Способ извлечения азатиоприна из биологических жидкостей



 


Владельцы патента RU 2495425:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" (RU)

Изобретение относится к токсикологической и аналитической химии, а именно к способу извлечения азатиоприна из биологических жидкостей, заключающийся в том, что анализируемую пробу обрабатывают осаждающим белки реагентом, в качестве которого используется ацетон, извлечение отделяют от выпавшего осадка путем фильтрования, ацетон из фильтрата испаряют в токе воздуха при комнатной температуре, водный остаток разбавляют водой, образующийся раствор обрабатывают сульфатом аммония, экстрагируют 0,9 моль/дм3 раствором диметилфталата в смеси 1,4-диоксан-хлороформ, взятых в объемном отношении 1:1 при соотношении водной и органической фаз 5:1 по объему, органический экстрагент отделяют, а количество перешедшего в экстракт анализируемого соединения определяют по величине оптической плотности экстракта, разбавленного в 10 раз 1,4-диоксаном, проводя измерения при длине волны 279 нм. Изобретение обеспечивает повышение степени извлечения азатиоприна из биологических жидкостей. 2 пр., 3 табл.

 

Изобретение относится к биологии, токсикологической и аналитической химии, а именно к способам извлечения азатиоприна из биологических жидкостей, и может быть использовано в практике химико-токсикологических и клинических лабораторий для извлечения азатиоприна из биологических жидкостей с целью его последующего определения. Способ относится к числу массовых.

Известен способ извлечения производных пурина (кофеина) из биологической жидкости (раствора альбумина), состоящий в том, что анализируемую пробу обрабатывают раствором пепсина в растворе хлороводородной кислоты, доводят реакцию среды полученной смеси до рН 4, инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа, экстрагируют трижды хлороформом при соотношении объемов водной и органической фаз 1:1, экстракты объединяют, остаток растворяют в фосфатном буфере с рН 7,4, полученный раствор фильтруют и определяют количество извлеченного производного пурина по величине оптической плотности фильтрата, измеренной при длине волны 273 нм (Стрелова О.Ю., Чувина Н.А. Изолирование кофеина из крови с применением ферментативного гидролиза на примере модельного вещества // Судебно-медицинская экспертиза. - 2008. - Т.51, №4. - С.28-31).

Способ отличается трудоемкостью и относительно низкой степенью извлечения.

Известен способ извлечения производных пурина из биожидкостей (крови), заключающийся в том, что анализируемую пробу обрабатывают сульфатом аммония, выдерживают в течение 30 минут при перемешивании, раствор центрифугируют при 3000 оборотах в минуту, центрифугат отделяют, доводят его реакцию до рН 4,0-5,0, экстрагируют трижды хлороформом при соотношении водной и органической фаз на каждой стадии экстракции 1:1, экстракты объединяют, экстрагент испаряют, остаток растворяют в фосфатном буфере с рН 7,4, полученный раствор фильтруют и определяют количество извлеченного вещества по величине оптической плотности, измеренной при длине волны 273 нм (Стрелова О.Ю., Чувина Н.А. Оценка эффективности методов изолирования токсических веществ из крови // Судебно-медицинская экспертиза. - 2008. - Т.51, №4. - С.22-24).

Способ характеризуется недостаточно высокой степенью извлечения.

Наиболее близким является способ извлечения производных пурина (к которым относится и азатиоприн) из плазмы крови, состоящий в том, что анализируемую пробу обрабатывают осаждающим белки реагентом, в качестве которого используется хлорная кислота, извлечение отделяют от выпавшего осадка центрифугированием, центрифугат обрабатывают раствором гидроксида натрия, избыток щелочи нейтрализуют раствором хлороводородной кислоты, полученный раствор экстрагируют смесью органических растворителей хлороформ-пропанол-2, взятых в объемном отношении 1:1, органический экстракт отделяют центрифугированием, экстрагент испаряют до сухого остатка, остаток растворяют в подвижной фазе и определяют количество перешедшего в экстракт анализируемого соединения методом ВЭЖХ по площади хроматографического пика (Dobrocky P., Bennet P.N., Natarianny L.J. Rapid method for the routine determination of caffeini and its metabolites by high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. Biomed. AppL - 1994. - Vol.652, №1. - P.104-108).

