Способ получения фармацевтической субстанции полимиксина в


 

C07K1/18 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2492180:

Учреждение Российской академии наук Центр "Биоинженерия" РАН (RU)

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ выделения полимиксина В, продуцируемого спорообразующими бактериями Bacillus polymyxa. Осуществляют очистку нативного раствора, получаемого после отделения биомассы от культуральной жидкости, с использованием макропористого сильнокислотного катионита. Элюируют полимиксин В. Осаждают полимиксин В основание. Затем его переводят в раствор полимиксина В сульфата. Проводят финишную очистку раствора на сульфокислотном катионите и затем сушат. В качестве макропористого сильнокислотного катионита используют Dowex-MSC-1, а в качестве сульфокислотного катионита - КУ-2-20. Способ позволяет получать фармацевтически чистую субстанцию полимиксина В, соответствующую международным требованиям по качеству, при этом повысив выход антибиотика и упростив процесс его получения. 2 з.п. ф-лы, 5 пр.

 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к технологии создания биологически-активных соединений и касается промышленного способа получения фармацевтической субстанции полимиксина В сульфата - противомикробного препарата для системного использования

Структурная формула.

Полимиксины R R' X Молекулярная формула М, г/моль
B1 CH3 CH3 L-Lev C56H98N16O13 1204
B2 H CH3 L-Lev C56H98N16O13 1190
B3 CH3 H L-Lev C56H98N16O13 1190
B1-1 CH3 CH3 L-Ile C56H98N16O13 1204

Полимиксин B представляет собой смесь близких по своим свойствам соединений - полимиксинов B1, B2, B3 и B1-1- циклических пептидов, продуцируемых спорообразующими почвенными бактериями Bacillus polymyxa.

Препарат оказывает бактерицидное действие, связанное с нарушением целостности мембраны микробной клетки. Активен в отношении грамотрицательных микроорганизмов: Pseudomonas aeruginosa. Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli и др. Применяется при острых инфекциях, вызванных чувствительными к полимиксину В микроорганизмами.

В настоящее время из-за все увеличивающейся резистентности микроорганизмов возрос интерес к старым препаратам, не применявшимся более 20 лет. Одним из таких препаратов является полимиксин В.

Его получают биосинтезом с использованием спорообразующих почвенных бактерий Bacillus polymyxa.

Первые сообщения о субстанции полимиксина В появились более 60 лет назад (см. например, Р. G. Stansly and M.E. Schlosser Studies on Polymyxin: Isolation and Identification of Bacillus polymyxa and Differentiation of Polymyxin from Certain Known Antibiotics J Bacteriol. 1947 November; 54(5): 549-556).

Известная схема выделения и очистки полимиксина В, хорошо отработанная за годы известности этого препарата, включает следующие этапы:

Разделение мицелия и культуральной жидкости.

Очистку нативного раствора.

Получение полимиксина B сульфата

Для полимиксинов наиболее сложной частью выделения целевого продукта является стадия очистки, с помощью которой необходимо не только освободиться от неспецефических примесей, но и ограничить количества полимиксинов, входящих в его состав (полимиксина B-3 и B-1.1), являющихся наиболее токсичными. Усилия исследователей в основном сосредоточены на очистке выделяемого продукта.

Так, описана очистка полимиксина с помощью адсорбции, например, на катионите СБС-1 с последующей нейтрализацией на анионите ЭДЭ-10 (авторское свидетельство СССР №111195); последовательным многократным переводом из щелочной в кислую среду и обратно, как это описано в патенте Канады №515306.

Патент США №2602041 раскрывает технологию многократной очистки с помощью активированного угля при определенных значениях pH и касается очистки полимиксина В через образование промежуточного комплекса с аминами с последующим образованием полимиксина В сульфата путем обработки серной кислотой. На схожем принципе основана технология очистки, описанная в патенте Великобритании №647925.

Наиболее близким к предполагаемому изобретению, является описанный в патенте (SK) WO 2007142611 метод очистки полимиксина B с помощью неионогенных адсорбентов полистирольного типа с определенными поверхностными параметрами путем обработки нативного раствора на этом сорбенте, с последующим элюированием полимиксина В водным раствором органического растворителя, упариванием органического растворителя в вакууме, осаждением основания полимиксина B из водного элюата при pH 8-12 и температуре 60-80°C, его фильтраций, последующем растворении основания в воде, подкислении полученного раствора до pH 5-7.5, обесцвечиванием полученного раствора активированным углем и лиофильной сушкой очищенного раствора антибиотика. При этом получают препарат с выходом 48-50% содержащий от 72 до 81% суммы полимиксинов B.

