Способ оценки сорбционной способности клетки
Владельцы патента RU 2492486:
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НЦРВХ" СО РАМН) (RU)
Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к биохимии, и описывает способ оценки сорбционной способности клетки, включающий взятие пробы крови, смешивание и инкубирование взвеси эритроцитов с раствором красителя, центрифугирование смеси, определение оптической плотности надосадочной жидкости и установление сорбционной способности по формуле, причем предварительно взвесь эритроцитов разводят физиологическим раствором до их содержания 5×107, полученную суспензию в соотношении 1:1 смешивают с физиологическим раствором, содержащим 0,005% альцианового синего, полученную смесь инкубируют при температуре 21-24°С, затем центрифугируют при 1000 об/мин, после чего определяют оптическую плотность надосадочной жидкости при длине волны 617 нм, а сорбционную способность устанавливают по формуле, и при величине показателя Псорб, равной или меньше 1,0, сорбционную способность оценивают нормальной, а при Псорб больше 1,0 - сниженной. Способ позволяет оценить состояние защитного слоя клетки за счет определения сорбционной способности примембранного слоя клетки - гликокаликса. Способ может быть использован для контроля эффективности проводимого лечения и оценки состояния пациента в любые сроки терапии. 3 пр., 1 табл.
Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к биохимии и может быть использовано для оценки состояния обменных процессов в клетке при лечении и контроле эффективности проводимых лечебных мероприятий у больных с соматическими заболеваниями.
Известен способ оценки состояния мембран эритроцитов путем измерения степени гемолиза. Метод основан на количественном определении степени гемолиза эритроцитов в забуферных гипотонических растворах хлорида натрия разной концентрации (от 0,85 до 0,10%), термостатировании, снятии спектра при длине волны 540 нм.
К недостаткам данного способа следует отнести низкую воспроизводимость, обусловленную сложностью определения начального и конечного гемолиза, а также длительность исследования. Кроме этого, степень гемолиза отражает проницаемость мембраны эритроцита, не указывая на повреждение структурных компонентов мембраны, таких как гликокаликс, плазмалемма и других (Лабораторные методы исследования в клинике. Под ред. В.В.Меньшикова. М.: Медицина, 1987. С.119-120).
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому и принятому за прототип является определение сорбционной способности эритроцитов (Тогайбаев А.А., Кургузкин А.В., Рикун И.В., Карибжанова P.M. Лабораторное дело, 1988, №9, с.22-27). Известный способ основан на изменении интенсивности окраски восстановленного метиленового синего в присутствии кислых продуктов обмена веществ в клетке.
Известный способ осуществляют следующим образом.
Забирают кровь в пробирку с цитратом натрия, получают взвесь эритроцитов, 1 мл которой смешивают с 0,025% раствора метиленового синего, инкубируют 10 мин, центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин, определяют оптическую плотность надосадочной жидкости при длине волны 630 нм. Расчет производят по формуле: А=100-(С×100)/B,
где А - количество красителя, сорбированного эритроцитами (%);
В - оптическая плотность раствора красителя (у.е.);
С - оптическая плотность надосадочной жидкости (у.е.).
Установленная авторами известного способа сорбционная способность эритроцитов доноров составила 37,12+1,43%, у больных гнойно-септическими заболеваниями - 69,9+2,64%, при инфаркте миокарда - 59,5+4,11%.
К недостаткам данного способа следует отнести то, что он основан на химическом процессе - хемосорбции кислыми метаболитами, являющимися продуктами обмена в клетке, следовательно, известный способ не отражает состояние гликокаликса и не позволяет оценить его сорбционную активность. Известно, что гликокаликс - примембранный слой клетки, который участвует в процессах обмена клетки с внешней средой и в сохранении структурно-функциональных свойств мембраны (Р.Н. Глебов. Эндоцитоз и экзоцитоз. Москва. «Высшая школа». 1987, с.11-27).
