Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера



Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера
Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера

 

C07K1/18 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2495881:

ХАНМИ ХОЛДИНГС КО., ЛТД. (KR)

Настоящее изобретение предоставляет способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера посредством регулирования рН и содержания спирта реакционной среды. Способ предназначен для предотвращения образования побочных конъюгатов, в которых непептидильный полимер связывается с физиологически важным аминокислотным остатком. 14 з.п. ф-лы, 36 ил., 2 табл., 25 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к способу получения сайт-специфического физиологически активного полипептидного конъюгата, более конкретно - к способу получения указанного конъюгата с высоким выходом посредством связывания физиологически активного полипептида с непептидильным полимером.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пептиды легко денатурируются вследствие своей низкой стабильности, in vivo деградации протеазами и экскреции через почки вследствие своего относительно малого размера. В связи с этим, для того, чтобы поддерживать специфическую концентрацию в крови пептидного лекарственного средства в его активной форме необходимо часто вводить пептидное лекарственное средство пациенту. Однако пептидные лекарственные средства обычно вводятся в форме инъецируемых препаратов, и такое частое введение вызывает тяжелый дискомфорт у пациентов. Для решения этой проблемы был разработан ряд способов, например, способ переноса пептидного лекарственного средства посредством ротоглоточной или носоглоточной ингаляции путем увеличения проникновения пептидного лекарственного средства через биологические мембраны, способ модификации специфической аминокислотной последовательности, которая чувствительна к протеазам (например, аминокислотная последовательность GLP-1 для предотвращения утраты титров посредством дипептидил пептидазы), для того, чтобы стабилизировать пептид посредством ингибирования деградации ферментом, и способ химического присоединения непептидильного полимера с высокой растворимостью, такого как полиэтиленгликоль (PEG) к поверхности пептида.

PEG, который был использован как один из непептидильных полимеров, не специфически связывается со специфическим сайтом или множеством сайтов целевого полипептида для приобретения эффекта увеличения молекулярной массы пептида, полученный PEG-пептид препятствует выведению через почки и ферментативному гидролизу без каких-либо побочных эффектов. Например, в Международной Патентной Публикации № WO 2006/076471 описывается поддержание физиологической активности натрийуретического пептида B-типа (BNP), используемого как терапевтический агент при застойной сердечной недостаточности посредством связывания с ним PEG, и в Патенте США №6924264 описывается увеличение in vivo времени удержания лекарственного средства эксендина-4 путем связывания PEG с его лизиновым остатком.

Эти способы удлиняют in vivo время удержания пептидного лекарственного средства посредством увеличения молекулярной массы PEG, но по мере того, как молекулярная масса увеличивается, титр пептидного лекарственного средства значительно снижается. В дополнение не специфическое связывание PEG может защищать активный домен физиологически активного полипептида от значительного снижения активности полипептида.

Поэтому существует необходимость в разработке улучшенного способа получения конъюгата физиологически активного полипептида и непептидильного полимера, в котором полимер связан с пептидом сайт-специфическим образом, который не влияет на полипептидную активность.

Авторы настоящего изобретения разработали изобретение посредством подтверждения того, что физиологически активный полипептидный конъюгат, содержащий сайт-специфически связанный непептидильный полимер, может быть получен с высоким выходом посредством регулирования pH и содержания спирта реакционной среды.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В связи с этим целью настоящего изобретения является предоставление высокопродуктивного способа получения физиологически активного полипептидного конъюгата, в котором непептидильный полимер сайт-специфически связывается с физиологически активным полипептидом.

