Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с4 комплемента человека


 


Владельцы патента RU 2495432:

Федеральное Бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Группа изобретений относится к медицинской иммунологии, а именно к способу определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах и набору для ее определения. Сущность способа в том, что в лунках микропанели сорбируют тромбин, как активатор компонента С4, затем вносят пробу, содержащую компонент С4 комплемента человека с неизвестной активностью, проводят инкубацию в присутствии ЭДТА, а затем вносят конъюгат фермента с антителами против компонента С4 человека и субстрат этого фермента, расчет активности компонента С4 проводят по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Набор для определения функциональной активности компонента С4 комплемента человека содержит плоскодонную микропанель с сорбированным тромбином, конъюгат фермента с антителами к компоненту С4 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови с известной активностью С4 в качестве стандарта. Группа изобретений позволяет определять функциональную активность компонента С4 системы комплемента человека и обладает хорошей воспроизводимостью результатов и отсутствием необходимости активации всей системы комплемента. 2 н.п. ф-лы, 1 ил.

 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса.

Известны способы иммуноферментного определения функциональной активности компонента C4 [1], которые предусматривают сорбцию в лунках микропанели активаторов комплемента - иммуноглобулина G или липополисахарида, затем внесения в лунки микропанели комплемента морской свинки, служащего в качестве источника компонентов C1, C2 и C4 (присутствующий компонент C4 морской свинки не обнаруживается специфическими антителами против C4 человека) и анализируемой пробы, содержащей компонент C4 человека с неизвестной активностью, и проведения инкубации для активации комплемента, в ходе которой происходит связывание C4 на молекулах активатора. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента C4 человека определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к C4, конъюгированных с ферментом.

Недостатком всех этих способов является участие в процессе активации компонента C4, C3 конвертазы, формируемой из компонентов комплемента морской свинки, поскольку при проведении определения активности компонента C4 в сыворотках крови неизбежно создаются условия активации комплемента по классическому пути, что затрагивает и другие компоненты комплемента и может приводить к их неспецифической сорбции на поверхности лунок микропанели.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа и набора на основе иммуноферментного метода, позволяющего определять функциональную активность компонента C4 комплемента человека с использованием доступного и хорошо сохраняемого в обычных условиях коммерческого препарата тромбина для использования в качестве активатора компонента C4 без активации комплемента и без применения источников других компонентов или факторов комплемента.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения и набора. Способ определения предусматривает сорбцию в лунках микропанели аптечного препарата тромбина, хорошо сохраняемого в обычных условиях, затем внесение в лунки микропанели раствора, содержащего компонент C4 комплемента человека с неизвестной активностью, проведение инкубации в присутствии этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА) для блокирования всех путей активации комплемента, в ходе которой происходит активация функционально активного C4 и ковалентное связывание последнего на сорбированном тромбине, выливание содержимого лунок, а затем внесение конъюгата фермента с антителами против компонента C4 человека, отмывание несвязавшегося конъюгата, внесение субстрата конъюгированного фермента и проведение расчета активности компонента C4 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Тем самым достигается определение функциональной активности C4 иммуноферментным методом, пригодным для стандартизации.

Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным тромбином, конъюгат фермента с антителами к компоненту C4 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови с известной активностью С4 в качестве стандарта.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа и набора для иммуноферментного определения функциональной активности компонента C4 комплемента человека, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов и отсутствием необходимости активации системы комплемента, активаторов ее и компонентов и факторов комплемента, дополнительно вносимых в систему для проведения определения.

Пример 1. Иммуноферментное определение функциональной активности компонента C4 комплемента человека. Растворяют препарат тромбина быка в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, pH 9,5, с конечной концентрацией 100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°C. Три раза отмывают микропанель 0,2 М натрий-фосфатным буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 50 мМ ЭДТА (этилендиаминтетраацетат натрия), заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем микропанель осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл VBS2+. В лунки микропанели вносят по 100 мкл раствора, содержащего определяемый компонент C4 в том же буфере. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, трехкратной отмывки фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% Твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против C4 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, пятикратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (3,3′,5,5′-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 15-30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Количество активного компонента C4 рассчитывают по стандартной кривой (рис.1).

