Способ диагностики лептоспироза сельскохозяйственных животных


 


Владельцы патента RU 2493569:

Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии) (RU)

Изобретение относится к ветеринарии. Способ диагностики лептоспироза сельскохозяйственных животных, включающий определение наличия антител к антигенам семи серогрупп L.hebdomadis, L.pomona, L.tarassovi, L.grippotyphosa, L.canicola, L.sejroe и L.icterohaemorrhagiae в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что в качестве антигена применяют смешанные в равных количествах антигенные белки из лептоспир трех серогрупп - L.tarassovi, L.grippotyphosa и L.hebdomadis. Изобретение значительно упрощает и максимально сокращает диагностику лептоспироза, позволяет осуществлять оперативный контроль за эпизоотическим состоянием животных по лептоспирозу. Способ обладает высокой специфичностью, чувствительностью и стандартностью, а также обеспечивает создание безопасных условий труда для персонала диагностических лабораторий. 4 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к диагностике инфекционных заболеваний и может быть использовано для диагностики лептоспироза у сельскохозяйственных животных.

Известен способ диагностики лептоспироза, основанный на использовании реакции микроагглютинации - РМА (ГОСТ 25380-91. Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики лептоспироза. - Взамен ГОСТ 325386-82; введ. 1993-01-01. - М.: Изд-во стандартов, 1992. - 30 с.), который осуществляется путем добавления лептоспирозной культуры к исследуемой сыворотке крови животного с последующим определением титров лептоспирозных антител. В качестве антигенов для обнаружения специфических антител в сыворотке крови животных в РМА используют живые культуры лептоспир. При этом обязательным является использование при плановом исследовании на лептоспироз каждой сыворотки крови минимум семи антигенов (живых лептоспир серогрупп L.hebdomadis, L.pomona, L.tarassovi, L.grippotyphosa, L.canicola, L.sejroe, L.icterohaemorrhagiae). Диагностические штаммы лептоспир лаборатории поддерживают периодическими пересевами через каждые 10-15 дней. В реакции используют культуры лептоспир в возрасте 5-10 дней без признаков агглютинации и лизиса с накоплением микробных клеток 50-100 млн/см3.

Однако известный способ имеет существенные недостатки: большая трудоемкость, субъективная оценка результатов диагностики, невозможность стандартизации проведения диагностики, необходимость учета реакции только под микроскопом. Кроме того, способ требует постоянного поддерживания в стабильном состоянии полного диагностического набора живых лептоспир, что может представлять угрозу здоровью персонала ветеринарных лабораторий.

За прототип принят способ обнаружения лептоспирозных антител в сыворотке крови свиней с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), где для изготовления антигена используют лептоспиры 7-ми серогрупп: L.hebdomadis, L.pomona, L.tarassovi, L.grippotyphosa, L.canicola, L.sejroe, L.icterohaemorrhagiae (см. Патент РФ №2053513, МПК A61K 39/00 от 27.01.96.). Однако данный способ трудоемок, т.к. для получения антигена необходимо использовать лептоспиры 7-ми серогрупп и при этом данный способ не предназначен для выявления лептоспирозных антител у других видов сельскохозяйственных животных.

Задачей изобретения является расширение арсенала способов диагностики лептоспироза, обеспечивающего в короткие сроки с максимальной точностью и объективностью получение результатов, свидетельствующих о наличии в исследуемых сыворотках крови сельскохозяйственных животных антител к патогенным лептоспирам, а также безопасные условия труда для персонала диагностических лабораторий.

Поставленная задача решается тем, что в способе диагностики лептоспироза сельскохозяйственных животных, включающем метод непрямого твердофазного ИФА для выявления антител к антигенам семи серогрупп L.hebdomadis, L.pomona, L.tarassovi, L.grippotyphosa, L.canicola, L.sejroe и L.icterohaemorrhagiae в сыворотке крови, согласно изобретения, в качестве антигена применяют смешанные в равных количествах антигенные белки из лептоспир трех серогрупп - L.tarassovi, L.grippotyphosa и L.hebdomadis. Данный способ позволяет выявлять лептоспирозные антитела у разных видов сельскохозяйственных животных.

Способ осуществляется следующим образом.

Полученным антигеном сенсибилизируют полистироловые планшеты для ИФА в течение 16-18 ч при 20-22°C, с последующим наслаиванием 1% раствора БСА с экспозицией в 1 ч при 37°C и последующей трехкратной промывкой.

В две лунки планшета вносят по 100 мкл положительного контрольного образца (К+), в две другие лунки планшета - по 100 мкл отрицательного контрольного образца (К-). В остальные лунки планшета вносят по 50 мкл разводящего буферного раствор для сывороток (РБР-С) и по 50 мкл исследуемых сывороток. Раствор перемешивают 5 раз пипетированием, не касаясь дна лунки.