В соответствии с одним аспектом по настоящему изобретению предоставляется способ получения сайт-специфического физиологически активного полипептидного конъюгата, включающий стадии: i) проведения реакции физиологически активного полипептида и непептидильного полимера в реакционной среде, которая содержит специфическое количество спирта и имеет специфический pH, дающие возможность непептидильному полимеру связываться с целевым сайтом физиологически активного полипептида; и ii) выделения и очистки физиологически активного полипептидного конъюгата из реакционной смеси стадии (i) посредством ионообменной хроматографии с использованием спирта.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Вышеуказанные и другие цели и признаки настоящего изобретения станут очевидными из следующего описания изобретения, которое представлено в связи с прилагаемыми чертежами, которые соответственно показывают:

Фиг.1: профиль очистки позиционных изомеров DA-эксендин-4-PEG с использованием колонки SOURCE S;

Фиг.2: профиль очистки позиционных изомеров CA-эксендин-4-PEG с использованием колонки SOURCE S;

Фиг.3: график, показывающий Lys27-пегилированные изомеры, полученные, когда CA-эксендин-4 пегилируется при варьирующем pH;

Фиг.4: график, показывающий Lys27-пегилированные изомеры, полученные, когда CA-эксендин-4 пегилируется при варьирующем pH и в 45% EtOH;

Фиг.5: график, показывающий Lys27-пегилированные изомеры, полученные, когда CA-эксендин-4 пегилируется при pH 7,5 и в варьирующем количестве (%) этанола;

Фиг.6: график, показывающий Lys27-пегилированные изомеры, полученные, когда CA-эксендин-4 пегилируется при pH 7,5 и в варьирующем количестве (%) изопропанола;

Фиг.7: анализ SDS-PAGE [электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия] CA-эксендин-4-PEG-Fc иммуноглобулин;

Фиг.8: анализ SDS-PAGE CA-эксендин-PEG Lys12 и Lys27;

Фиг.9: анализ профиля Lys12-пегилированных изомеров CA-эксендин-4 посредством пептидного картирования;

Фиг.10: анализ профиля Lys27-пегилированных изомеров CA-эксендин-4 посредством пептидного картирования;

Фиг.11: профиль очистки позиционных изомеров оксинтомодулин-PEG с использованием колонки SOURCE S;

Фиг.12: профиль очистки позиционных изомеров имидазоацетил оксинтомодулин-PEG с использованием колонки SOURCE S;

Фиг.13: анализ профиля Lys30-пегилированных изомеров оксинтомодулина посредством пептидного картирования;

Фиг.14: профиль очистки конъюгата имидазоацетил оксинтомодулин-PEG и Fc иммуноглобулина с использованием колонки SOURCE Q;

Фиг.15: анализ SDS-PAGE конъюгата имидазоацетил оксинтомодулин-PEG и Fc иммуноглобулина;

Фиг.16: профиль очистки позиционных изомеров аналога оксинтомодулина-PEG с использованием колонки SOURCE S;

Фиг.17: анализ профиля Lys27-пегилированных изомеров аналога оксинтомодулина посредством пептидного картирования;

Фиг.18: профиль очистки позиционных изомеров аналога имидазоацетил оксинтомодулин-PEG с использованием колонки SOURCE S;

Фиг.19: анализ профиля Lys27-пегилированных изомеров аналога имидазоацетил оксинтомодулина посредством пептидного картирования;

Фиг.20: профиль очистки конъюгата аналога имидазоацетил оксинтомодулин-PEG и Fc иммуноглобулина с использованием колонки SOURCE Q;

Фиг.21: анализ SDS-PAGE конъюгата аналога имидазоацетил оксинтомодулин-PEG и Fc иммуноглобулина;

Фиг.22: профиль очистки позиционных изомеров GLP-1-PEG с использованием колонки SOURCE S;

Фиг.23: анализ профиля Lys34-пегилированных изомеров GLP-1 посредством пептидного картирования;

Фиг.24: профиль очистки позиционных изомеров имидазоацетил GLP-1-PEG с использованием колонки SOURCE S;

Фиг.25: анализ профиля Lys34-пегилированных изомеров имидазоацетил GLP-1 посредством пептидного картирования;

