Постоянная линия клеток omg из гонад радужной форели (oncorhynchus mykiss)

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, в частности к получению перевиваемых линий клеток. Постоянная линия клеток получена из ткани гонад радужной форели путем длительного пассирования на среде Игла MEM на солях Эрла с 25 мМ HEPES с 10% эмбриональной сыворотки. Линия может быть использована как тест-культура для выделения, накопления, титрования и изучения вируса инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых (IPNV), вирусной геморрагической септицемии лососевых (VHSV), инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых (IHNV), весенней виремии карпов (SVCV), герпес-вируса карпа кои (KHV), герпес-вируса осетровых (SbSHV). Постоянная линия клеток OMG найдет широкое применение в лабораторных исследованиях по вирусологии и в биотехнологии при производстве вирус-вакцин и диагностикумов. 1 табл.

 

Предполагаемое изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, в частности, к получению перевиваемых линий клеток, используемых при вирусологических и биотехнологических исследованиях.

Вирусные болезни рыб являются одним из основных сдерживающих факторов развития мировой аквакультуры. В связи с завозом из-за рубежа рыбопосадочного материала и экзотических видов рыб в последние годы в стране значительно обострилась эпизоотическая ситуация по особо опасным и карантинируемым вирусным болезням рыб. Метод культуры клеток позволяет моделировать процессы, происходящие в организме при взаимодействии с различными патогенными факторами, исследовать молекулярный характер инфекционного процесса, изучать репликацию вирусов, их ростовые показатели, с целью получения антигенов для производства вакцин и до сих пор остается «золотым стандартом» в диагностике заболеваний рыб вирусной природы.

В мире известны более 30 линий клеток, полученных из разных органов и тканей радужной форели, и только одна из них RTO, фибробластоподобной морфологии, была получена из ткани яичников [1]. Однако ее чувствительность к вирусам не была определена, таким образом невозможно использовать ее в работах по выделению и изучению вирусов-возбудителей опасных заболеваний рыб.

Известна также линия клеток ICO, полученная из гонад неполовозрелого карпа (Cyprinus carpio), используемая для выделения и культивирования вирусов рыб различных таксономических групп.

Морфологические признаки: линия представлена эпителиоподобными клетками, преимущественно однородными, их форма близка к кубической. Ядра крупные округлые, число ядрышек от 1 до 3, чаще 1. Ядрышки крупные, при окраске по Паппенгейму окружены зоной просветления, цитоплазма гомогенная. Модальный класс - 90 хромосом, с интервалом изменчивости от 71 до 178, величина модального класса 36%.

Культуральные свойства: клетки культивируют в среде Игла 2 MEM с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Снимают с использованием стандартных растворов трипсина 0,25% и версена 0,02% в соотношении 5:7, с коэффициентом пересева 1:5. Монослой формируется через сутки после посева при посевной концентрации 3×105 кл./см2, при температуре 18-25°С.

Криоконсервация клеток: криозащитная среда следующего состава: ДМСО - 10%, фетальная сыворотка - 30%, среда Игла 2 MEM - 60%. Концентрация клеток при замораживании составляет 1-3 млн. кл./мл.

Линия клеток ICO чувствительна к вирусу весенней виремии карпов, вирусной геморрагической септицемии, инфекционного некроза гемопоэтической ткани, рабдовируса европейского угря, рабдовируса мальков щуки и иридовируса угря [2 прототип]. Однако, данная линия не обладает чувствительностью к вирусам инфекционного некроза поджелудочной железы и герпесвирусу осетровых.

В задачу наших исследований входило - получить перевиваемую линию клеток из гонад половозрелой радужной форели, обладающую высокой чувствительностью к ихтиовирусам различных таксономических групп.

Предложенная линия клеток получена из первично-трипсинизированной ткани гонад половозрелой (3-ая стадия по шкале Киселевича) радужной форели путем длительного пассирования на среде Игла MEM на солях Эрла с 25 мМ HEPES с 10% эмбриональной сыворотки.

Линия клеток гонад радужной форели (Oncorhynchus mykiss) названа авторами OMG и депонирована в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (СХЖ РАСХН) под номером 75 в 2010 году.

Предложенная линия обладает следующими свойствами:

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ - постоянная линия радужной форели представляет собой ровный, плотный монослой из клеток эпителиоподобной, полигональной формы, с крупными ядрами округлой или овальной формы с 1-3 ядрышками. Клетки делятся обычным двуполюсным митозом. Кариотип соответствует видовому признаку форели, модальный класс содержит 60 хромосом (2n=60) и составляет 77%.

Видовая идентичность подтверждена кариологическими методами.

КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА - клетки выращивают при температуре - 15-22°С в пристеночных условиях в сосудах различной емкости; ростовой средой является среда Игла MEM на солях Эрла с 25 мМ HEPES с 10% эмбриональной сыворотки без антибиотиков, рН среды 7,4-7,6. Дезагрегацию монослоя при субкультивировании осуществляют смесью трипсина 0,25% и версена 0,02% (4:1), кратность рассева 1:3-6. Посевная концентрация 250-300×103 клеток/мл. Первые сутки после субкультивирования содержат при 20-22°С, для формирования монослоя, через 2 суток монослой переносят на хранение при 15°С. частота пересева 1 раз 2-3 недели.

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ - линия клеток чувствительна к вирусам инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых (IPNV), вирусной геморрагической септицемии лососевых (VHSV), инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых (IHNV), весенней виремии карпов (SVCV), герпесвирусу карпа кои (KHV), герпесвирусу осетровых (SbSHV).

КРИОКОНСЕРВАЦИЯ - криоконсервацию осуществляют по 2-ступечатому методу. Температуру снижают по 1-2°С до -30°С, далее по 3-5°С до -70°С. По достижении -70°С ампулы с клетками помещают в жидкий азот. Криозащитную среду готовят следующим образом: среда культивирования - 50%, сыворотка эмбриональная телячья - 40%, ДМСО - 10%, концентрация - 3-4 млн.кл/мл.

КОНТРОЛЬ НА ПОСТОРОННИЕ КОНТАМИНАНТЫ - при исследовании клеточной линии OMG на наличие бактерий, грибов, микоплазм и латентных вирусов получены отрицательные результаты.

ПРИМЕР: Культуру клеток OMG культивируют на среде Игла MEM на солях Эрла с 25 мМ HEPES с 10% эмбриональной сыворотки без антибиотиков. При пересеве клетки снимают со стекла (пластика) 0,25% раствором трипсина и 0,02% раствором версена (4:1) при температуре 22°С. Монослой формируется на 1-2 сутки культивирования. После образования монослоя культуру заражают вирусом и инкубируют при температуре оптимальной для исследуемого вируса.

Экспериментальные данные по чувствительности клеточной линии OMG к патогенным вирусам рыб приведены в таблице 1.

Таблица 1
Вирус Культуры клеток
OMG Референтная для данного вируса
Проявление ЦПД вируса, суток. Титр вируса ТЦД50/мл Проявление ЦПД вируса, час. Проявление ЦПД вируса, час.
инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых (IPNV), 2 109,0 3 RTG-2/108,0
геморрагической септицемии лососевых (VHSV) 3 108,0 2 ЕРС/107,5
инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых (IHNV) 3 108,75 3 ЕРС/107,5
весенней виремии карпов (SVCV) 5 106,6 5 ЕРС/108,0
герпес-карпа кои (KHV) 2 109,0 2 FHM/107,5
герпес-осетровых (SbSHV) 5 106,0 5 WSSK-1/106,0

Титры исследованных вирусов в культуре клеток OMG через 5 дней инкубации на порядок выше, чем в референтной для каждого вируса культуре.

Предложенная клеточная линия апробирована с положительным результатом в лаборатории ихтиопатологии ВИЭВ с января 2010 по январь 2012 года для накопления, титрования и изучения вируса инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых (IPNV), вирусной геморрагической септицемии лососевых (VHSV), инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых (IHNV), весенней виремии карпов (SVCV), герпес вируса карпа кои (KHV), герпес вируса осетровых (SbSHV) и для диагностической работы по выявлению этих вирусов при мониторинговых исследованиях.

Постоянная линия клеток OMG найдет широкое применение в лабораторных исследованиях по вирусологии и в биотехнологии при производстве вирус-вакцин и диагностикумов.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Li M.F. A quantitative study of the effects of naturally occurring supplements on the growth of rainbow trout gonadal cells / M.F.Li, J.E.Stewart // Can.J.Microbiol. - 1965. - Vol.11. - p.9-14.

2. Патент №23533650 C12N 5/06 от 27.04.2009.