После внесения проб сывороток планшет помещают в пластиковый пакет или накрывают крышкой и инкубируют 60 минут при 37°C. После инкубации лунки освобождают от содержимого и пятикратно промывают рабочим фосфатно-солевым буферным раствором с твином (ФСБ-Т).

После промывки в лунки планшета вносят по 100 мкл раствора конъюгата, конъюгированного с пероксидазой хрена (РКг-G); планшет помещают в пластиковый пакет или накрывают крышкой и выдерживают 30 минут при 37°C.

После повторной инкубации лунки освобождают от содержимого и проводят пятикратное промывание рабочим раствором ФСБ-Т. После промывки в лунки планшета вносят по 100 мкл раствора хромоген - тетраметилбензидин субстрата (ТМБ-субстрат) и выдерживают 30 минут при 37°C в темноте. По истечению указанного времени реакцию останавливают добавлением в каждую используемую лунку по 50 мкл стоп-раствора.

Оценка результатов реакции:

Результаты ИФА регистрируют на спектрофотометре. Оптическую плотность (ОП) измеряют при длине волны 450 нм. Нулевой уровень («бланк») задают по воздуху. Рассчитывают ОПкрит. по формуле:

ОПкрит.=ОПК-(ср.)+0,2,

где ОПК-(ср.) - среднее значение ОП (ОПК-) по двум лункам.

Если значение оптической плотности исследуемого образца не превышает ОПкрит., то образцы рассматриваются как отрицательные на наличие лептоспирозных антител к серогруппам L.pomona, L.tarassovi, L.hebdomadis, L.icterohaemorrhagiae, L.grippotyphosa, L.sejroe и L.canicola.

Если значение оптической плотности исследуемого образца превышает ОПкрит., то образцы рассматриваются как положительные на наличие лептоспирозных антител к серогруппам L.pomona, L.tarassovi, L.hebdomadis, L.icterohaemorrhagiae, L.grippotyphosa, L.sejroe и L.canicola в любом сочетании.

Пример 1. Определяли оптимальное сочетание антигенных белков разных серогрупп лептоспир при получении антигена.

Для этого использовали отдельно антигенные белки каждой из 5-ти серогрупп лептоспир (антигенные белки серогрупп L.canicola и L.sejroe отдельно не брали для исследования, т.к. они имеют антигенную структуру идентичную с L.icterohaemorrhagiae и L.hebdomadis соответственно), а также смешанные в равных количествах антигенные белки семи серогрупп.

- №1 антигенные белки L.hebdomadis,

- №2 антигенные белки L.pomona,

- №3 антигенные белки L.tarassovi,

- №4 антигенные белки L.icterohaemorrhagiae,

- №5 антигенные белки L.grippotyphosa,

- №6 антигенные белки L.hebdomadis+L.pomona+L.tarassovi+L.grippotyphosa+L.canicola+L.sejroe+L.icterohaemorrhagiae - поливалентный антиген.

Для исследования в ИФА с изготовленными антигенами использовали сыворотки крови кроликов, сенсибилизированных культурами лептоспир различных серогрупп. Предварительно сыворотки крови исследовали в РМА. В качестве контроля специфичности использовали сыворотку крови интактных кроликов с отрицательной РМА на лептоспироз (табл.1).

Результаты исследований, приведенные в таблице №1, показывают, что при исследовании сывороток крови интактных кроликов с разными антигенами в ИФА во всех случаях получили отрицательные результаты, которые совпали с РМА.

При испытании поливалентного антигена (из L.hebdomadis+L.pomona+L.tarassovi+L.grippotyphosa+L.canicola+L.sejroe+L.icterohaemorrhagiae) положительные показания в ИФА получены у кроликов, сенсибилизированных только L.hebdomadis, L.tarassovi, L.canicola и L.sejroe, т.е. не у всех кроликов.

Максимальное число положительных результатов ИФА при исследовании сыворотки крови кроликов, сенсибилизированных каждым из антигенов семи серогрупп, получено при использовании антигенных белков из L.tarassovi (у кроликов, сенсибилизированных L.pomona, L.tarassovi, L.canicola, L.icterohaemorrhagiae и L.sejroe). Исключение составили сыворотки крови кроликов, сенсибилизированных лептоспирами Grippotyphosa и Hebdomadis, которые дали в ИФА отрицательный результат. Поэтому было решено использовать для изготовления антигена сочетание антигенных белков лептоспир трех серогрупп - L.tarassovi, L.grippotyphosa и L.hebdomadis.

Пример 2. Испытания антигена, полученного из антигенных белков L.tarassovi, L.grippotyphosa и L.hebdomadis, провели с помощью ИФА на сыворотках крови кроликов, интактных и искусственно сенсибилизированных лептоспирами (табл.2).