На рис.1 представлено определение функциональной активности компонента C4 комплемента человека методом иммуноферментного анализа.

Пример 2. Набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента C4. Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным тромбином, конъюгат пероксидазы с антителами к компоненту C4 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови с известным содержанием активного компонента C4 в качестве стандарта. Данный набор используется в соответствии с примером 1.

Из приведенных результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации активного компонента C4 c коэффициентом корреляции R2=0.9986, что позволяет достоверно определять функциональную активность компонента C4 в концентрациях от 0,4 нг/мл описанным способом с использованием описанного набора.

ЛИТЕРАТУРА

1. Козлов Л.В., Скороходова Т.Г., Баталова Т.Н., Лахтин В.М., Матвеевская Н.С., Гузова В.А., Дьяков В.Л. Способ определения функциональной активности компонента C4 комплемента человека (варианты). Патент 2149406. Бюл. №14. 20.05.2000.

2. Козлов Л.В., Скороходова Т.Г., Баталова Т.Н., Лахтин В.М., Матвеевская Н.С., Гузова В.А., Дьяков В.Л. Способ определения функциональной активности компонента C4 комплемента человека. Патент 2162601. Бюл. №3. 27.01.2001.

1. Способ иммуноферментного определения функциональной активности компонента С4 комплемента человека, отличающийся тем, что в лунках микропанели сорбируют тромбин, затем в лунки микропанели вносят анализируемую пробу, содержащую компонент С4 комплемента человека с неизвестной активностью, проводят инкубацию в присутствии этилендиаминтетраацетата натрия, выливают содержимое лунок, а затем вносят конъюгат фермента с антителами против компонента С4 человека и субстрат этого фермента, после чего проводят расчет активности компонента С4 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.

2. Набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента С4 комплемента человека, характеризующийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированным тромбином, конъюгат фермента с антителами к компоненту С4 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови с известной активностью С4 в качестве стандарта.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, в частности к способу прогнозирования развития репродуктивных нарушений. Сущность способа состоит в том, что у мужчин исследуют эякулят, а у женщин - цервикальное отделяемое на десятый день менструального цикла, в качестве параметров определяют уровни интерлейкина 1 бета и интерферона гамма одновременно.

Изобретение относится к медицине и предназначено для оценки эффективности лечения ингибитором тирозинкиназ первого поколения иматинибом мезилатом (гливеком) хронического миелолейкоза.
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и может быть использовано при прогнозировании развития внутриутробного инфицирования плода при гриппе A(H3N2) у женщин во втором триместре гестации с угрозой невынашивания беременности.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу динамической оценки состояния реципиента после трансплантации трупной печени. Сущность способа состоит в том, что проводят одновременное определение в периферической крови пациента процентного содержания циркулирующих стволовых гемопоэтических клеток CD34+ (СГК) и объемного содержания лимфоцитов (Лф, млн/мл), находят их индивидуальное отношение R по формуле R=ЛФ/СГК и строят кривую степенной зависимости R (ось ординат) от СГК (ось абсцисс), используя ее затем в качестве калибровочной кривой в системе двойных логарифмических координат, а для оценки состояния реципиента в текущий момент в его периферической крови определяют ЛФ и СГК, находят их отношение Rp, положение его в калибровочной системе координат.