Постоянная линия клеток OMG из гонад радужной форели (Oncorhynchus mykiss), используемая для вирусологических исследований и чувствительная к 6 вирусам разных видов рыб, разводимых в условиях аквакультуры, депонирована в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных Российской коллекции культур клеток при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии (СХЖ РАСХН) под №75.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу динамической оценки состояния реципиента после трансплантации трупной печени. Сущность способа состоит в том, что проводят одновременное определение в периферической крови пациента процентного содержания циркулирующих стволовых гемопоэтических клеток CD34+ (СГК) и объемного содержания лимфоцитов (Лф, млн/мл), находят их индивидуальное отношение R по формуле R=ЛФ/СГК и строят кривую степенной зависимости R (ось ординат) от СГК (ось абсцисс), используя ее затем в качестве калибровочной кривой в системе двойных логарифмических координат, а для оценки состояния реципиента в текущий момент в его периферической крови определяют ЛФ и СГК, находят их отношение Rp, положение его в калибровочной системе координат.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ стимулирования экспансии гематопоэтических стволовых клеток (HSC) in vitro или in vivo.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для продукции фактора роста эндотелия сосудов человека - белка VEGF-A165 с тремя DED-эпитопами (3×DED-эпитопоп) на С-конце белка, которые не влияют на его биологическую активность и позволяют проводить очистку белка.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу оценки степени пролиферации лимфоцитов с помощью маркерных генов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР РВ).

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению популяции Tr1-клеток, направленных против антигена, ассоциированного с рассеянным склерозом, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано для получения рекомбинантных белков в культуре клеток.
Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии и касается линии клеток из плавников сибирского осетра (Acipenser baeri). .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению популяции Tr1 клеток человека, направленных против пищевого антигена из обычного рациона человека, и может быть использовано в медицине. Выделяют популяцию Tr1 клеток, направленных против пищевого антигена из обычного рациона человека и имеющих в состоянии покоя фенотип CD4+CD25-FoxP3-. Полученную популяцию Tr1 клеток в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, либо в комбинации с одним или более фармацевтическим средством, применяемым для лечения воспалительных состояний кишечника и выбираемым из группы, включающей анти-TNF, натализумаб, анти-IL1, анти-IL-6, анти-IL-12, анти-IL-17 и анти-IL-23, аналоги антагониста рецептора IL-1,5 аминосалициловую кислоту и ее аналоги, кортикоиды, пробиотики, метотрексат, азатиоприн, 6-меркаптопурин, талидомид, лефлуномид, используют в составе фармацевтических композиций для лечения воспалительных состояний кишечника. Изобретение позволяет получить эффективное средство для лечения воспалительных состояний кишечника. 3 н. и 12 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл., 2 пр.

Настоящее изобретение относится к биохимии и представляет собой средство для стимуляции синтеза белков теплового шока HSP 70 в клетках человека и животных. Средство включает, по меньшей мере, одно фенольное соединение из группы производных коричной кислоты или смесь таких соединений и неионогенное поверхностно активное вещество или смесь таких веществ в количестве не менее 75 весовых %. Изобретение позволяет получить косметические средства, биологически активные добавки и пищевые продукты на основе описанного средства и использовать их для стимуляции репаративных процессов в клетке и для снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур. 7 н. и 23 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 табл., 49 пр.

