома аденовируса человека), каждая из которых содержит промотор ранней области цитомегаловируса, целевой ген (ангиогенина или фактора роста эндотелия сосудов), сигнал полиаденилирования, кассеты разделены векторной нуклеотидной последовательностю. После транофекции полученной конструкцией клеточной культуры 293 образовавшиеся бляшки отбирали пастеровской пипеткой и размножали на клетках линии 293 до получения содержания 3×1010 ф.ч. (физических частиц)/мл (108 ЕД/мл).

На рисунке 1 представлена схема двух экспрессирующих кассет нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа, расположенная в области Е1-делеции генома аденовируса. На схеме отмечены:

1 - промотор ранней области цитомегаловируса (⇒);

2 - ген ангиогенина ();

3 - сигнал полиаденилирования ();

4 - ген фактора роста эндотелия сосудов ();

5 - векторная нуклеотидная последовательность ().

Таким образом, сконструирована нереплицирующаяся наночастица на основе генома аденовируса человека, способная экспрессировать два нейротрофических белка человека - ангиогенин и фактор роста эндотелия сосудов.

Получение фармацевтической композиции.

Исходя из определенных далее в примерах 3, 4, 5, 6 доз для человека содержание в фармацевтической композиции нереплицирующихся наночастиц, созданных на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа, должно составлять не менее 1,16×1011 ф.ч./мл (что соответствует активности не менее 3,3×108 ВД/мл). Получение данной композиции проходит в несколько этапов.

Полученную выше клеточную суспензию, содержащую нереплицирующиеся наночастицы в титре 3×1010 ф.ч./мл, использовали для дальнейшего наращивания титров нереплицирующихся наночастиц и приготовления готовой фармацевтической композиции с заданным содержанием не менее 1.16×1011 ф.ч./мл (что соответствует активности не менее 3,3×108 ЕД/мл).

Таким образом, для наработки необходимых титров нереплицирующихся наночастиц волновой биореактор с 4500 мл суспензии пермиссивной клеточной культуры 293 засевали клеточной суспензией объемом 500 мл, содержащей нереплицирующиеся наночастицы с титром 3×1010 ф.ч./мл.

Культивировали для наращивания нереплицирующихся наночастиц внутри клеток и достижения их содержания 6×1010 ф.ч./мл (активность 2×108 ЕД/мл), ориентировочно в течение 48 часов. По достижению необходимого содержания клеточную массу подавали на очистку, которая состояла из нескольких стадий:

1) Проводили осаждение клеточной массы центрифугированием. Поступающая на очистку суспензия имела не менее 1014 ф.ч. на 5 л (оценивали при помощи масс-спектрометра, 1 ОЕ=1012 ф.ч.). Центрифугирование проводили при режиме 6000 g в течение 15 мин, при этом жидкий надосадок спивали, а оставшуюся твердую часть, содержащую клетки и нереплицирующиеся наночастицы, подавали на дальнейшие стадии очистки.

2) Извлечение нереплицирующихся наночастиц из клеточной культуры проводили путем разрушения клеток четырехкратным перемораживанием-оттаиванием. Готовили буферный раствор с pH 8.0: 5 mM ТрисHCl, 0.075 M NaCl, 1 mM MgCl2, 5% сахароза, 1% полисорбат 80. Полученный в предыдущую стадию осадок ресуспендировали в 70 мл буфера (коэффициент концентрации ×71). Объем раствора составлял 80 мл.

Замораживание проводили в течение 2 часов в жидком азоте, размораживали на водяной бане (при +37°С), не допуская перегрева.

3) Для облегчения дальнейшего удаления геномной клеточной ДНК проводили дополнительную обработку нуклеазой. Для этого добавляли бензоназу до концентрации в растворе 150 U/мл и ставили на мягкое перемешивание с помощью магнитной мешалки на 3 часа при комнатной температуре (21-23°С).

4) Отделение нереплицирующихся наночастиц от разрушенных клеток осуществляли центрифугированием при 9000 g 10 мин. Отбирали супернатант, содержащий нереплицирующиеся наночастицы.

