Способ профилактики микотоксикозов и желудочно-кишечных заболеваний животных
Владельцы патента RU 2491942:
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности" (ФГБУ "ФЦТРБ-ВНИВИ") (RU)
Изобретение относится к микробиологии и микотоксикологии и предназначено для профилактики микотоксикозов. Способ включает введение микробного препарата внутрь, в качестве которого используют штамм Bacillus subtilis-93 в дозе 6-10 мл с содержанием 1 млрд. микр кл./мл в течение 10 дней. Способ позволяет повысить эффективность профилактики микотоксикозов, снизить заболеваемость молодняка, повысить сохранность, сократить сроки введения. 4 табл., 4 пр.
Изобретение относится к микробиологии и микотоксикологии, и может быть использовано в ветеринарии для профилактики желудочно-кишечных заболеваний, вызванных микотоксинами (в частности Т-2 и афлатоксином Bi, Mi).
В настоящее время препараты - пробиотики, подавляющие развитие патогенных микроорганизмов, находят широкое применение в ветеринарии для лечения желудочно-кишечных и гнойно-воспалительных заболеваний, обусловленных патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, обладающие сравнимой с антибиотиками эффективностью и не дающие осложнений в виде дисбактериозов и аллергических реакций. Эффективность этих препаратов связывают с витаминообразующей, кислотообразующей, антагонистической и иммуностимулирующей активностью микроорганизмов, входящих в их состав (Малик Н.И. Ветеринарные пробиотические препараты / Н.И. Малик, А.Н. Панин // Ветеринария. - 2001. - №1. - С.46-51).
Известны способы профилактики расстройств пищеварения желудочно-кишечного тракта у животных, вызванных различной патогенной и условно-патогенной микрофлорой (патент РФ 2381806, РФ №2035185, №2184774).
Кроме желудочно-кишечных заболеваний бактериальной природы, расстройства желудочно-кишечного тракта могут быть вызваны отравлениями микотоксинами.
Микотоксины, метаболиты микроскопических грибов, распространены повсеместно, вызывают порчу продуктов питания и кормов. Многие из них являются опасными сильнодействующими токсичными соединениями для человека и животных. Ущерб, наносимый микотоксинами агропромышленному комплексу, чрезвычайно велик. К наиболее опасным и токсичным микотоксинам относят Т-2 токсин и афлатоксины. Отравление микотоксинами в первую очередь проявляется нарушением работы органов желудочно-кишечного тракта, диспепсией, гастритом, нарушением работы печени, кровоизлияниями во внутренних органах и др. Болезнь сопровождается общим угнетенным состоянием животных, снижением аппетита вплоть до полного отказа от корма, жаждой, рвотой, нарушением перистальтики кишечника, расстройством в работе сердечно-сосудистой системы, затруднением дыхания и др.
Контаминируя продукты животноводства и растениеводства (зерновые культуры) микотоксины могут представлять опасность и для здоровья людей. Попадая с продуктами питания, в том числе и с хлебом, в организм человека, микотоксины проявляют мутагенный, канцерогенный, иммунодепрессантный эффекты, вызывают аллергозы, поражения печени и почек, органов воспроизводительной системы.
Профилактика отравлений микотоксинами в основном связана с предупреждением попадания микотоксинов в организм животных, т.е. выявлением их содержания в кормах и последующим обезвреживанием (Иванов, А.В. Микотоксикозы животных (этиология, диагностика, лечение, профилактика) / А.В. Иванов М.Я. Тремасов, К.Х. Папуниди и др. - М.: Колос, 2008. - 140 с.; Иванов, А.В. Микотоксикозы (биологические и ветеринарные аспекты) / А.В. Иванов, В.И. Фисинин, М.Я. Тремасов и др. - М.: Колос, 2010. - 392 с.).
Для профилактики и лечения микотоксикозов животных в основном используют сорбенты, действие которых сводится к сорбции ядов в желудочно-кишечном тракте, при этом специфических средств при отравлении микотоксинами не разработано.