Однако, эти характеристики не достаточны для того, чтобы препарат считался фармацевтической субстанцией. В связи с значительной токсичностью полимиксина B 1-1 и полимиксина B-3 их количество строго регламентируется (B 1-1 не более 15%), B-3 не более 6%).Кроме этого, количество родственных и посторонних примесей должно также быть не более определенного предела. (Сумма не более 17%). Сумма полимиксинов B не должна быть менее 80%.

Поэтому при создании изобретения ставились следующие задачи:

- создать способ получения полимиксина B, позволяющий получать фармацевтически чистую субстанцию, отвечающую международным требованиям;

- повысить выход антибиотика;

- упростить процесс.

Для достижения указанной цели нами были детально изучены условия работы с полимиксином В на каждом из этапов очистки, найдены соответствующие марки сорбентов, позволяющие наиболее эффективно освобождаться от сопутствующих примесей. Изучено влияние концентрации растворов препарата на эффективность очистки на том или ином сорбенте. Подобраны экспериментальным путем значения pH растворов препарата, позволяющие минимизировать появление продуктов деструкции. Поиск новых типов сорбентов для процессов очистки технологических растворов продолжает оставаться актуальной задачей. Особого внимания заслуживают сверхсшитые полистиролы благодаря их высокой сорбционной активности, механической прочности и способности к многократной регенерации. Данные материалы удобно применять для концентрирования ряда органических примесей из различных сред, и поэтому они представляют практический интерес. В этом ряду сорбентов (Amberlite, Duolite, Dowex) нами был выбран Dowex, имеющий достаточно большую сорбционную емкость и используемый для сорбции веществ с большим молекулярным весом. Кроме этого этот материал позволяет проводить количественную десорбцию полимиксинов с небольшим объемом растворителя, что важно для промышленного метода. Большая часть сопутствующих примесей остается на сорбенте. На конечной стадии выделения полимиксина В для освобождения от примесей неорганичекого характера нами были использованы сульфокислотные катиониты КУ-2-8чС, purolite C-100E, КУ-2-20, позволяющие получать продукт фармацевтической чистоты. За счет сокращения количества обработок целевого продукта удалось повысить выход полимиксина В до 62-68%.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

1. Обработка культуральной жидкости с получением нативного раствора.

2. Очистка нативного раствора полимиксина В на Dowex MSC.

3. Обработка углем.

4. Получение полимиксина В основания.

5. Получение раствора полимиксина В сульфата.

6. Обработка катионитами (КУ-2-20, КУ-2-8чС, purolite C-100E).

7. Сушка полимиксина В сульфата.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1.

6.99 л культуральной жидкости, содержащей 7,3 г полимиксина В загружают в реактор при перемешивании и температуре 70-72°C. Продолжают перемешивание в течение 5-10 минут, затем биомассу отделяют на нутч фильтре, а к полученному нативному раствору добавляют при перемешивании 20% раствор едкого натра до pH 6,0-6,6 и затем 90 г катионита Dowex MSC. Перемешивают в течение 2 часов при комнатной температуре затем смолу отфильтровывают, промывают водой и элюируют полимиксин B 3% раствором соляной кислоты и получают 420 мл (5.5 г полимиксина В). Нейтрализуют элюат 20% раствором едкого натра до pH 4,5-5,0. Добавляют 8,4 г активированного угля, перемешивают 30 минут и отфильтровывают уголь. К фильтрату добавляют 20% раствор едкого натра до pH 10-10,5, нагревают 10-15 минут при температуре 60°C, отфильтровывают выпавший осадок (полимиксина B основания), а затем растворяют его в 200 мл воды с pH 4,5-5,5(подкисление осуществляют с использованием концентрированной серной кислоты). К полученному раствору полимиксина В сульфата добавляют 28,5 г смолы КУ 2-20, перемешивают 30 минут, смолу отфильтровывают, промывают 100 мл воды, фильтрат и промывную воду объединяют, сушат и получают 5,29/ 4,52 г полимиксина B основания (62% полимиксина B сульфата соответственно). Содержание суммы полимиксинов B (ВЭЖХ) 86,5%, B3 - 2,48, B1-1 - 5,8%, сумма примесей 13,4% - соответствует по качеству фармацевтической субстанции (см. приложение 1).

Пример 2.