Настоящее изобретение относится к области медицины и фармации, а именно к биохимии клеточных мембран человека, и описывает способ оценки влияния лекарственных веществ на проницаемость мембран эритроцитов по натрию с использованием определения скорости Na+-Li+-противотранспорта в мембране эритроцита, при котором измеряют скорость обмена внутриклеточного лития в загруженных этим ионом клетках на внеклеточный натрий из среды инкубации, причем исследуемое вещество вносят в среду 1-часовой инкубации, содержащую в мМ: 150 - NaCl; 10 - глюкозы; 10 - Hepes-Tris; 0,1 - уабаина, и по изменению величины скорости Na+-Li+-противотранспорта в мембране эритроцита судят о влиянии вещества на проницаемость клеточной мембраны по натрию.
Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, патологической анатомии, и может быть использовано для прогнозирования воспалительных осложнений после операций по поводу колоректального рака.
Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к получению эритроцитарного антительного диагностикума для индикации бруцелл в патматериале. Сущность изобретения включает способ получения эритроцитарного антительного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с целью индикации бруцелл в патматериале, посредством изготовления формалинизированных эритроцитов, с последующей сенсибилизацией позитивной бруцеллезной сывороткой, при этом для изготовления эритроцитарного антительного диагностикума позитивную бруцеллезную сыворотку для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов разводят 1:50-1:100, инактивируют при 60°C в течение 30 минут, сенсибилизируют формалинизированные эритроциты, из расчета: осадок от 2 объемов 40%-ной взвеси эритроцитов барана, 1 объем 0,43-0,44% раствора свежеприготовленного амидола, 1,0-1,5 объем позитивной сыворотки, разведенной 1:50-1:100, и выдерживают в течение 28-32 минут при 55-56°C.

Изобретение относится к ветеринарии. Способ диагностики лептоспироза сельскохозяйственных животных, включающий определение наличия антител к антигенам семи серогрупп L.hebdomadis, L.pomona, L.tarassovi, L.grippotyphosa, L.canicola, L.sejroe и L.icterohaemorrhagiae в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что в качестве антигена применяют смешанные в равных количествах антигенные белки из лептоспир трех серогрупп - L.tarassovi, L.grippotyphosa и L.hebdomadis.

Изобретение относится к ветеринарии. Способ диагностики лептоспироза сельскохозяйственных животных, включающий определение наличия антител к антигенам семи серогрупп L.hebdomadis, L.pomona, L.tarassovi, L.grippotyphosa, L.canicola, L.sejroe и L.icterohaemorrhagiae в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что в качестве антигена применяют смешанные в равных количествах антигенные белки из лептоспир трех серогрупп - L.tarassovi, L.grippotyphosa и L.hebdomadis.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ прогнозирования гематогенного метастазирования при диффузном типе рака желудка путем иммуногистохимического исследования препаратов первичной опухоли.

Изобретение относится к области медицины. Предложен набор реагентов для иммуноферментного определения антител к эндогенным биорегуляторам в сыворотке крови для выявления заболеваний зависимости методом двухстадийного иммуноферментного анализа в сыворотке крови человека in vitro. Набор включает 96-луночный разборный стрипованный планшет с нанесенными на его поверхность последовательно всеми конъюгатами из ряда: β-эндорфин, серотонин, дофамин, гистамин, орфанин и ангиотензин; а также емкости, содержащие положительные и отрицательные контрольные образцы, антивидовые антитела против иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой из корня хрена, фосфатно-солевой буферный раствор, содержащий твин-20, субстратный буферный раствор, раствор субстрата тетраметилбензидина и стоп-реагент. Изобретение обеспечивает повышение точности определения заболеваний зависимости, в том числе алкоголизма, наркомании, токсикомании, пищевой зависимости и гэмблинга (игромания), за счет использования набора из шести маркеров. 3 табл., 9 пр.