Способ характеризуется недостаточно высокой степенью извлечения. Техническим результатом настоящего изобретения является повышение степени извлечения.

Технический результат достигается тем, что анализируемую пробу обрабатывают осаждающим белки реагентом, в качестве которого используется ацетон, извлечение отделяют от выпавшего осадка путем фильтрования, ацетон из фильтрата испаряют в токе воздуха при комнатной температуре, водный остаток разбавляют водой, образующийся раствор обрабатывают сульфатом аммония, экстрагируют 0,9 моль/дм3 раствором диметилфталата в смеси 1,4-диоксан-хлороформ, взятых в объемном отношении 1:1 при соотношении водной и органической фаз 5:1 по объему, органический экстрагент отделяют, а количество перешедшего в экстракт анализируемого соединения определяют по величине оптической плотности экстракта, разбавленного в 10 раз 1,4-диоксаном, проводя измерения при длине волны 279 нм.

Способ осуществляется следующим образом: плазму крови, содержащую азатиоприн, обрабатывают осаждающим белки реагентом, в качестве которого используется ацетон, извлечение отделяют от выпавшего осадка путем фильтрования, ацетон из фильтрата испаряют в токе воздуха при комнатной температуре, водный остаток разбавляют водой, образующийся раствор обрабатывают сульфатом аммония, экстрагируют 0,9 моль/дм3 раствором диметилфталата в смеси 1,4-диоксан-хлороформ, взятых в объемном отношении 1:1 при соотношении водной и органической фаз 5:1 по объему, органический экстрагент отделяют, а количество перешедшего в экстракт анализируемого соединения определяют по величине оптической плотности экстракта, разбавленного в 10 раз 1,4-диоксаном, проводя измерения при длине волны 279 нм.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Извлечение азатиоприна из плазмы крови

В 5 г плазмы крови человека вносят 1 мг азатиоприна в виде 0,5 см3 0,1% раствора, тщательно перемешивают биологическую жидкость с веществом. Полученную смесь обрабатывают 10 см3 осаждающего белки реагента, в качестве которого используют ацетон, и оставляют на 5 минут при перемешивании. По истечении указанного времени жидкое извлечение отделяют от выпавшего осадка путем фильтрования через бумажный фильтр. Фильтр и осадок на фильтре промывают 5 см3 ацетона. Порции фильтрата объединяют в выпарительной чашке и испаряют ацетон в токе воздуха при комнатной температуре. К водному остатку фильтрата добавляют 5 см воды, в образующийся раствор вводят сульфат аммония до получения насыщенного водно-солевого раствора, который экстрагируют 2 см3 0,9 моль/дм3 раствора диметилфталата в смеси 1,4-диоксан-хлороформ, взятых в объемном отношении 1:1, на вибросмесителе в течение 8 минут, после чего раствор оставляют на 3-5 минут для расслаивания системы, органический экстракт отделяет 0,2 см экстракта вносят в мерную колбу вместимостью 10 см, доводят до метки 1,4-диоксаном и измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре СФ-2000 при длине волны 279 нм в кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм. Измерения проводят на фоне раствора, полученного в контрольном опыте. По величине оптической плотности определяют количество азатиоприна, перешедшее в слой экстрагента, используя уравнение градуировочного графика. Рассчитывают степень извлечения азатиоприна как отношение количества вещества, перешедшего в слой экстрагента, в процентах к его количеству, внесенному в биологическую жидкость.

Построение градуировочного графика

В ряд мерных колб вместимостью 10 мл вносят 0,1, 0,2, 0,4, 1,0, 1,6, 2,0 см3 0,01% раствора азатиоприна в хлороформе, по 0,2 см3 0,9 моль/дм3 раствора диметилфталата в смеси 1,4-диоксан-хлороформ, взятых в объемном отношении 1:1, и доводят 1,4-диоксаном до метки. Оптическую плотность образующихся растворов измеряют на спектрофотометре СФ-2000 при 279 нм в кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм. Измерения проводят на фоне раствора, полученного в контрольном опыте.