Фиг.26: профиль очистки конъюгата имидазоацетил GLP-1-PEG и Fc иммуноглобулина с использованием колонки SOURCE Phe;

Фиг.27: анализ SDS-PAGE конъюгата имидазоацетил GLP-1-PEG и Fc иммуноглобулина;

Фиг.28: профиль очистки позиционных изомеров GLP-2-PEG с использованием колонки SOURCE S;

Фиг.29: анализ профиля Lys30-пегилированных изомеров GLP-2 посредством пептидного картирования;

Фиг.30: профиль очистки позиционных изомеров имидазоацетил GLP-2-PEG с использованием колонки SOURCE S;

Фиг.31: профиль очистки конъюгата имидазоацетил GLP-2-PEG и Fc иммуноглобулина с использованием колонки SOURCE Phe;

Фиг.32: анализ SDS-PAGE конъюгата имидазоацетил GLP-2-PEG и Fc иммуноглобулина;

Фиг.33: профиль очистки позиционных изомеров человеческого инсулин-PEG (B1F) с использованием колонки SOURCE S;

Фиг.34: профиль очистки позиционных изомеров человеческого инсулин-PEG (A1G) с использованием колонки SOURCE S;

Фиг.35: профиль очистки позиционных изомеров человеческого инсулин-PEG (B29K) с использованием колонки SOURCE S; и

Фиг.36: анализ профиля A1G-, B1F- или B29K-пегилированных изомеров человеческого инсулина человека посредством пептидного картирования.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В дальнейшем настоящее изобретение описывается подробно.

Настоящее изобретение предоставляет способ получения сайт-специфического физиологически активного полипептидного конъюгата, включающий стадии:

i) обработки физиологически активного полипептида непептидильным полимером в реакционной среде, которая содержит специфическое количество спирта и имеет специфический pH, дающие возможность связыванию непептидильного полимера с целевым сайтом физиологически активного полипептида; и

ii) выделения и очистки физиологически активного полипептидного конъюгата из реакционной смеси стадии (i) посредством ионообменной хроматографии с использованием спирта.

Физиологически активный полипептидный конъюгат в соответствии с настоящим изобретением относится к веществу, в котором физиологически активный полипептид и конец непептидильного полимера ковалентно связаны друг с другом, и настоящее изобретение отличается связыванием полипептида с полимером при специфических условиях и выделением полученного полипептидного конъюгата, содержащего полимер, связанный с его целевым сайтом.

Термин «физиологически активный полипептид или пептид», как использовано в данном описании, относится к пептиду, который может проявлять физиологическую активность in vivo, например, может быть выбран из группы, состоящей из инсулинотропного пептида, фактора крови, пищеварительного гормона, адренокортикотропного гормона, гормона щитовидной железы, кишечного гормона, цитокина, фермента, фактора роста, нейропептида, гипофизеотропного гормона, гипофизиотропного гормона, пептида против ожирения, противовирусного пептида и неприродных пептидных производных, сохраняющих физиологически активное свойство, но не ограничиваясь ими. Более конкретно- физиологически активный полипептид или пептид выбран из группы, состоящей из эритропоэтина, GM-CSF (колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов), амилина, глюкагона, инсулина, соматостатина, PYY (пептид YY), NPY (нейропептид Y), GLP-1, GLP-2, эксендина-4, оксинтомодулина, грелина, ангиотензина, брадикинина, кальцитонина, кортикотропина, эледоисина, гастрина, лептина, окситоцина, вазопрессина, LH (лютеинизирующий гормон), пролактина, FSH (фолликулостимулирующий гормон), PTH (паратиреоидный гормон, [гормон паращитовидных желез]), секретина, серморелина, hGH (гормон роста человека), высвобождающего гормон роста пептида, G-CSF (колониестимулирующий фактор гранулоцитов), интерферонов, интерлейкинов, высвобождающего пролактин пептида, орексина, пептида тиролиберина, холецистокинина, ингибирующего гастрин пептида, кальмодулина, высвобождающего гастрин пептида, мотилина, вазоактивного кишечного пептида, ANP (предсердный натрийуретический пептид), BNP (натрийуретический пептид головного мозга), CNP (натрийуретический пептид C-типа), нейрокинина A, нейромедина, ренина, эндотелина, пептида сарафотоксина, пептида карсоморфина, дерморфина, динорфина, эндорфина, энкефалина, T-клеточного фактора, фактора некроза опухоли, рецептора фактора некроза опухоли, урокиназного рецептора, опухоль ингибирующего фактора, коллагеназного ингибитора, тимопоэтина, тимулина, тимопентина, тимозина, гуморального фактора тимуса, адреномодуллина, аллатостатина, фрагмента белка бета-амилоида, противомикробного пептида, антиоксидантного пептида, бомбезина, остеокальцина, CART пептида, E-селектина, ICAM-1, VCAM-1, лейкокина, [белка с доменом] kringle-5, ламинина, ингибина, галанина, фибронектина, панкреастатина и фузеона. В дополнение, физиологически активный полипептид включает предшественник, производное, фрагмент или его вариант.