Изобретение относится к области медицины. Предложен набор для многопрофильного иммунологического анализа антител в препаратах крови. Набор включает подложку, которая представляет собой пластину в виде гребня, на поверхности каждого зубца которого дискретно нанесены антигены возбудителей вирусных инфекций и положительный контроль в виде иммуноглобулинов человека, в качестве отрицательного контроля один из сегментов зубца подложки оставлен свободным от специфических белков для оценки фоновых явлений, причем подложка дополнительно блокирована неспецифическими природными или синтетическими полимерами. В состав набора также входит емкость для проведения анализа, выполненная в виде многоячеистой аналитической ванны с возможностью введения каждого зубца подложки в отдельную ячейку ванны, растворы для отмывок, разведения образца и конъюгата, конъюгат и систему проявления. Изобретение обеспечивает усовершенствованную тест-систему для диагностики инфекционных заболеваний, в том числе для оценки у детей гуморального иммунитета к вакциноуправляемым вирусным инфекциям: кори, краснухе, эпидемическому паротиту и полиомиелиту. 6 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 2 пр.
Настоящее изобретение относится к клинической биохимии и описывает способ определения модифицированных липопротеинов низкой плотности (мЛПНП) в сыворотке (плазме) крови человека путем обработки буфером, содержащим поливинилпирролидон (ПВП) с последующей турбидиметрической регистрацией смеси, где обработку сыворотки или плазмы крови человека ведут 10% раствором ПВП-35000±5000 в 0,01 М Трис-HCl-буфере, рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCl, при объемном соотношении сыворотка(плазма) : ПВП от (1:2) до (1:10), инкубируют 10 мин при комнатной температуре, измеряют светопоглощение в опытной и контрольной пробах, вычисляют разность между ними и при величине разности более 15 Е констатируют повышенный уровень атерогенных мЛПНП в крови и наличие атеросклеротического процесса у обследуемого человека. Использование простого, доступного и быстрого в осуществлении способа определения мЛПНП в крови человека позволяет проводить скрининговые обследования с целью выявления наличия атеросклеротического процесса на доклинической стадии и диспансеризацию населения. 5 пр., 5 табл.
Изобретение относится к области медицины, в частности гастроэнтерологии, а именно к способу прогнозирования развития избыточного бактериального роста в кишечнике у пациентов, перенесших холецистэктомию. Сущность способа состоит в том, что у пациентов, перенесших холецистэктомию, в сыворотке крови определяют уровень антител к миелопероксидазе. При уровне антител к миелопероксидазе свыше 200,0 Ед/мл прогноз развития избыточного бактериального роста в кишечнике считают положительным. Использование заявленного способа позволяет повысить точность и чувствительность прогнозирования развития бактериального роста в кишечнике у пациента, перенесшего холецистэктомию. 1 табл., 3 пр.
Настоящее изобретение относится к области аналитической химии и описывает способ высокочувствительного определения хлорамфеникола с помощью пьезокварцевого иммуносенсора, основанный на регистрации изменения частоты колебания сенсора в связи с изменением массы покрытия, включающий регенерацию рецепторного покрытия для проведения последующих определений, обеспечивая многократное использование сенсора, где на поверхность пьезокварцевого иммуносенсора наносят рецепторное покрытие на основе хлорамфеникол-белкового конъюгата (соевый трипсиновый ингибитор), к пробе добавляют фиксированное количество антител к хлорамфениколу и выдерживают в течение 5-10 мин при 20°С до образования иммунокомплекса, вводят в проточно-инжекторную ячейку и регистрируют изменение частоты колебания сенсора при взаимодействии хлорамфеникол-белкового конъюгата с несвязавшимися антителами к хлорамфениколу, аналитический отклик сенсора обратно пропорционален концентрации хлорамфеникола в анализируемом растворе, концентрацию определяют по градуировочному графику, регенерацию рецепторного покрытия осуществляют пропусканием 0,04 mM раствора тиоционата калия над поверхностью электрода сенсора. Способ позволяет проводить определение содержания хлорамфеникола в пищевой продукции в диапазоне концентраций 0,5-100,0 нг/мл. 9 пр., 1 табл.