По результатам измерения оптической плотности серии растворов с известными концентрациями азатиоприна строят график зависимости оптической плотности от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 1,0 - 20,0 мкг/см3. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имеет вид:

А=0,06285-С+0,00124,

где А - оптическая плотность; С - концентрация анализируемого вещества (мкг в 1 см3 фотометрируемого раствора).

Результаты извлечения азатиоприна из плазмы крови представлены в таблице 1.

Пример 2

Извлечение азатиоприна из мочи

В 5 г мочи человека вносят 1 мг азатиоприна в виде 0,5 см3 0,1% раствора, тщательно перемешивают биологическую жидкость с веществом. Полученную смесь обрабатывают 10 см осаждающего белки реагента, в качестве которого используют ацетон, и оставляют на 5 минут при перемешивании. По истечении указанного времени жидкое извлечение отделяют от выпавшего осадка путем фильтрования через бумажный фильтр. Фильтр и осадок на фильтре промывают 5 см3 ацетона. Порции фильтрата объединяют в выпарительной чашке и испаряют ацетон в токе воздуха при комнатой температуре. К водному остатку фильтрата добавляют 5 см3 воды, в образующийся раствор вводят сульфат аммония до получения насыщенного водно-солевого раствора, который экстрагируют 2 см3 0,9 моль/дм3 раствора диметилфталата в смеси 1,4-диоксан-хлороформ, взятых в объемном отношении 1:1, на вибросмесителе в течение 8 минут, после чего раствор оставляют на 3-5 минут для расслаивания системы, органический экстракт отделяют, 0,2 см3 экстракта вносят в мерную колбу вместимостью 10 см3, доводят до метки 1,4-диоксаном и измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре СФ-2000 при длине волны 279 нм в кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм. Измерения проводят на фоне раствора положенного в контрольном опыте. По величине оптической плотности определяют количество азатиоприна, перешедшее в слой экстрагента, используя уравнение градуировочного графика. Рассчитывают степень извлечения азатиоприна как отношение количества вещества, перешедшего в слой экстрагента, в процентах к его количеству, внесенному в биологическую жидкость.

Схема построения градуировочного графика для определения азатиоприна и уравнение этого графика представлены выше в примере 1.

Результаты извлечения азатиоприна из мочи представлены в таблице 2.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом на 7-8% повышает степень извлечения азатиоприна из биологических жидкостей.

Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов представлена в таблице 3.

Таблица 1
Результаты извлечения азатиоприна из плазмы крови (n=5; Р=0,95)
Внесено азатиоприна в плазму крови, мг Найдено Метрологические характеристики
мг Степень извлечения R, %
1,00 0,9810 98,10 x ¯ =97,33
1,00 0,9621 96,21 S=1,06
1,00 0,9812 98,12 S x ¯ =0,47
1,00 0,9808 98,08 Δ x ¯ =1,32
1,00 0,9613 96,13 ε=1,35
Таблица 2
Результаты извлечения азатиоприна из мочи (n=5; Р=0,95)
Внесоно азатиоприна в мочу, мг Найдено Метрологические характеристики
мг Степень извлечения R, %
1,00 0,9792 97,92 x ¯ =98,11
1,00 0,9811 98,11 S=0,66
1,00 0,9849 98,99 S x ¯ =0,29
1,00 0,9833 98,33 Δ x ¯ =0,82
1,00 0,9768 97,18 ε=0,83
Таблица 3
Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов (n=5; P=0,95)
Сравниваемые показатели Предлагаемый способ Известный способ
1. Степень извлечения из плазмы крови 97,33% 90,26%
2. Степень извлечения из мочи 98,11% 90,43%