Лечение антибиотиками диареи и других осложнений, вызванных отравлением микотоксинами, может еще более усугубить процесс интоксикации. К тому же антибиотики и химиотерапевтические препараты оказывают подавляющее действие на нормальную кишечную микрофлору, восстановление которой после применения этих средств происходит очень медленно. В связи с этим особую актуальность приобретает использование пробиотических штаммов в качестве профилактических средств при микотоксикозах.
Наиболее близким к предлагаемому является способ профилактики микотоксикозов животных, предусматривающий применение пробиотического препарата внутрь, в качестве которого используют препарат Сахабактисубтил, состоящий из двух штаммов бактерий Bacillus subtilis-ТНП-3 и Bacillus subtilis-THn-5, обладающих антагонистической активностью к токсинообразующим плесневым грибам (патент РФ 2297842 С2, опубл. 27.04.2007).
Однако обнаружение в кормах микроскопических грибов не всегда свидетельствует о наличии в них микотоксинов. В связи с этим актуальным является поиск профилактических средств, обладающих также выраженным обезвреживающим действием в отношении микотоксинов.
Задачей изобретения является повышение качества профилактических мероприятий при микотоксикозах сельскохозяйственных животных и сокращение сроков их проведения.
Эффективность достигается тем, что бактерии Bacillus subtilis-93 обладают выраженными антагонистическими свойствами по отношению к большому спектру патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, вызывающих дисбактериозы кишечника (сальмонеллы, шигеллы, эшерихии, клебсиеллы, стафилококки, микроскопические грибы). Применение средства приводит к нормализации микрофлоры желудочно-кишечного тракта, гемато-биохимических показателей крови, стимуляции обменных процессов, улучшению усвоения кормов, укреплению иммунитета животных.
В отличие от прототипа штамм В. subtilis-93 обладает антагонистическим действием не только к микроскопическим плесневым грибам, но и проявляет выраженное обезвреживающие действие в отношении Т-2 токсина, афлатоксинов, что подтверждено экспериментально в лабораторных и производственных условиях. Механизм обезвреживающего действия пробиотического штамма В. subtilis-93 заключается в продуцировании ряда ферментов, разрушающих микотоксины и их сорбцией компонентами клеточной стенки.
Введение пробиотического штамма В. subtilis-93 сокращает также частоту случаев диареи - неспецифического симптома микотоксикоза, возникающего в результате подавления микотоксинами роста микроорганизмов нормальной микрофлоры.
Кроме того, используемые для этого дозы и кратность введения препарата существенно ниже: 10 раз по 6-10 мл с концентрацией 1 млрд микробных клеток, против 30 дней по 50 млрд микробных клеток на голову, что существенно удешевляет профилактирование животных.
Штамм В.subtilis-93 активно размножается в питательных средах, принятых в производстве пробиотических препаратов. Устойчив к высушиванию и хранению.
Штамм Bacillus subtilis-93 выделен в 1993 году из сенного настоя в Тюлячинском районе РТ.
Характеристика штамма ранее не опубликована. Штамм в других целях не использовался.
Bacillus subtilis-93 имеет следующие морфологические и физиологические характеристики.
Морфология. Спорообразующие палочки расположены одиночно или собраны в короткие цепочки. Окрашивается по Грамму положительно.
Культуральные признаки. На жидкой питательной среде (МПБ) через, 18-24 часа культивирования при 37 С образуют пленку на поверхности среды и придонный осадок. На твердой питательной среде (МПА) образуют плоские непрозрачные блестящие колонии бежевого цвета с неровными краями, 2-3 мм в диаметре. На агаре Сабуро образуют крупные плоские непрозрачные колонии R-формы с выраженным центром. Поверхность колоний матовая шероховатая, цвет бежевый.
Физиологические признаки. Аэроб, оптимальные условия роста при температуре 37°C и pH 6,0-7,5.
Биохимические свойства. Растет в присутствии 6% NaCl. Обезжиренное молоко не свертывает, метиленовое молоко восстанавливает. Каталазоположительный. Сбраживает до кислоты без образования газа глюкозу, сахарозу, слабо ферментирует манит, лактозу и мальтозу, не ферментирует галактозу, арабинозу, рамнозу, дульцит, ксилозу, сорбит.
Bacillus subtilis-93 не патогенен, характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов рода Escherichia, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas, Proteus. Активен в отношении микроскопических грибов рода Fusarium, Aspergillus, Penicillium, Mucor.