Таблица 2
Результаты исследования на лептоспироз сыворотки крови кроликов
№ п/п Кролики Результаты РМА Результаты ИФА
К- 0,278
К+ 1,916
1 Сенсибилизированные лептоспирами Grippotyphosa Grip.1/100 2,844
2 Icterohaemorrhagiae Icter. 1/200, Can. 1/100 2,329
3 Pomona Pom. 1/400 2,605
4 Tarassovi Tar. 1/200 3,049
5 Hebdomadis Hebd. 1/200, Sejro 1/100 2,623
6 Canicola Can. 1/100 2,227
7 Sejroe Sejr. 1/200, Hebd. 1/200 3,186
8 смесью семи культур Icter. 1/200, Can. 1/100, Hebd. 1/200, 3,328
Pom.1/100, Grip.1/50, Sejr. 1/100,
Tar. 1/200
9 Интактные отрицательно 0,273

Из таблицы 2 видно, что антиген, полученный с использованием антигенных белков лептоспир 3-х серогрупп - L.tarassovi, L.grippotyphosa и L.hebdomadis, выявил в иммуноферментном анализе антитела у всех кроликов, сенсибилизированных лептоспирами как каждой из семи серогрупп, так и смесью лептоспир семи серогрупп.

Интактные кролики в ИФА дали отрицательный результат.

Пример 3. Разработанным антигеном в ИФА провели тестирование 25 проб сывороток крови крупного рогатого скота, часть которых были положительными на наличие лептоспирозных антител по результатам реакции микроагглютинации - РМА (табл.3).

Таблица 3
Результаты исследования на лептоспироз сыворотки крови крупного рогатого скота
№ п/п Крупный рогатый скот Результаты РМА Результаты ИФА
К- 0,278
К+ 1,916
1 нереагирующие на лептоспироз Отрицательно 0,15
2 Отрицательно 0,345
3 Отрицательно 0,196
4 Отрицательно 0,2
5 Отрицательно 0,197
6 Отрицательно 0,186
7 Отрицательно 0,191
8 Отрицательно 0,248
9 Отрицательно 0,268
10 Отрицательно 0,263
11 реагирующие на лептоспироз Hebd. 1/50 0,77
12 Hebd. 1/200 0,804
13 Tar. 1/100 1,23
14 Tar. 1/50 1,065
15 Pom. 1/50 0,649
16 Heb. 1/400, Sejr. 1/100 0,570
17 Sejr. 1/50, Hebd. 1/100, Tar. 1/200 0,779
18 Pom. 1/400 0,857
19 Pom. 1/200, Grip.1/100 1,146
20 Heb. 1/50, Tar. 1/100, Pom. 1/800, Grip.1/200 1,692
21 Grip.1/50, Icter. 1/100 1,15
22 Heb. 1/50, Sejr. 1/50, Tar. 1/50, Pom. 1/100 1,34
23 Heb. 1/50, Sejr. 1/50 0,609
24 Pom. 1/100 0,76
25 Heb. 1/50, Grip.1/50, Tar. 1/100, Icter. 1/50 1,097

В результате установлено, что все сыворотки крови, положительные по результатам РМА, дали положительный результат в ИФА с использованием антигенных белков лептоспир 3-х серогрупп - L.tarassovi, L.grippotyphosa и L.hebdomadis (100% животных). Отрицательно реагирующий в РМА крупный рогатый скот в ИФА дал отрицательный результат (100% животных).

Пример 4. Разработанным антигеном в ИФА провели тестирование 14 проб сывороток крови свиней, часть которых были положительными на наличие лептоспирозных антител по результатам реакции микроагглютинации - РМА (табл.4).

Таблица 4
Результаты исследования на лептоспироз сыворотки крови свиней
№ п/п Свиньи Результаты РМА Результаты ИФА
К- 0,278
К+ 1,916
1 нереагирующие на лептоспироз отрицательно 0,163
2 отрицательно 0,387
3 отрицательно 0,305
4 отрицательно 0,266
5 отрицательно 0,332
6 отрицательно 0,157
7 реагирующие на лептоспироз Pom.1/50 0,641
8 Pom.1/100 1,034
9 Pom.1/100 3,021
10 Pom.1/50 0,763
11 Pom.1/400 3,417
12 Pom.1/200 3,224
3 Pom.1/400, Icter. 1/800 1,214
14 Pom.1/800, Icter. 1/100 2,137

Из таблицы 4 видно, что все сыворотки крови свиней, положительные по результатам РМА, дали положительный результат в ИФА с использованием антигенных белков лептоспир 3-х серогрупп - L.tarassovi, L.grippotyphosa и L.hebdomadis (100% животных). Отрицательно реагирующие в РМА свиньи в ИФА дали отрицательный результат (100% животных).