5) Дальнейшую очистку проводили ультрафильтрацией. Для этого полученный супернатант разводили буфером (50 mM TrisHCl pH 7.5, 1М NaCl, 2 mM MgCl2, 5% сахароза, pH 7,5) до объема не менее 200 мл перемешиваем с помощью магнитной мешалки. В процессе фильтрации объем циркулирующего раствора (ретентата) постоянно доводили до исходного (200 мл).

6) Далее очистку производили путем анион-обменной хроматографии.

Ретентат наносили на колонку (AxiChrom 70/300 объемом 400 мл), содержащую анионнообменный сорбент Q Sepharose virus licenced. Нереплицирующиеся наночастицы сорбируются на колонке, в то время как примеси не сорбируются, а вымываются буфером А. После удаления примесей нереплицирующиеся наночастицы десорбировали промывкой буфером Б. Условия хроматографирования: поток 193 мл/мин, буфер A (40 mM TrisHCl, 0,27 М NaCl, 2 mM MgCl2, 5% Сахароза, 0,1% Полисорбаг 80, pH 7.5), проводимость ~28-30 mS/cm; буфер Б (40 mM TrisHCl, 0.5M NaCl, 2 mM MgCl2, 5% сахароза, 0.1% полисорбат 80, pH 7.5) проводимость ~50 mS/cm. Элюат в объеме 200 мл отправляли на следующую стадию.

7) Экскпюзионная хроматогафия.

Полученный в предыдущей стадии элюат наносили на колонку (AxChrom 100/300 объемом 800 мл), содержащую сорбент Q Sepharose 4 FastFlow. Высокомолекулярные вещества, не входящие в поры сорбента, эпюировали первым пиком (к ним относятся нереплицирующиеся наночастицы), примеси элюировали после выхода пика нереплицирующихся наночастиц. Условия хроматографирования: поток 130 мл/мин, буфер (10 mM TrisHCl, 75 мМ NaCl, 1 mM MgCl2, 5% сахароза, 0,05% полисорбат 80, pH 8.0).

К полученному элюату (80 мл) добавляли этанол до концентрации 0,5% и этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) до концентрации 100 мкМ, отправляли на следующую стацию.

8) Нормальная фильтрация.

Для стерилизации полученного препарата проводили фильтрование через систему фильтров с размером пор 22 мкМ. Конечный объем препарата на данной стадии составлял 80 мл и содержал нереплицирующиеся наночастицы в титре 1×1012 ф.ч./мл. Его разбавляли формулирующим буфером (например, 10 mM TrisHCl, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 5% сахароза, 0,05% полисорбат 80, 0,5% Этанол, 100 мкм этилендиаминтетрауксусной кислоты, pH 8.0) до получения заданного содержания 1.16×1011 ф.ч./мл и стерилизовали нормальной фильтрацией.

Таким образом, в результате после конструирования нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа со вставкой генов ангиогенина и фактора роста эндотелия сосудов вышеописанным способом получили фармацевтическую композицию с заданным содержанием 1,16×1011 ф.ч./мл, что соответствует активности фармацевтической композиции в 3,3×108 ЕД/мл.

Пример 2

Определение наличия экспрессии ангиогенина и фактора роста эндотелия сосудов in vitro.

Оценку экспрессии нереплицирующимися наночастицами ангиогенина и фактора роста эндотелия сосудов проводили с помощью известного метода иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием наборов (R&D Systems, Quantikine, Human Angiogenin, кат. № DAN00; R&D Systems, Quantikine, Human VEGF, кат. № DVE00) no протоколу производителя. В культуру клеток 293 вносили фармацевтичекую композицию так, чтобы на одну клетку приходилось 5-10 ЕД нереплицирующихся наночастиц со вставками целевых генов. Посевы выдерживали 2 дня при температуре 37°С и 5% CO2, затем для анализа брали культуральную жидкость. Отрицательным контролем служила культуральная жидкость, полученная после внесения на культуру клеток нереплицирующихся наночастиц, не содержащих вставок целевых генов (таблица 1).