Штамм депонирован 11.04.2001 г. во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов. (ВГНКИ) - штамм Bacillus subtilis-93-ДЕП. Местом хранения штамма определена коллекция микроорганизмов ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г.Казань).
Изобретение поясняется примерами.
Пример 1. Профилактическая эффективность Bacillus subtilis-93 при экспериментальном Т-2 токсикозе телят
Опыты проведены на 12 телятах, пятидневного возраста, разделенных по принципу аналогов на 2 группы: опытная и контрольная. Животным опытной группы задавали внутрь по 10 мл взвеси штамма Bacillus subtilis-93 в физ. растворе, с содержанием в 1 мл 1 млрд микр. кл., один раз в день в течение 10 суток. Сразу после введения пробиотического штамма внутрь задавали Т-2 токсин в дозе 0,4 мг/кг в виде водно-спиртового раствора. Контрольная группа получала только Т-2 токсин.
У животных контрольной группы Т-2 токсикоз проявлялся резкими изменениями клинико-гематологических и биохимических показателей; на 3-5 сут после введения Т-2 токсина у телят отмечалась диарея.
К концу опыта количество эритроцитов у телят контрольной группы, в сравнении с аналогичными показателями у опытной группы было ниже на 23,6% (Р<0,01), лейкоцитов на 17,4% (Р<0,05), гемоглобина на 32,8% (Р<0,001), общего белка на 16,3% (Р<0,05).
Введение пробиотического штамма животным опытной группы снижало отрицательное влияние экотоксиканта, диарея выявлялась только у одного животного в более поздние сутки. Изменения гемато-биохимических показателей были менее значительны (таблица 1).
| Таблица 1 | ||||
| Гемато-биохимические показатели телят при подостром Т-2 токсикозе на фоне применение пробиотического штамма Bacillus subtilis-93 | ||||
| Группа животных | Показатель | Сроки наблюдения, сут | ||
| Исх. данные | 5 | 10 | ||
| Опыт | Эритроциты, ×1012/л | 8,1±0,17 | 8,3±0,21 | 8,9±0,7** |
| Лейкоциты, ×109/л | 11,1±0,2 | 11,0±0,3 | 10,1±0,3* | |
| Гемоглобин, г/л | 96,5±1,9 | 96,1±0,2 | 108,5±0,4*** | |
| Общий белок, г/л | 62,8±0,3 | 61,9±1,6 | 62,6±0,27* | |
| Контроль | Эритроциты, ×1012/л | 8,2±0,3 | 7,9±0,5 | 7,2±0,1 |
| Лейкоциты, ×109/л | 11,3±0,4 | 10,9±0,6 | 8,6±0,3 | |
| Гемоглобин, г/л | 96,1±1,3 | 91,6±0,2 | 81,7±0,6 | |
| Общий белок, г/л | 62,0±2,4 | 56,7±0,23 | 53,8±0,1 | |
| * - Р<0,05 ** - Р<0,01 *** Р<0,001 |
Пример 2. Профилактическая эффективность Bacillus subtilis-93 при микотоксической диарее поросят, вызванной содержанием в корме микотоксинов: Т-2 и афлатоксина B1
Опыты проведены на 40 поросятах, разделенных по принципу аналогов на 2 группы, по 20 голов в каждой, с признаками диареи на фоне кормления свиноматок кормом, содержащим микроскопические грибы Fusarium sporotrichiella, Aspergillus flavus и микотоксины - Т-2 токсин в дозе 0,2±0,03 мг/кг и афлатоксин B1 - 0,3±0,05 мг/кг. В молозиве свиноматок обнаружен афлатоксин M1 (метаболит афлатоксина B1) в количестве 0,005-0,01 мг/кг.
Животным опытной группы сразу после рождения (до приема молозива) внутрь задавали по 5 мл взвеси штамма Bacillus subtilis-93 в физиологическом растворе, с содержанием в 1 мл 1 млрд микр. кл., один раз в день в течение 10 суток; второй группе (контроль) по аналогичной схеме задавали физиологический раствор.