Задачей заявляемого технического решения является разработка способа оценки сорбционной способности клетки.
Техническим результатом предлагаемого способа является обеспечение возможности оценки состояния защитного слоя клетки за счет определения сорбционной способности примембранного слоя клетки - гликокаликса.
Технический результат достигается тем, что способ оценки сорбционной способности клетки включает смешивание и инкубирование взвеси эритроцитов с раствором красителя, центрифугирование смеси, определение оптической плотности надосадочной жидкости и установление сорбционной способности по формуле.
Отличительные приемы заявляемого способа заключаются в том, что предварительно взвесь эритроцитов разводят физиологическим раствором до их содержания 5×107, полученную суспензию в соотношении 1:1 смешивают с физиологическим раствором, содержащим 0,005% альцианового синего, полученную смесь инкубируют при температуре 21-24°С, затем центрифугируют при 1000 об/мин, после чего определяют оптическую плотность надо-садочной жидкости при длине волны 617 нм.
Отличительным приемом предлагаемого способа является и то, что сорбционную способность клетки устанавливают по формуле:
Псорб=ε1/ε2, где
Псорб - показатель сорбционной способности
ε1 - оптическая плотность надосадочной жидкости пробы крови больного,
ε2 - оптическая плотность надосадочной жидкости пробы крови донора.
Авторами предлагаемого способа установлено, что и при величине показателя, Псорб равной или меньше 1,0, сорбционную способность оценивают нормальной, а при Псорб больше 1,0 - сниженной.
Проведенный сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемый способ отличается от известных вышеперечисленными приемами и, следовательно, соответствует критерию изобретения "новизна".
Сравнения заявленного технического решения не только с прототипом, но и с другими техническими решениями в биохимии не позволило выявить в них признаки, отличающие заявленное решение не только от способа-прототипа, но и от других аналогичных технических решений.
В доступной литературе нами не выявлено способа оценки показателя сорбционной активности гликокаликса по величинам экстинции растворов альцианового синего.
Особенностью заявленного способа является и то, что показатель сорбционной способности гликокаликса рассчитывают по соотношению величины экстинции надосадочной жидкости пробы крови больного к величине экстинции надосадочной жидкости пробы крови донора (волонтера).
Авторами заявляемого технического решения установлено, что показатель сорбционной способности свидетельствует о нарушении молекулярной структуры мембраны клетки. Так, у доноров Псорб равен или меньше единицы, у больных с распространенным гнойным перитонитом - 5,15±0,12 (p<0,001), панкреонекрозом - 5,69±0,10 (p<0,001), острым лимфолейкозом - 6,42±0,09 (p<0,001), что указывает на выраженные изменения молекулярной структуры мембраны эритроцита и снижение сорбционной активности гликокаликса.
Клинические исследования авторов заявляемого способа свидетельствуют о том, что использование предлагаемого технического решения позволяет установить целостность или нарушения молекулярной структуры мембраны эритроцита и обеспечить возможность контроля за эффективностью проводимого лечения.
Изложенное позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию "изобретательский уровень".
Способ, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в медицине, а именно в клинической практике и биохимии. Возможность его осуществления подтверждена описанными в заявке примерами и, следовательно, предлагаемое решение соответствует критерию изобретения "промышленная применимость".
Заявляемый способ осуществляется следующим образом.
Утром натощак из локтевой вены забирают кровь в пробирку, содержащую 3,8% раствора цитрата натрия. Плазму центрифугируют, отделяют жидкую часть от форменных элементов крови. Полученную суспензию эритроцитов отмывают физиологическим раствором и трехкратно пятиминутно центрифугируют при 3000 об/мин, смешивают 1 мл суспензии с равным объемом физиологического раствора, содержащего 0,005% альцианового синего, инкубируют в течение 10 мин при 21°С и центрифугируют в течение 10 мин при 1000 об/мин, снимают спектр при длине волны 617 нм на СФ-2000.