Таблица 1
Название исследуемого вещества Концентрация, мкг/мл
ангиогенин фактор роста эндотелия сосудов
культуральная среда (ангиогенин + фактор роста эндотелия сосудов) 5,8±0,1 6,0±0,1
культуральная среда (отрицательный контроль) не детектирован не детектирован

Таким образом, результаты таблицы 1 показывают наличие ангиогенина и фактора роста эндотелия сосудов в исследованных образцах культуральной жидкости, что означает наличие экспрессии ангиогенина и фактора роста эндотелия сосудов нереплицирующимися частицами со вставками гена ангиогенина и гена фактора роста эндотелия сосудов в виде двух кассет.

Таким образом, было заключено, что созданная фармацевтическая композиция продуцирует ангиогенин и фактор роста эндотелия сосудов in vitro.

Пример 3

Качественная оценка экспрессии терапевтических генов в спинном мозге.

Качественную оценку экспрессии терапевтических генов ангиогенина и фактора роста эндотелия сосудов в мотонейронах спинного мозга проводили после инъекции фармацевтической композиции в дозе 2,15×1011 ф.ч./м2 мышам линии B6SJL-Tg(SOD1*G93A)dl1Gur/J (Gurney M.E. et al., Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation, Science, 1994, №264, с.1772 - Дегенерация двигательных нейронов у мышей, которые представляют мутации Cu, Zn супероксиддисмутазы человека) (питомник «Пущине», Москва) проводили с помощью стандартной ПЦР (попимеразной цепной реакции) - амплификации участков специфических кДНК из образцов тотальной РНК, выделенной из поясничного, грудного, шейного отделов спинного мозга инъецированных мышей.

Оценку экспрессии терапевтических генов ангиогенина и фактора роста эндотелия сосудов в мотонейронах спинного мозга проводили на разных сроках после инъекции нереплицирующихся наночастиц со вставками генов ангиогенина и фактора роста эндотелия сосудов (4-й, 8-й и 14 день после инъекции).

С помощью набора для выделения РНК "Trizol RNA Prep 100" kit (Лаборатория Изоген, Россия) согласно протоколу производителя выделяли образцы тотальной РНК из различных отделов спинного мозга (поясничный, грудной, шейный) экспериментальных трансгенных мышей. Для анализа экспрессии терапевтических генов ангиогенина и фактора роста эндотелия сосудов в мотонейронах спинного мозга использовали образцы спинного мозга 10 мышей из экспериментальных групп.

Выбирали и синтезировали праймеры для обратной транскрипции и ПЦР-амплификации участков специфических кДНК экспрессируемых генов ангиогенина и фактора роста эндотелия сосудов, вводимых с помощью нереплицирующихся наночастиц: ангиогенин F 5'-GATGACAGATACTGTGAAAGCATCAT-3', ангиогенин R 5'-AGTGGACAGGTAAGCCATTTTC-3' (размер продукта амплификации 280 п.н.-пар нуклеотидов) и ФРЭF 5'-CATCACGAAGTGGTGAAGTTCAT-3', ФРЭR 5'-CTTGTCTTGCTCTATCTTTCTTTG-3' (размер продукта амплификации 310 п.н.).

Обратно-транскриптазную ПЦР с амплификацией участков специфических кДНК (ангиогенина и фактора роста эндотелия сосудов) проводили с помощью наборов "GenePak® RT-PCRCore" kits (Лаборатория Изоген, Россия) согласно протоколу производителя. Контрольным образцом служили пробы спинного мозга мышей, инъецированных нереплицирующимися наночастицами, не несущими вставок трансгенов.

На рисунке 2 представлены результаты ПЦр, показывающие экспрессию гена ангиогенина (показано светлыми полосками) в мотонейронах спинного мозга у инъецированных мышей B6SJL-Tg(SOD1*G93A)dl1Gur/J. Дорожки:

1 - положительная полоса амплификации 280 п.н. (пар нуклеогидов), поясничный сегмент, 4-й день после инъекции;

2 - положительная полоса амплификации 280 п.н., поясничный сегмент, 8-й день после инъекции;

3 - положительная полоса амплификации 280 п.н., (положительный контроль);

4 - отсутствие экспрессии (отрицательный контроль);

5 - маркер молекулярного веса (ДНК фага А, порезанная эндонуклеазами).

Результаты апекторофореграммы показывают наличие экспрессии гена ангиогенина.