На 1-2 сутки после рождения у поросят контрольной группы отмечали признаки диареи: частая дефекация, жидкий кал без примеси крови и пузырьков воздуха. На 6-8 сут признаки диареи усиливались, наблюдался профузный понос, животные отставали в росте, отмечалась дегидратация, повышение температуры, учащение пульса и частоты дыхания. В дальнейшем развивался цианоз кожи и слизистых оболочек, наблюдалось снижение температуры тела, ослабление пульса и частоты дыхания. Сохранность составила лишь 30% (таблица 2). У выживших животных в дальнейшем отмечалось снижение роста, привесов.
| Таблица 2 | ||||||||||
| Сроки наблюдения признаков диареи и интенсивность роста поросят-сосунов при употреблении ими молока содержащего афлатоксин M1 на фоне применения пробиотического штамма Bacillus subtilis-93 | ||||||||||
| Группа животных | Сроки наблюдения (сут), количество поросят с признаками диареи | Кол-во павших поросят, гол | Средний вес одного поросенка | Среднесуточный прирост, г | ||||||
| 1 | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 | ||||
| Контроль | - | 2 | 3 | 3 | 6 | 7 | 9 | 6 | 5,17 | 139,2 |
| Опыт | - | - | - | - | - | 2 | 2 | - | 5,97 | 165,4 |
Введение поросятам пробиотического штамма способствовало нормализации гематологических (увеличение количества эритроцитов, лейкоцитов и гемоглобина) и биохимических (общего белка, альбуминов, глюкозы) показателей крови, максимальному уменьшению развития дегенеративно-дистрофических изменений в органах и тканях, снижению заболеваемости и падежа животных. Признаки диареи, не сопровождающиеся повышением температуры, на 25 сутки отмечались только у двух поросят. Животные все выжили и были переведены в группу отъема.
Микробиологическими исследованиями содержимого толстого отдела кишечника контрольных поросят обнаружили гемолитические, энтерококки, стафилококки, сальмонеллы, дрожжи и микроскопические грибы, количество бифидо- и лактобактерий (в сравнении с группой, получавшей пробиотический штамм) было ниже на 31,4 и 28,9% (Р<0,001) соответственно.
Пример 3. Профилактическая эффективность Bacillus subtilis-93 при микотоксической диарее телят, вызванной содержанием в корме стельных коров микотоксина Т-2 и афлатоксина B1
Опыты проведены на 40 новорожденных телятах черно-пестрой породы, разделенных на две группы по 20 голов, с признаками диареи на фоне кормления стельных коров комбикормом, содержащим микроскопические грибы Fusarium sporotrichiella, Aspergillus flavus и микотоксины - Т-2 токсин в дозе 0,15 мг/кг и афлатоксин B1 - 0,2 мг/кг.
Новорожденным телятам опытной группы сразу после рождения задавали по 10 мл взвеси штамма Bacillus subtilis-93 в физ. растворе, с содержанием в 1 мл 1 млрд микр. кл., один раз в день в течение 10 суток. Контрольная группа получала физиологический раствор.
Наличие микотоксинов в кормах беременных коров оказывает отрицательное влияние на организм новорожденных животных. На 5 сутки после рождения у 35% телят контрольной группы отмечалась диарея. В группе контроля пало 2 теленка (таблица 3).
| Таблица 3 | ||||||||||
| Сроки наблюдения признаков диареи и интенсивность роста телят при употреблении ими молока содержащего афлатоксин M1 на фоне применения пробиотического штамма Bacillus subtilis-93 | ||||||||||
| Группа животных | Сроки наблюдения (сут), количество телят с признаками диареи | Кол-во павших телят, гол | Средний вес одного теленка | Среднесуточный прирост, г | ||||||
| 1 | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 | ||||
| Контроль | - | 7 | 8 | 12 | 17 | 17 | 17 | 2 | 58,1 | 570 |
| Опыт | - | - | - | - | - | 2 | 2 | - | 42,2 | 410 |
Пробиотический штамм Bacillus subtilis-93 обладает выраженной профилактической эффективностью при микотоксикозе, в опытной группе диарея отмечалась только у двух телят в более поздние сроки (25-30 сут) и была менее выражена.