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии, и может быть использовано для подбора иммунотропных препаратов у пациентов с ургентной хирургической патологией органов брюшной полости. Задачей предлагаемого способа является подбор наиболее эффективных иммунотропных препаратов или их комбинаций для иммунокоррекции у пациентов с ургентной хирургической патологией органов брюшной полости. Поставленную задачу решают за счет того, что рассчитывают значения пятнадцати главных компонент, определяющих организацию показателей иммунного статуса, затем определяют принадлежность показателей пациента к кластеру главных компонент, рассчитывают дистанцию показателей пациента от центра кластера главных компонент, затем вычисляют эффективность каждого из препаратов, затем рассчитывают значения de TCmax с различным количеством наиболее эффективных препаратов, после чего определяют наибольшее из полученных значений de TCmax, которому соответствует наиболее эффективный препарат или сочетание препаратов для иммунотропной терапии. Способ позволяет осуществлять подбор оптимального состава иммунотропной терапии с использованием как одного, так и нескольких препаратов в оптимальных сочетаниях. 14 табл.
Изобретение относится к медицине, а именно к психиатрии, и может быть использовано для прогнозирования эффективности лечения непсихотических вариантов психоорганического синдрома. Для этого больному до и через 10 дней после начала лечения определяют количественное содержание моноцитов периферической крови с экспрессией рецепторов HLA-DR+. При его увеличении более 10% по сравнению с исходным прогнозируют положительный эффект лечения непсихотических вариантов психоорганического синдрома. Использование данного способа расширяет арсенал маркеров прогнозирования эффективности лечения непсихотических вариантов психоорганического синдрома, что способствует повышению точности прогноза и подбору адекватной терапии, а также сокращению сроков лечения. 1 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу снижения предела обнаружения иммунохроматографических методов контроля содержания низкомолекулярных соединений. Способ включает проведение в ходе движения реагентов вдоль иммунохроматографической тест-полоски конкурентного взаимодействия специфических антител с определяемым соединением (антигеном) в пробе и конъюгатом антиген-белок, иммобилизованным на поверхности рабочей мембраны тест-полоски. Выявляют окрашенные комплексы в результате иммобилизации коллоидного маркера в составе комплекса с конъюгатом антиген-белок. При этом первая стадия представляет собой конкурентное взаимодействие свободных специфических антител с антигеном в пробе и с иммобилизованным на поверхности рабочей мембраны конъюгатом антиген-белок. Вторая стадия представляет собой взаимодействие образовавшихся комплексов специфических антител и конъюгата антиген-белок с антивидовыми антителами, меченными коллоидным маркером. Предложенное изобретение позволяет уменьшить количество специфических антител на стадии конкурентного взаимодействия и благодаря этому снизить предел обнаружения. 5 ил., 1 пр.
Настоящее изобретение относится к медицине и описывает способ выявления наличия гиперкоагуляции и активации внутрисосудистого свертывания у больных с впервые выявленным острым лимфобластным лейкозом путем лабораторного исследования антигена фактора Виллебранда, тромбомодулина, D-димеров, где без исследования целого ряда показателей плазменного гемостаза, таких как протромбиновый индекс, концентрация фибриногена и РФМК, время ХIIа-ЗЭЛ, активность антитромбина III, протеина С, плазминогена и ф.VIII, отклонения которых характеризуют состояние гиперкоагуляции, при уровне указанных маркеров нарушения функции эндотелия, превышающих 152% (ФB:Ag) и 3,99 нг/мл (ТМ), и увеличении D-димеров до 2001-2500 нг/мл и более с высокой долей вероятности устанавливают наличие гиперкоагуляции и активации внутрисосудистого свертывания. Способ обеспечивает определение наличия гиперкоагуляции и активации внутрисосудистого свертывания у больных острым лимфобластным лейкозом без инфекционных осложнений при диагностике заболевания. 1 табл., 1 пр.

Способ одновременного определения двух аналитов биолюминесцентным молекулярным микроанализом относится к биохимии, а именно к способам проведения иммуноферментного и ДНК гибридизационного анализа. Способ одновременного определения двух аналитов биолюминесцентным молекулярным микроанализом включает обработку твердой фазы биоспецифическим реагентом, отделение непрореагировавшей жидкой фазы, обработку твердой фазы ферментосодержащим конъюгатом, разделение жидкой и твердой фаз и анализ твердой фазы, в котором в качестве биоспецифического реагента для первой обработки твердой фазы используют два иммуноглобулина или один иммуноглобулин с двойной специфичностью или два олигонуклеотида, а конечную обработку твердой фазы проводят одновременно двумя ферментсодержащими конъюгатами, состоящими, соответственно, из рекомбинантных Cа2+ зависимых фотопротеинов обелинов с разными характеристиками биолюминесценции и молекул разной биоспецифичностью, где в качестве рекомбинантных обелинов используют обелин W92F; H22E и обелин Y138F, с последующим анализом на планшетном биолюминометре с быстро перемещающимися широкополостными светофильтрами с разделением сигналов и по спектру и по времени. 4 ил., 3 пр.
Наверх