Выполняется аналогично примеру один, за исключением температуры, при которой происходит осаждение основания полимиксина B - температура осаждения составляет 70°С. Получают 5,8/ 4.96 г полимиксина В основания (68% полимиксина В сульфата соответственно). Содержание суммы полимиксинов В (ВЭЖХ) 84%, B3 - 1.68, B1-1 - 7,8%, сумма примесей 14,84% соответствует по качеству фармацевтической субстанции.

Пример 3.

Выполняется аналогично примеру один, за исключением использования активированного угля, вместо которого используют увеличенное количество ионообменной смолы КУ 2-20 при обработке финишного раствора. К финишному раствору полимиксина В сульфата добавляют 38,8 г смолы КУ 2-20, перемешивают 30 минут, смолу отфильтровывают, промывают 130 мл воды, фильтрат и промывную воду объединяют, сушат и получают 5,23/4,47 г полимиксина В основания (61,2% полимиксина В сульфата соответственно). Содержание суммы полимиксинов В (ВЭЖХ) 84,5%, B3 2,48, B1-1 - 5,8%, сумма примесей 11,4% - соответствует по качеству фармацевтической субстанции.

Пример 4.

Выполняется аналогично примеру один, за исключением использования для очистки финишного раствора полимиксина В сульфата катионита КУ-2-8чС.

К финишному раствору полимиксина В сульфата добавляют 30,2 г смолы КУ-2-8чС, перемешивают 30 минут, смолу отфильтровывают, промывают 100 мл воды, фильтрат и промывную воду объединяют, сушат и получают 5,13/ 4,4 г полимиксина В основания (60,3% полимиксина В сульфата соответственно). Содержание суммы полимиксинов B (ВЭЖХ) 83,5%, B3 - 2,88, B1-1 - 6,8%, сумма примесей 14,4% - соответствует по качеству фармацевтической субстанции.

Пример 5.

Выполняется аналогично примеру один, за исключением использования для очистки финишного раствора полимиксина В сульфата катионита purolite C-100E.

К финишному раствору полимиксина В сульфата добавляют 29.2 г смолы purolite C-100E, перемешивают 30 минут, смолу отфильтровывают, промывают 90 мл воды, фильтрат и промывную воду объединяют, сушат и получают 5,38/ 4.62 г полимиксина В основания (63,2% полимиксина В сульфата соответственно). Содержание суммы полимиксинов В (ВЭЖХ) 83,9%, B3 - 2,74, B1-1 - 6,3%, сумма примесей 12,8% - соответствует по качеству фармацевтической субстанции.

1. Способ выделения полимиксина B, продуцируемого спорообразующими бактериями Bacillus polymyxa путем очистки нативного раствора, получаемого после отделения биомассы от культуральной жидкости, с использованием неионогенных адсорбентов полистирольного типа с определенными поверхностными параметрами, с элюированием полимиксина B, осаждением полимиксина В основания с последующим переводом его в раствор полимиксина В сульфата, его финишной очисткой и последующей сушкой, отличающийся тем, что нативный раствор полимиксина В очищают с использованием макропористого сильнокислотного катионита, а финишный раствор полимиксина В сульфата перед сушкой обрабатывают сульфокислотным катионитом.

2. Способ получения полимиксина B по п.1, отличающийся тем, что в качестве макропористого сильнокислотного катионита используют Dowex-MSC-1.

3. Способ получения полимиксина B по п.1, отличающийся тем, что в качестве сульфокислотного катионита для обработки финишного раствора полимиксина В сульфата используют КУ-2-20.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к производному полимиксина, где R1, R2 и R3 являются возможными, но не обязательными и R1, R2, R3, R5, R8 и R9 представляют собой катионные или нейтральные аминокислотные остатки, выбранные таким образом, чтобы суммарное число положительных зарядов при физиологическом значении рН составляло по меньшей мере два, но не более чем три.
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения комплекса иммуноглобулинов IgG, IgM и IgA для внутривенного введения. .

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения очищенного рекомбинантного GDF-5-подобного белка. .
Изобретение относится к способу производства 2S-белка канолы, предусматривающий солюбилизацию белков канолы из муки из масличных семян канолы с применением раствора хлорида натрия, имеющего концентрацию соли от 0,25М до 0,35М и pH от 5 до 6 с образованием раствора белков канолы.
Изобретение относится к способу производства 2S-белка канолы, предусматривающий солюбилизацию белков канолы из муки из масличных семян канолы с применением раствора хлорида натрия, имеющего концентрацию соли от 0,25М до 0,35М и pH от 5 до 6 с образованием раствора белков канолы.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к полученным из preS вируса гепатита В (HBV) пептидам, и может быть использовано в медицине