Предпочтительный физиологически активный полипептид, используемый в настоящем изобретении, представляет собой эксендин, инсулин, GLP-1, GLP-2, оксинтомодулин, грелин, ангиотензин, брадикинин, кальцитонин или его производное. Его производное может быть получено, например, посредством химического замещения (например, альфа-метилирование или альфа-гидроксилирование), делеции (например, дезаминирование или углеродная делеция) или модификации (например, N-метилирование) любых групп на аминокислотном остатке, и конкретнее - получение производного эксендина описано подробно в Патентной заявке Кореи №2008-69234.

При этом термин «непептидильный полимер», как использовано в данном описании, относится к биосовместимому полимеру, включающему две или более повторяющихся единиц, связанных друг с другом ковалентной связью, исключая пептидную связь.

Непептидильный полимер, который может быть использован в настоящем изобретении, может быть выбран из группы, состоящей из: полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимеров этиленгликоля и полипропиленгликоля, полиоксиэтилированных полиолов, поливинилового спирта, полисахаридов, декстрана, простого поливинилэтилового эфира, биодеградируемых полимеров, таких как PLA (поли(молочная кислота)) и PLGA (полимолочная-гликолевая кислота), липидных полимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинаций, и предпочтительно представляет собой полиэтиленгликоль. Его производное, которое известно в данной области или которое легко получить специалисту в данной области, также включается в объем настоящего изобретения. Непептидильный полимер, который может быть использован в настоящем изобретении, служит для увеличения молекулярной массы физиологически активного полипептида с предотвращением выведения конъюгата через почки. Любой непептидильный полимер, если он резистентен к in vivo протеазе, может быть использован без какого-либо ограничения. Молекулярная масса непептидильного полимера может находиться в диапазоне от 0,5 до 100 кД, предпочтительно от 0,5 до 20 кД и приемлемое молярное отношение физиологически активного полипептида и непептидильного полимера может быть выбрано в диапазоне от 1:1 до 1:50.

Непептидильный полимер, использованный в настоящем изобретении, содержит реакционноспособную группу на одном конце или на обоих концах. В случае, если непептидильный полимер содержит реакционноспособную группу на обоих концах, он может связываться с физиологически активным носителем и белковым лекарственным средством, которые способствуют функционированию в качестве длительно действующего состава.