На рисунке 3 представлены результаты ПЦР, показывающие экспрессию гена фактора роста эндотелия сосудов (показано светлыми полосками) в мотонейронах спинного мозга у инъецированных мышей B6SJL-Tg(SOD1*G93A)dl1Gur/J. Дорожки:

1 - маркер молекулярного веса (ДНК фага А, порезанная эндонуклеазами).

2 - положительная полоса амплификации 310 п.н. (пар нуклеотидов), (положительный контроль);

3 - отсутствие экспрессии (отрицательный контроль);

4 - положительная полоса амплификации 310 п.н., поясничный сегмент, 4-й день после инъекции;

2 - положительная полоса амплификации 310 п.н., поясничный сегмент, 8-й день после инъекции;

Результаты эпектрофореграммы показывают наличие экспрессии гена фактора роста эндотелия сосудов.

Аналогичные результаты экспрессии генов ангиогенина и фактора роста эндотелия сосудов нереплицирующимися наночастицами были получены в грудном и шейном отделах спинного мозга мышей.

Данное исследование показало наличие экспрессии терапевтических генов ангиогенина и фактора роста эндотелия сосудов в мотонейронах спинного мозга на 4-й день после внутримышечных инъекций фармацевтической композиции, а также сохранение экспрессии целевых генов на 8-й день после инъекции. На 14-й день экспрессии целевых трансгенов практически не наблюдалось (были получены слабые полосы на эпектрофореграмме).

Таким образом, путь введения фармацевтической композиции (повторные внутримышечные инъекции в мышцы задних и передних конечностей, а также мышцы спины) и доставки терапевтических генов в нейроны спинного мозга (ретроградный аксональный транспорт) нереплицирующимися наночастицами с двумя экспрессионными кассетами со вставками гена ангиогенина и гена фактора роста эндотелия сосудов является эффективным, что доказано эффективной экспрессией ангиогенина и фактора роста эндотелия сосудов в мотонейронах спинного мозга на 4-й и 8-й дни после инъекций исследуемых препаратов.

Таким образом, была доказана доставка действующего вещества фармацевтической композиции после внутримышечного введения в дозе 2,15×1011 ф.ч./м2 в мотонейроны спинного мозга и выработка в них ангиогенина и фактора роста эндотелия сосудов.

Пример 4

Оценка клинической эффективности фармацевтической композиции по показателям продолжительности жизни.

Сравнительная оценка продолжительности жизни разных экспериментальной и контрольных групп животных показала, что продолжительность жизни экспериментальной группы трансгенных мышей линии B6SJL-Tg(SOD1*G93A)dl1Gur/J, которым проводились многократные повторные внутримышечные инъекции фармацевтической композиции в дозе 2,15×1011 ф.ч./м2.

На рисунке 4 представлены данные по продолжительности жизни трансгенных животных:

1 - в экспериментальной группе, мышам которой вводили фармацевтическую композицию;

2 - контрольная группа, мышам которой вводили нереплицирующиеся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа (без вставки целевых генов);

3 - контрольная группа, мышам которой вводили буфер.

На рисунке видно, что мыши экспериментальной группы (с проявлением бокового амиотрофического склероза), которым вводили изобретенную фармацевтическую композицию, имели значительно большую (264±20 дня) выживаемость по сравнению с контрольными группами 2 и 3 (240±14 дней и 238±14 дней, соответственно), которым не вводили конструкции, экспрессирующие ангиогенин и фактор роста эндотелия сосудов.

Таким образом, введение фармацевтической композиции в дозе 2,15×1011 ф.ч./м2 увеличивает продолжительность жизни экспериментальных транспенных животных с моделью бокового амиотрофического склероза.

Пример 5

Для расчета максимально переносимых доз на мышах, самцах и самках, проведено изучение токсичности фармацевтической композиции при однократном внутримышечном введении. За основу была взята доза 2,15×1011 ф.ч./м2, с доказанной эффективностью ретроградного транспорта в мотонейроны спинного мозга (пример 3).

Фармацевтическую композицию животным вводили в дозах:

- 2,15×1011 ф.ч./м2, 4,3×1011 ф.ч./м2, 43,0×1011 ф.ч./м2, 215,0×1011 ф.ч./м2, 430,0×1011 ф.ч./м2 и 860,0×1011 ф.ч./м2.