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, а именно к способу очистки бактериоцинов

Способ очистки белка Фактора свертывания VIII из раствора включает: а) контактирование белка с мультимодальной смолой или смолой смешанного типа действия, содержащей лиганды, которые включают гидрофобную часть и отрицательно заряженную часть; b) элюцию белка элюирующим буфером, содержащим по меньшей мере 1,5 М соли и по меньшей мере 40% (вес/объем) этиленгликоля, пропиленгликоля или их смеси и ионы кальция. Способ представляет собой одностадийный хроматографический процесс, при котором происходят захват и очистка белка Фактора свертывания VIII, не требующий доведения рН или электропроводности в ходе стадии загрузки. Способ стабилизации белка Фактора свертывания VIII, при котором происходят захват и стабилизация белка Фактора свертывания VIII за один проход белка через колонку с мультимодальной смолой, содержащей лиганды, которые включают гидрофобную часть и отрицательно заряженную часть, и элюция белка элюирующим буфером, содержащим по меньшей мере 1,5 М соли и по меньшей мере 40% (вес/объем) этиленгликоля, пропиленгликоля или их смеси и ионы кальция. Изобретение обеспечивает сокращение объема колонки примерно в 250 раз и «коэффициент очистки», по меньшей мере равный 30, высокий показатель стабильности для белкового продукта. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 табл., 7 пр.

Предложен способ получения октреотида или его фармацевтически приемлемых солей, таких как октреотида диацетат, в котором линейная пептидная последовательность синтезируется в автоматическом режиме на полимере Ринка, модифицированном N-Fmoc-треонинол-п-карбоксибензацетальным линкером, Fmoc-аминокислоты активируют действием гидроксибензотриазола/O-(бензотриазолN,N,N,N-тетраметилуроний гексафторфосфат)/диизопропил-этиламина (HOBVHBTU/DIEA) в среде диметилформамида, отщепление с полимера с одновременным удалением всех защитных групп проводят действием кислотной смеси, и полностью деблокированный линейный октапептид окисляют с использованием йода. 1 з.п. ф-лы, 1 пр.

Настоящее изобретение предоставляет способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера посредством регулирования рН и содержания спирта реакционной среды. Способ предназначен для предотвращения образования побочных конъюгатов, в которых непептидильный полимер связывается с физиологически важным аминокислотным остатком. 14 з.п. ф-лы, 36 ил., 2 табл., 25 пр.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ очистки антитела, включая антитела, связывающие CD20 и VEGF человека, из композиции, включающей антитело и, по меньшей мере, одно примесное соединение, где указанный способ включает стадии: (a) загрузки композиции на катионообменный материал, где указанная композиция имеет значение первого pH от 4,0 до 6,0; (b) промывки катионообменного материала первым промывочным буфером при pH, значение которого превышает значение pH композиции (а), где pH первого промывочного буфера составляет от 6,8 до 9,0; (c) промывки катионообменного материала вторым промывочным буфером при pH, значение которого меньше значения pH первого промывочного буфера, где второй промывочный буфер имеет проводимость от 0,5 до 3,0 мСм/см и pH от 5,0 до 6,0; и (d) элюирования антитела из катионообменного материала элюирующим буфером при проводимости, по меньшей мере, на 2 мСм/см большей, чем проводимость второго промывочного буфера, где pH второго промывочного буфера и pH элюирующего буфера являются приблизительно одинаковыми и где pH элюирующего буфера составляет от 5,0 до 6,0. Описан способ конъюгирования, включающий конъюгирование очищенного продукта, полученного указанным способом, с гетерологичной молекулой. Также представлен способ получения фармацевтической композиции, включающий объединения указанного очищенного продукта с фармацевтически приемлемым носителем. Изобретение позволяет достичь улучшенной очистки антител, используемых для лечения. 5 н. и 11 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл., 2 пр.

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии. Предложен способ получения ренатурированных мембранных белков. Способ включает получение гомогенного раствора, содержащего денатурированный мембранный белок, смесь детергентов, фосфолипид или смесь фосфолипидов и аполипопротеин или его синтетический аналог с последующим удалением детергентов и формированием липид-белковых нанодисков (ЛПНД), содержащих ренатурированнный белок. Способ обеспечивает получение ренатурированных мембранных белков с высоким выходом, встроенных в ЛПНД, что может найти применение при разработке новых лекарственных препаратов, биокатализаторов, биосенсоров и биофотонных устройств. 8 ил., 2 пр.
Наверх