Пример 4. Профилактическая эффективность Bacillus subtilis-93 при афлатоксикозе поросят-отъемышей
Опыты проведены на 30 подсвинках средней живой массой 20-25 кг, разделенных на две группы по 15 голов в каждой, в рационе которых был обнаружен афлатоксин Bi в концентрации от 18,5 до 80,0 мкг/кг. Первая группа животных служила контролем и получала токсичный корм; вторая - совместно с токсичным кормом ежедневно в течение 10 сут получала взвесь культуры Bacillus subtilis-93 в физиологическом растворе, в дозе 5 мл (с содержанием в 1 мл 1 млрд микр. кл).
Пробиотический штамм Bacillus subtilis-93 при спонтанном афлатоксикозе поросят оказывал положительное влияние на клинические, гемато-биохимические показатели, нормофлору желудочно-кишечного тракта (количество бифидобактерий было выше на 61,2%, лактобактерий на 54,0% (Р<0,001), чем в контрольной группе).
У контрольных животных отмечалось расстройство желудочно-кишечного тракта, отставание в росте, увеличение популяционного уровня гемолитических эшерихий, золотистого стафилококка, сальмонелл, дрожжей и плесени (таблица 4).
| Таблица 4 | ||
| Состояние кишечного микробиоценоза поросят при афлатоксикозе на фоне применения пробиотического штамма Bacillus subtilis-93 | ||
| Микроорганизмы, IgKOE/r | Группа животных | |
| Контроль | Опыт | |
| Бифидобактерий | 4,28±0,18 | 6,9±0,15*** |
| Лактобактерий | 3,48±0,53 | 5,36±0,2*** |
| Энтерококки | 4,06±0,26 | 5,6±0,18*** |
| Эшерихии с норм. ферм. активностью | 3,13±0,44 | 4,85±0,5*** |
| Эшерихии гемолитич. | 0,3±0,03 | - |
| Стафилококки зол. | 0,50±0,11 | 0,14±0,01*** |
| Сальмонеллы | 2,27±0,24 | 1,0±0,02*** |
| Дрожжи и плесени | 1,73±0,06 | 1,34±0,06** |
Пример 5. Профилактическая эффективность Bacillus subtilis-93 при экспериментальном афлатоксикозе поросят
Опыты проведены на 30 поросятах, 30 суточного возраста, разделенных по принципу аналогов на 3 группы: 2 опытные и контрольная. В течение опытов животные получали автоклавированный (стерильный) комбикорм, контаминированный афлатоксином Bi (40 мкг/кг).
Животным первой опытной группы задавали внутрь по 5 мл взвеси штамма Bacillus subtilis-93 в физ. растворе, с содержанием в 1 мл 1 млрд. микр. кл., один раз в день в течение 10 суток; животным второй группы по 6 мл.
Контрольная группа получала в аналогичной дозе физиологический раствор.
У животных контрольной группы афлатоксикоз проявлялся изменениями клинико-гематологических и биохимических показателей. Отмечалось угнетение, снижение пищевой возбудимости, реакции на внешние раздражители, расстройства желудочно-кишечного тракта. На 8 сут опыта в группе контроля пало одно животное.
При патологоанатомическом вскрытии павшего поросенка, выявлены желтушность видимых слизистых оболочек, подкожной клетчатки, увеличение и уплотнение печени, наличие точечных кровоизлияний. Кровоизлияния обнаружены и в слизистой кишечника.
Введение пробиотического штамма животным опытных групп снижало отрицательное влияние микотоксина, обеспечивало сохранность, причем, более эффективной оказалась доза 6 мл, отличающаяся менее выраженными изменениями клинико-гематологических показателей.
Таким образом, предлагаемый способ профилактики микотоксикозов с использованием штамма Bacillus subtilis-93 позволяет:
- снизить заболеваемость молодняка сельскохозяйственных животных;
- повысить сохранность;
- снизить количество вводимого препарата в 15 раз;
- сократить количество дней введения препарата до 10 дней;
- снизить стоимость профилактических мероприятий.
Способ профилактики микотоксикозов животных путем введения микробного препарата внутрь, отличающийся тем, что в качестве микробного препарата используют штамм Bacillus subilis-93 в дозе 6-10 мл с содержанием 1 млрд. микр. кл/мл в течение 10 дней.