В результате проведенных исследований определены максимально переносимые (МПД) и летальные дозы нереплицирующихся наночастиц на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа, как действующего вещества композиции, для мышей при однократном внутримышечном введении.

Для мышей:

- доза препарата 430,0×1011 ф.ч./м2 охарактеризована как МПД;

- доза препарата 860,0×1011 ф.ч./м2 охарактеризована как частично смертельная, приводящая к гибели 25% животных.

Различий в чувствительности самцов и самок к токсическому действию фармацевтической композиции при его однократном внутримышечном введении не выявлено.

Внешние проявления интоксикации у мышей при использовании переносимых и максимально переносимых доз препарата выражались в гиподинамии или адинамии, вялости, развитии отека конечности, в мышцу которой вводили препарат.

При использовании летальной дозы препарата у мышей (860,0×1011 ф.ч./м2) животные погибали на 4-18 сутки после введения препарата без выраженных клинических проявлений интоксикации. Вскрытие трупов погибших животных и тщательное патологоанагомическое исследование не позволили определить причину смерти животных.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что диапазон переносимых доз фармацевтической композиции в эксперименте по определению острой токсичности для мышей составляет от 2,15×1011 ф.ч./м2 до 430,0×1011 ф.ч./м2.

Пример 6

Разработка безопасного способа введения фармацевтической композиции.

Разработанная схема введения фармацевтической композиции позволяет избежать появления местных воспалительных постинъекционных реакций и основана на постепенном увеличении дозы в начале терапии. Для экспериментального подтверждения безопасности выбранной схемы введения были сформированы опытная и контрольная группы мышей по 10 животных в каждой.

Экспериментальным мышам с мутацией B6SJL-Tg(SOD1*G93A)dl1Gur/J внутримышечные инъекции исследуемой фармацевтической композиции, а также контрольных растворов проводили через каждые 2 недели, начиная с 2-месячного возраста до конца жизни. Раствор вводили билатерально в 3 группы мышц (передних, задних конечностей и спины), всего вводили 2,15×1011 ф.ч./м2.

Опытной группе животных первое введение фармацевтической композиции осуществляли билатерально в одну из мышечных групп (на выбор) передних, задних конечностей или мышц спины, т.е. в 2 точки так, что в конечном итоге общая доза введенных наночастиц составила 7,17×1010 ф.ч./м2 (1/3 полной дозы). Через 2 недели осуществляли введение в две мышечные группы (на выбор), т.е. 4 точки так, что в конечном итоге общая доза введенных наночастиц составила 1,43×1011 ф.ч./м2 (2/3 полной дозы). Через 2 недели после введения дробных доз начинают терапию полными дозами фармацевтической композиции в каждую из мышечных групп, т.е. в шесть точек (доза 2,15×1011 ф.ч./м2) один раз в 2 недели. Контрольным животным препарат вводили по обычной схеме. Эффективность разработанной схемы оценивали клинически - по визуальному наличию признаков воспаления в месте инъекции, данные сведены в таблицу 2.

Таблица 2
Группа животных Количество животных в группе Количество животных с признаками воспаления
фармацевтическая композиция (опытная) 10 0
фармацевтическая композиция (контрольная) 10 9

Данные таблицы 2 показывают, что введение препарата по заявленной схеме профилактирует возникновение постинъекционных местных воспалений.

Проводившиеся в ходе эксперимента постоянные наблюдения за трансгенными мышами на фоне многочисленных повторных внутримышечных инъекций исследуемой фармацевтической композиции свидетельствуют об отсутствии клинически значимых побочных эффектов. Повторные внутримышечные инъекции фармацевтической композиции не служат фактором интоксикации и морбидности для всех экспериментальных и контрольных групп трансгенных животных.