Способ извлечения азатиоприна из биологических жидкостей, заключающийся в том, что анализируемую пробу обрабатывают осаждающим белки реагентом, извлечение отделяют от выпавшего осадка, экстрагируют смесью органических растворителей и определяют количество перешедшего в экстракт анализируемого соединения, отличающийся тем, что в качестве осаждающего белки реагента используется ацетон, после отделения извлечения от выпавшего осадка ацетон испаряют в токе воздуха при комнатной температуре, водный остаток разбавляют водой, обрабатывают сульфатом аммония. экстрагируют 0,9 моль/дм3 раствором диметилфталата в смеси 1,4-диоксан-хлороформ, взятых в объемном соотношении 1:1 при соотношении водной и органической фаз 5:1 по объему, а количество перешедшего в экстракт анализируемого соединения определяют по величине оптической плотности экстракта, разбавленного в 10 раз 1.4-диоксаном, проводя измерения при длине волны 279 нм.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическим исследованиям в онкологии, и описывает способ прогнозирования возникновения рецидивов рака шейки матки, включающий биохимическое исследование суточной мочи больной, при котором в суточной моче определяют андростерон и этиохоланолон, вычисляют отношение между ними и при величине отношения 0,75 мг/сут и ниже прогнозируют рецидив болезни в первые 2 года, а при величине, превышающей 0,75 мг/сут, - длительный безрецидивный период до 10 лет и более.
Изобретение относится к медицине и предназначено для определения тактики лечения детей, больных гастроэзофагеальной рефлюксной болезнью. .
Изобретение относится к медицине, а именно - к диагностике в хирургии. .

Изобретение относится к области аналитической химии и клинической диагностики. .
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для раннего выявления диссеминации злокачественного процесса. .

Изобретение относится к медицине и описывает способ определения реабсорбции кальция (CaR) при нарушении его гомеостаза, где осуществляют забор крови, центрифугированием отделяют сыворотку крови и определяют в ней креатинин, добавляют к 1,5-2,0 мл сыворотки крови 5% раствор карбогена в азоте и получают ультрафильтрат сыворотки крови, для чего используют фильтр, задерживающий молекулы с молекулярной массой свыше 50000 MW, определяют концентрацию кальция в ультрафильтрате в ммоль/л (CaUF), одновременно с забором крови осуществляют сбор мочи после приема 300-500 мл дистиллированной воды, затем определяют в моче концентрацию кальция и креатинина, рассчитывают клиренс креатинина (GFR), определяют экскрецию кальция из 1 литра клубочкового фильтрата (CaE/GFR), для чего концентрацию кальция в моче умножают на минутный диурез и полученный результат делят на клиренс креатинина; далее определяют разницу между CaUF и CaE/GFR, получая CaR, строят номограмму зависимости значений CaR от CaUF, определяют границу области допустимых значений, соответствующую здоровым людям, при этом, если определенные у пациента значения, лежат в области допустимых значений, выносят суждение о нормальной реабсорбции кальция, при расположении определенных величин выше области допустимых значений выносят суждение об увеличенной реабсорбции кальция и о сниженной реабсорбции кальция - при их расположении ниже нижней границы области допустимых значений.
Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, и касается способа прогнозирования развития смешанной клещевой энцефалит-боррелиозной инфекции. .
Изобретение относится к медицине и касается способа прогнозирования развития рецидива стенокардии после реваскуляризации миокарда. .

Изобретение относится к области медицины и касается способа прогнозирования эффективности иммуносупрессивной терапии хронического гломерулонефрита с нефротическим синдромом.
Изобретение относится к медицине и может и касается способа определения динамики тяжести состояния больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом. .

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для оценки индуцирующего действия цитомегаловирусной инфекции на характер течения беременности на фоне снижения в периферической крови α-фетопротеина.

Изобретение относится к медицине, а именно к оториноларингологии, и может быть использовано для определения функциональной активности лимфоцитов при хроническом аденоидите у детей, а также для оценки тяжести и вариантов течения заболевания.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для выбора антибиотика при лечении инфекционно-воспалительных заболеваний.
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для оценки индуцирующего действия цитомегаловирусной инфекции на характер течения беременности в первом триместре гестации.

Способ относится к лабораторным методам исследования в гематологии и физиологии и применяется для оценки α- и β2-адренореактивности эритроцитов человека по изменению их осмотической резистентности под влиянием адреналина и адреноблокаторов.

Изобретение относится к клинической иммунологии, в частности к исследованию метаболической активности фагоцитов крови. .

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для прогнозирования развития респираторных болезней у новорожденных телят. .

Изобретение относится к медицинской технике, а именно к устройствам и способам исследования биомеханических свойств крови. .
Изобретение относится к медицине и предназначено для дифференциальной диагностики инфекционного и алкогольного гастроэнтеритов. .
Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии. .

Изобретение относится к медицине, а именно офтальмологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики раноприобретенной и врожденной формы прогрессирующей миопии.
Наверх