Клинические исследования заявляемого способа проведены на базе клиники НЦ РВХ СО РАМН и Областной клинической больницы. Всего обследовано 30 больных, из них с распространенным гнойным перитонитом - 9,с панкреонекрозом - 11 и острым лимфолейкозом - 10 пациентов. Также было обследовано 10 практически здоровых людей (волонтеров). Показатель сорбции волонтеров и больных представлен в нижеприведенной таблице.
| Таблица | ||||
| Группы Показатель |
Волонтеры | Больные | ||
| Распространенный гнойный перитонит | Панкреонекроз | Патология крови | ||
| ε | 0,033 | 0,170 | 0,188 | 0,212 |
| 11 сорб | <=1 | 5,15+0,12 | 5,69+0,10 | 6,42+0,09 |
На основании клинических исследований авторами заявляемого способа установлено, что показатель сорбции позволяет оценить состояние примембранного слоя клетки - гликокаликса.
Предложенный способ поясняется примерами конкретного выполнения.
Пример №1 Больной К., история болезни №21124, поступил в реанимационное отделение гнойно-септического центра ОКБ с диагнозом - распространенный гнойный перитонит. При поступлении оптическая плотность надосадочной жидкости суспензии эритроцитов составила 0,176 у.е.
Псорб=0,176/0,033=5,15 у.е.
Полученные данные свидетельсвуют о сниженной сорбционной способности гликокаликса.
После выполнения операции и санации брюшной полости оптическая плотность надосадочной жидкости суспензии эритроцитов этого больного составила 0,153 у.е., следовательно, Псорб=4,6. Клиническое состояние больного улучшилось, об этом свидетельствовал и показатель сорбционной способности, отражающий улучшение сорбции гликокаликсом.
Пример №2. Больной Б., история болезни №24115, поступил в отделение реанимации гнойно-септического центра ОКБ с диагнозом - панкреонекроз. При поступлении показатель сорбции был равен 5,5. После оперативного лечения, дренирования брюшной полости и санации показатель сорбционной способности снизился до 5,0. Это свидетельствовало о некоторой положительной динамике состояния больного, снижении уровня циркулирующих токсических продуктов в крови, увеличении сорбционной активности гликокаликса и нормализации его структурного состояния.
Пример №3. Больной С., история болезни №20305. Поступил в отделение гематологии ОКБ с диагнозом - острый лимфолейкоз. При поступлении показатель сорбции составлял 5,18. После проведенного лечения он значительно снизился и был равен 3,81, что указывало на улучшение сорбционной активности гликокаликса и функционального состояния мембраны эритроцитов.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет оценить сорбционную способность гликокаликса и может быть использован для контроля эффективности проводимого лечения и оценки состояния пациента в любые сроки терапии.
Способ оценки сорбционной способности клетки, включающий взятие пробы крови, смешивание и инкубирование взвеси эритроцитов с раствором красителя, центрифугирование смеси, определение оптической плотности надосадочной жидкости и установление сорбционной способности по формуле, отличающийся тем, что предварительно взвесь эритроцитов разводят физиологическим раствором до их содержания 5×107, полученную суспензию в соотношении 1:1 смешивают с физиологическим раствором, содержащим 0,005% альцианового синего, полученную смесь инкубируют при температуре 21-24°С, затем центрифугируют при 1000 об/мин, после чего определяют оптическую плотность надосадочной жидкости при длине волны 617 нм, а сорбционную способность устанавливают по формуле:
Псорб=ε1/ε2,
где Псорб - показатель сорбционной способности;
ε1 - оптическая плотность надосадочной жидкости пробы крови больного;
ε2 - оптическая плотность надосадочной жидкости пробы крови донора, и при величине показателя Псорб равному или меньше 1,0 сорбционную способность оценивают нормальной, а при Псорб больше 1,0 - сниженной.