Во всех экспериментальных и контрольных группах трансгенных B6SJL-Tg(SOD1*G93A)dl1Gur/J животных реакция на введение фармацевтической композиции и сравниваемых растворов была стандартной и позволила оценить переносимость проводимого курсового лечения как благоприятную:

- повторные инъекции не приводили к летальным исходам и выбраковке экспериментальных животных;

- после введения препарата (сравниваемого раствора) у животных не наблюдалось явных признаков аллергических реакций или проявлений системной интоксикации; местные воспалительные постинъекционные реакции не наблюдали;

- в экспериментальных группах не зафиксировали каких-либо ассоциированных патологических состояний, которые могли бы быть прямо или косвенно связаны с введением рекомбинантного препарата.

Таким образом, при осуществлении способа терапии по заявленной схеме постинъекционных местных воспалительных реакций после внутримышечного введения фармацевтической композиции не наблюдали, что позволило рекомендовать схему к применению для человека.

Пример 7

Способ терапии БАС.

Заявленный способ терапии клинически апробировали на 6 больных, страдающих шейно-грудной формой спорадического бокового амиотрофического склероза.

Дозы, полученные во время доклинических исследований и измеряемые на м2 поверхности тела, являются эквивалентными и могут быть переведены на человека (средняя площадь поверхности тепа человека равна 1,62 м2). (Хабриев Р.У., Руководство по экспериментальному доклиническому изучению новых фармакологических веществ, 2000, с.98.), (Guidance for Industry. Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers, U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDBR), Pharmacology and Toxicology, США, 2005, с.7, 19 - Руководство для промышленности. Оценка максимальной безопасной стартовой дозы в начальных клинических испытаниях для терапии у взрослых здоровых добровольцев).

Для терапии внутримышечное введение фармацевтической композиции проводили в 3 мышцы (m.trapezius, m.deltoideus, m.quadriceps) с каждой стороны каждые 2 недели в течение жизни пациента. Для предотвращения появления местных воспалительных реакций первое введение фармацевтической композиции осуществляли в дозе 1,16×1011 ф.ч. (1/3 полной дозы) билатерально в одну из вышеперечисленных мышц, т.е. в 2 точки. Через 2 недели осуществлялось введение в две мышцы, т.е. 4 точки так, что в конечном итоге общая доза введенных нереплицирующихся наночастиц составила 2,32×1011 ф.ч. (2/3 полной дозы). Еще через 2 недели вводили полную дозу препарата 3,48×1011 ф.ч. в каждую из мышц билатерально, т.е. в шесть точек в течение всей жизни пациента.

Эффективность проведенной схемы введения препарата, направленной на предупреждение местных постинъекционных воспалительных реакций, оценивалась визуально (наличие воспалительных реакций различной степени в межинъекционный период). В конечном итоге были сформированы результаты по оценке 3-х постинъекционных периодов на наличие у пациентов местных воспалительных реакций, анализ полученных данных подтвердил отсутствие каких-либо воспалительных реакций на первое, второе, третье введения препарата. В отдаленном периоде лечения воспалительных реакций на очередное введение полной дозы антигена не фиксировали (в течение года).

Таким образом, схема введения фармацевтической композиции, основанная на постепенном увеличении дозы в начале лечения, позволяет проводить лечение бокового амиотрофического склероза без каких-либо побочных эффектов в месте введения препарата.

Преимуществами полученной по изобретению фармацевтической композиции являются:

- наличие в одной нереплицирующейся наночастице сразу двух вставок - гена ангиогенина и гена фактора роста эндотелия сосудов;

- снижение затрат производства, содержание нереплицирующихся наночастиц в одной дозе уменьшено в два раза;

- снижение реактогенности препарата из-за уменьшения содержания нереплицирующихся наночастиц;

- введение 1 раз в две недели для получения терапевтической концентрации целевых белков в организме человека;

- пролонгированное действие (в течение 2-х недель);

- снижение затрат препаратов, медицинского инструментария, рабочего времени медицинского персонала;

- снижение стоимости производства;

- ослабление симптоматики;

- удлинение сроков жизни пациентов;

- известен безопасный диапазон доз для человека.