Изобретение относится к области ветеринарии и клеточных технологий. Предложен способ лечения экспериментального туберкулеза легких у мышей с использованием трансплантации стволовых клеток путем введения в хвостовую вену мышей один раз в неделю суспензии стволовых клеток, выделенных из костей мышей гибридов, резистентных к туберкулезу, с генотипом "k" в области H-2E. 3 табл.
Изобретение относится к области цитологии и биотехнологии. Предложен способ культивирования клеток человека и животных на питательной среде, содержащей сыворотку крови плодов буйволиц в объемном соотношении 5-7% сыворотки и 93-95% среды, с последующим инкубированием культур при 37°C в течение 3-5 суток до формирования монослоя. Изобретение может быть использовано для культивирования клеток в культуре. 2 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарной вирусологии. Предложен способ получения эпителиоподобных клеток легкого плода буйволицы путем длительного беспересевного культивирования, обладающих высокой чувствительностью к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, парагриппа-3, вирусной диареи - болезни слизистых оболочек и аденовирусной инфекции. Изобретение может быть использовано при диагностике вирусных инфекций. 4 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ выделения стволовых клеток, включающий центрифугирование гепаринизированного костного мозга с гидроксиэтилкрахмалом в соотношении исходных ингредиентов 1:2 со скоростью 700g в течение 15 мин в замкнутой системе трех гематологических контейнеров, соединенных между собой трубками, с последующим удалением примесей жира и плазмы в контейнер №1, перевод мононуклеарной фракции костного мозга, части супернатанта и эритроцитов, примыкающих к линии разделения двух сред, в контейнер №2, при этом в основном контейнере остаются сладжированные эритроциты и костные фрагменты, центрифугирование полученного образца со скоростью 900g в течение 15 мин в контейнере №2 для получения клеточного материала для внутрисосудистого введения, при этом после упомянутого центрифугирования удаляют часть супернатанта в контейнер №1 без разгерметизации системы. Благодаря получению паракринного эффекта мононуклеаров костного мозга и обеспечению безопасности способ может быть использован в медицине для внутрисосудистого введения полученного клеточного материала, а также в регенераторной терапии в области кардиологии, в частности, с целью внутрисосудистого введения для регенерации органа. 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к экспериментальной иммунологии, и может быть использовано в медицине. Способ модификации моноцитов периферической крови включает выделение фракции периферических мононуклеарных клеток (МНК) из венозной крови, которое проводят с использованием двойного градиента плотности перколла: 1,064 г/мл и 1,032 г/мл соответственно, при комнатной температуре +20°C. После этого выделенные моноциты помещают в полную питательную культуральную среду для адгезии к пластику. Затем по истечении 2 часов осуществляют замену полной питательной культуральной среды с добавлением 20 нг/мл IL4 и 20 нг/мл GM-CSF. При этом модификацию моноцитов осуществляют путем стимуляции негидролизируемым аналогом аденозина NECA (5'-N-этилкарбоксамидоаденозина) в концентрации 100 µМ при инкубации клеток в CO2-инкубаторе во влажной атмосфере 5% CO2 при +37°C в течение 72 часов. Изобретение позволяет провести модификацию клеток периферической крови с целью повышения их репаративного потенциала при аутологической трансплантации. 8 ил., 1 пр.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены пептиды, представляющие собой Т-клеточные эпитопы эндотелиального маркера опухоли (ТЕМ8), которые способны индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) в присутствии антиген-презентирующих клеток или экзосом, несущих или содержащих HLA-A*0201. Предложена фармацевтическая композиция для уничтожения клеток, экспрессирующих ТЕМ8, выделенные экзосома и антиген-презентирующая клетка, несущие комплекс, содержащий пептид по изобретению с молекулой HLA-A*0201. Рассмотрены способы индукции антиген-презентирующей клетки, которые могут индуцировать CTL, которые уничтожают клетки, экспрессирующие ТЕМ8, и индукции цитотоксических клеток. Предложенное изобретение может найти дальнейшее применение в лечении рака. 8 н. и 2 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 табл.

Настоящее изобретение относится к медицине и касается способа культивирования клеток пульпы зуба без нарушения функции, присущей клеткам пульпы зуба в живом организме, и способа транспортировки удаленного зуба для хранения. Способ забора клеток пульпы зуба включает: нанесение прямолинейной риски на поверхность удаленного зуба, раскол удаленного зуба по риске, и обнажение пульпы зуба, и замачивание удаленного зуба в среде, и перенос замоченного зуба при поддержании при подходящей для хранения клеток температуре. Изобретение обеспечивает транспортировку удаленного зуба для культивирования и консервации клеток пульпы зуба. 5 з.п. ф-лы, 1 пр., 5 ил., 2 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен способ оценки морфофункционального состояния индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) больных паркинсонизмом путем проведения их дифференцировки в дофаминергические нейроны, для чего воздействуют на ИПСК факторами, индуцирующими их дифференцировку в дофаминергические нейроны, а затем высаживают их на мультиэлектродную матрицу, обработанную опорным субстратом матригель/фибронектин, после чего, начиная с 3-5 дня вплоть до 8-10 дня, проводят динамическую регистрацию сетевой спонтанной биоэлектрической активности и при наличие к 3-5 дню сетевой спонтанной биоэлектрической активности в виде одиночных спайков, а к 8-10 дню упорядоченной пачечной спайковой активности на сформированном на микроэлектродах монослое оценивают морфофункциональное состояние как нейрональную направленность дифференцировки ИПСК в дофаминергические нейроны. Изобретение может быть использовано для характеристики репрограммированных клеточных линий больных паркинсонизмом и проверки их способности дифференцироваться в определенный фенотип нейронов в целях транспланталогии и при тестировании лекарств. 1 з.п. ф-лы, 4 ил, 1 пр.

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, в частности к получению перевиваемых линий клеток. Постоянная линия клеток получена из ткани гонад радужной форели путем длительного пассирования на среде Игла MEM на солях Эрла с 25 мМ HEPES с 10 эмбриональной сыворотки. Линия может быть использована как тест-культура для выделения, накопления, титрования и изучения вируса инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых, вирусной геморрагической септицемии лососевых, инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых, весенней виремии карпов, герпес-вируса карпа кои, герпес-вируса осетровых. Постоянная линия клеток OMG найдет широкое применение в лабораторных исследованиях по вирусологии и в биотехнологии при производстве вирус-вакцин и диагностикумов. 1 табл.

Наверх