Таким образом, предлагаемый способ диагностики лептоспироза у сельскохозяйственных животных с помощью метода непрямого твердофазного иммуноферментного анализа с использованием антигенных белков лептоспир 3-х серогрупп - L.tarassovi, L.grippotyphosa и L.hebdomadis значительно упрощает диагностику лептоспироза, благодаря применению в качестве антигенов убитых штаммов лептоспир, вследствие чего устраняются большие трудности, связанные с необходимостью поддержания и использования в лабораториях полного диагностического набора живых лептоспир. Кроме того, упрощается учет полученных результатов реакции, который проводится на спектрофотометре, а не в темном поле зрения микроскопа, как при РМА, исключается возможность неправильной интерпретации результатов.

Данный способ обладает быстротой постановки и учета, безопасностью и стандартностью, обеспечивает быстрое выявление антител к любому антигену из семи распространенных серогрупп возбудителя, что позволяет оперативно и систематически осуществлять контроль за эпизоотическим состоянием животных по лептоспирозу.

Предлагаемый способ диагностики лептоспироза позволяет ставить диагноз на данное заболевание в минимально короткие сроки, обладает высокой специфичностью и чувствительностью.

Способ диагностики лептоспироза сельскохозяйственных животных, включающий определение наличия антител к антигенам семи серогрупп L.hebdomadis, L.pomona, L.tarassovi, L.grippotyphosa, L.canicola, L.sejroe и L.icterohaemorrhagiae в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что в качестве антигена применяют смешанные в равных количествах антигенные белки из лептоспир трех серогрупп - L.tarassovi, L.grippotyphosa и L.hebdomadis.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицины, а именно к хирургии, и может быть использовано для прогнозирования тяжести течения послеоперационного периода у больных калькулезным холециститом.
Изобретение относится к ветеринарии, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для серологической диагностики вирусных желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа, преимущественно рота-, коронавирусного энтеритов, вирусной диареи крупного рогатого скота.
Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии и аллергологии, и может быть использовано для прогнозирования развития атопических заболеваний у новорожденных.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения количества и (или) функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения количества и (или) функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Изобретение относится к способу определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Изобретение относится к новому комплексному антигену вируса кори для использования в качестве компонента иммуноферментной диагностической тест-системы и может быть использовано в медицинской вирусологии и микробиологии.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ прогнозирования гематогенного метастазирования при диффузном типе рака желудка путем иммуногистохимического исследования препаратов первичной опухоли.
Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантологии и может быть использовано для прогнозирования развития необратимой дисфункции трансплантата у реципиентов после трансплантации сердца.

Настоящее изобретение относится к области молекулярной иммунологии, биотехнологии и медицины. Предложено однодоменное антитело (наноантитело), специфически связывающее карциноэмбриональный антиген (СЕА) человека и охарактеризованное через полную аминокислотную последовательность.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии и медицины. Предложено однодоменное антитело (наноантитело), специфически связывающее белок муцин 1 (MUC1) человека и охарактеризованное через полную аминокислотную последовательность.

Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии, и касается прогнозирования эффективности лечения диабетической полинейропатии у больных сахарным диабетом 2 типа и дислипидемией.
Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, трансплантологии и хирургии, и может быть использовано для проведения мониторинга донор-специфических антител к системе HLA после аллотрансплантации органа в течение пяти лет и более.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике туберкулеза, и может быть использовано для определения видовой идентификации микобактерий у лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза.

Изобретение относится к области:- медицины, а именно к диагностике нарушений функции гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и мониторингу эффективности проводимой терапии; - иммуно-диагностики, а именно к определению уровня содержания натуральных антител в сыворотке крови; - пептидной химии, а именно к конструированию и модификации синтетических пептидных фрагментов для использования в качестве антигена для определения натуральных антител к природным белкам человеческого организма, в частности для определения натуральных антител к белку S100 человека.
Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к получению эритроцитарного антительного диагностикума для индикации бруцелл в патматериале. Сущность изобретения включает способ получения эритроцитарного антительного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с целью индикации бруцелл в патматериале, посредством изготовления формалинизированных эритроцитов, с последующей сенсибилизацией позитивной бруцеллезной сывороткой, при этом для изготовления эритроцитарного антительного диагностикума позитивную бруцеллезную сыворотку для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов разводят 1:50-1:100, инактивируют при 60°C в течение 30 минут, сенсибилизируют формалинизированные эритроциты, из расчета: осадок от 2 объемов 40%-ной взвеси эритроцитов барана, 1 объем 0,43-0,44% раствора свежеприготовленного амидола, 1,0-1,5 объем позитивной сыворотки, разведенной 1:50-1:100, и выдерживают в течение 28-32 минут при 55-56°C. Изобретение позволяет получить обладающий высокой активностью и специфичностью эритроцитарный бруцеллезный антительный диагностикум. 4 табл.
Наверх