Использование в фармацевтической и клинической практике заявляемой фармацевтической композиции и способов ее применения позволяет достичь нескольких технических, лечебных и экономических результатов:

- заявляемая фармацевтическая композиция биосовместима с организмом человека и терапевтически эффективна;

- заявляемая фармацевтическая композиция экономически выгодна, так как применяется комбинированная конструкция нереплицирующихся наночастиц, содержащая сразу два гена - ангиогенина и фактора роста эндотелия сосудов, что позволяет снизить дозу нереплицирующихся наночастиц в 2 раза для достижения терапевтического эффекта по сравнению с композициями, содержащими вставки данных генов в векторах по отдельности;

- заявляемая фармацевтическая композиция биобезопасна для организма человека - не вызывает ухудшения симптомов заболевания, не является онкогенной, не токсична, не вызывает местных и общих постинъекционных реакций;

- фармацевтическая композиция пригодна для внутримышечного введения;

- фармацевтическая композиция пригодна для лечения нейродегенеративных заболеваний, в частности БАС;

- фармацевтическая композиция удобна для применения, так как вводится один раз в 2 недели;

- пролонгированно (т.е. 2 недели) продуцирует в организме человека нейротрофические протеины - ангиогенин и фактор роста эндотелия сосудов, создавая в крови концентрацию, в десятки раз превышающую нормальный уровень и требуемую для достижения стойкого терапевтического эффекта;

- применение фармацевтической композиции экономически оправдано, поскольку введение один раз в 2 недели обеспечивает лечебный эффект на протяжении этого времени;

- препарат пригоден для изготовления лекарственных средств, предназначенных для лечения заболеваний нейротропной локализации;

- препарат удобен в хранении и транспортировке, применении.

Фармацевтическая композиция по изобретению может быть представлена лекарственными формами в виде раствора нереплицирующихся наночастиц для внутримышечного введения.

В результате изобретения осуществление заявленного способа терапии с помощью заявленной фармацевтической композиции позволяет при внутримышечном введении экспрессировать целевые нейропротекгорные белки-ангиогенин и фактор роста эндотелия сосудов в терапевтически эффективных количествах непосредственно в поврежденных мотонейронах спинного мозга у больных страдающих нейродегенеративными заболеваниями (в частности, боковым амиотрофическим склерозом) и увеличивать продолжительность их жизни. Форма выпуска 1 и 3 мл позволяет осуществлять введение композиции с увеличением дозы вначале терапии для предупреждения каких-либо постинъекционных воспалительных реакций, что позволяет безопасно продолжать терапию в течение всей жизни пациента. Это говорит о достижении задач, поставленных в данном изобретении.

Таким образом, задача, поставленная данным изобретением, решена.

1. Фармацевтическая композиция для терапии нейродегенеративных заболеваний, в частности бокового амиотрофического склероза, содержащая аденовирусный вектор, экспрессирующий ген ангиогенина человека,
отличающаяся тем, что
она содержит в эффективном количестве аденовирусный вектор, выполненный в виде нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа со вставкой гена ангиогенина человека, продуцирующей в организме человека ангиогенин, и нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа со вставкой гена фактора роста эндотелия сосудов человека, продуцирующие в организме человека фактор роста эндотелия сосудов, при этом ген ангиогенина человека и ген фактора роста эндотелия сосудов человека клонированы в две экспрессирующие кассеты одной нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа, а композиция дополнительно содержит формулирующий буфер.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что содержание нереплицирующихся наночастиц составляет 1,16×1011 физических частиц на 1 мл формулирующего буфера.

3. Фармацевтическая композиция по п.2, отличающаяся тем, что терапевтически эффективную дозу нереплицирующихся наночастиц берут на 3 мл формулирующего буфера.

4. Фармацевтическая композиция по п.2, отличающаяся тем, что форма выпуска препарата 1 мл.

5. Фармацевтическая композиция по п.2, отличающаяся тем, что форма выпуска препарата 3 мл.

6. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве гена фактора роста эндотелия сосудов человека берут ген фактора роста эндотелия сосудов 121 изоформы.

7. Способ терапии бокового амиотрофического склероза, заключающийся во введении человеку терапевтически эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей нереплицирующиеся наночастицы, включающие ген ангиогенина человека и ген фактора роста эндотелия сосудов человека, клонированые в две экспрессирующие кассеты одной нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа, при этом композиция дополнительно содержит формулирующий буфер.

8. Способ терапии бокового амиотрофического склероза по п.7, отличающийся тем, что человеку вводят фармацевтическую композицию с содержанием нереплицирующихся наночастиц 1.16×1011 физических частиц на 1 мл формулирующего буфера.

9. Способ терапии бокового амиотрофического склероза по п.8, отличающийся тем, что полная терапевтически эффективная доза препарата составляет от 3,48×1011 до 7×1013 физических частиц на человека в формулирующем буфере.

10. Способ терапии бокового амиотрофического склероза по п.7, отличающийся тем, что введение осуществляют внутримышечно.

11. Способ терапии бокового амиотрофического склероза по п.10, отличающийся тем, что введение фармацевтической композиции осуществляют в три мышцы.

12. Способ терапии бокового амиотрофического склероза по п.11, отличающийся тем, что введение осуществляют в 3 мышцы (m.trapezius, m.deltoideus, m.quadriceps) билатерально.

13. Способ терапии бокового амиотрофического склероза по п.7, отличающийся тем, что введение осуществляют 1 раз в 2 недели.

14. Способ терапии бокового амиотрофического склероза по п.13, отличающийся тем, что введение осуществляют в течение всей жизни пациента.

15. Способ терапии бокового амиотрофического склероза по п.7, отличающийся тем, что начало терапии осуществляют в 2 этапа с увеличением терапевтической дозы.

16. Способ терапии бокового амиотрофического склероза по п.15, отличающийся тем, что на первом этапе вводят 1/3 полной терапевтической дозы препарата.

17. Способ терапии бокового амиотрофического склероза по п.16, отличающийся тем, что введение осуществляют в 1 мышцу билатерально.

18. Способ терапии бокового амиотрофического склероза по п.15, отличающийся тем, что на втором этапе вводят 2/3 полной терапевтической дозы препарата.

19. Способ терапии бокового амиотрофического склероза по п.18, отличающийся тем, что введение осуществляют в 2 мышцы билатерально.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к химической промышленности для создания огнестойких и теплоизоляционных покрытий и касается огнезащитного силикатного покрытия по металлу.
Изобретение относится к химической промышленности и касается создания огнестойких и теплоизоляционных покрытий. .

Изобретение относится к технологии получения основных углекислых солей цинка, которые могут быть использованы в качестве сырья и промежуточных продуктов в фармацевтике, микроэлектронике, химической, шинной, лакокрасочной и нефтеперерабатывающей промышленности.

Изобретение относится к области создания электроизолированных соединений и может быть использовано для электрического разъединения элементов бурового и нефтяного оборудования.

Изобретение относится к способам и устройствам напыления покрытий на поверхности изделий холодным газодинамическим напылением, в том числе на поверхности художественных изделий и объемных форм из натурального камня или из металлического материала.

Изобретение относится к области переработки пластмасс, в частности к полимерным композициям на основе поливинилхлорида, которые используются в различных областях промышленности, в том числе, для изготовления изоляции и оболочек проводов и кабелей.

Изобретение относится к промышленности строительных материалов и может быть использовано для изготовления изделий из бетона в гражданском и промышленном строительстве, в том числе с использованием нанотехнологий.

Изобретение относится к катализаторам получения алифатических углеводородов. .

Изобретение относится к материаловедению и энергетике и может быть использовано для получения углеродных наноматериалов из угля с применением плазменных технологий.

Изобретение относится к новым соединениям общей формулы (1), возможно в виде транс-изомеров, или фармацевтически приемлемым солям, обладающим активирующей функцией ангиогенеза, образования просвета и роста нейронов.

Изобретение относится к производным аминопиразола формулы (I), где А, Е, R1 и R2 имеют значения, указанные в формуле изобретения, и к их фармацевтически приемлемым солям.

Изобретение относится к лекарственной терапии. .

Изобретение относится к соединениям формулы (I) или их фармацевтически приемлемым солям, где A, R1 R2, R3 и m определены в формуле изобретения. .

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано при комплексном лечении пациентов больных раком молочной железы II-IV. .

Изобретение относится к области медицины, в частности неврологии, и касается фармацевтической композиции, для лечения нейродегенеративных заболеваний, в частности бокового амиотрофического склероза

Наверх