Реакционноспособная группа на одном конце или на обоих концах непептидильного полимера предпочтительно выбирается из группы, состоящей из реакционноспособной альдегидной группы, пропиональдегидной группы, бутиральдегидной группы, малеимидной группы и сукцинимидной группы. Примеры сукцинимидной группы включают сукцинимидил пропионат, сукцинимидил бутаноат, гидрокси сукцинимидил, сукцинимидил карбоксиметил или сукцинимидил карбонат. В частности, когда непептидильный полимер содержит реакционноспособную альдегидную группу или реакционноспособную сукцинимидильную группу на одном конце, он является эффективным при связывании на обоих концах с физиологически активным полипептидом и иммуноглобулином с минимальными неспецифическими реакциями. Альдегидная реакционноспособная группа селективно связывается с N-концом при низком pH и может связываться с лизиновым остатком с образованием аминной связи при высоком pH, таком как pH 9,0. В добавление сукцинимидильная реакционноспособная группа может образовывать стабильную амидную связь с N-концом или лизиновым остатком при pH 7,0~9,0.

Далее реакционноспособные группы на обоих концах непептидильного полимера могут быть одинаковыми или различными. В случае, если полиэтиленгликоль, содержащий реакционноспособную гидроксильную группу на своих обоих концах, используется как непептидильный полимер, гидроксильная группа может быть активирована в различные реакционноспособные группы посредством известных химических реакций, или может быть использован коммерчески пригодный полиэтиленгликоль, содержащий модифицированную реакционноспособную группу.

Стадия (i) настоящего изобретения состоит в получении физиологически активного полипептидного конъюгата посредством сайт-специфического связывания непептидильного полимера с физиологически активным полипептидом в приемлемой реакционной среде.

Термин «сайт-специфический» или «сайт-специфически», как использовано в данном описании, относится к связыванию непептидильного полимера со специфическим целевым аминокислотным сайтом физиологически активного полипептида, предпочтительно амином лизинового остатка или N-концом. Сайт-специфическое связывание или связь может предотвращать образование побочных конъюгатов, в которых непептидильный полимер связывается с физиологически важным аминокислотным остатком. Например, когда непептидильный полимер связывается с N-концом эксендина-4, in vitro активность эксендина-4 снижается, но когда непептидильный полимер связывается с лизиновым остатком, in vitro активность сохраняется. В частности, когда непептидильный полимер связывается с 27-м лизиновым остатком скорее, чем с 12-м лизиновым остатком, наблюдалась значительно более высокая in vitro активность (см. пример 10 и таблицу 2).

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что присутствие спирта в реакционной среде и pH реакций среды на стадии (i) являются критическими факторами сайт-специфической связи непептидильного полимера и физиологически активного полипептида. Соответственно на стадии (i) настоящего изобретения непептидильный полимер связывается со специфическим сайтом физиологически активного полипептида с использованием реакционной среды, содержащей специфическое содержание спирта и имеющей специфический pH.

В специфическом варианте осуществления настоящего изобретения отношение специфического позиционного изомера полипептидного конъюгата может варьироваться на основе pH реакционной среды или на основе концентрации (%) спирта при таком же pH. Поэтому возможно связывание непептидильного полимера с желательной аминокислотой физиологически активного полипептида сайт-специфическим образом.

То есть стадия (i) настоящего изобретения выполняется при специфическом pH, давая возможность непептидильному полимеру связываться с желательным (или целевым) сайтом, то есть эта доза не влияет на полипептидную активность. Диапазон pH может зависеть от типов физиологически активного полипептида. Например, в случае инсулинотропного пептида (например, эксендин-4) изомер, в котором полимер связан с 12-м лизином, в высокой степени наблюдался при низком pH реакционной среды, тогда как изомер, в котором полимер связан с 27-м лизином, который не влияет на инсулинотропную активность, в высокой степени наблюдался при высоком pH реакционной среды. (см. пример 3 и фиг.3). Соответственно стадия (i) предпочтительно выполняется при pH от 7,5 до 9,0, так что непептидильный полимер селективно связывается с 27-м лизином.

Далее стадия (i) настоящего изобретения выполняется в реакционной среде, содержащей спирт, с тем, чтобы непептидильный полимер мог связываться с сайтом, который не влияет на полипептидную активность. Примеры спирта включают первичный, вторичный и третичный спирт, предпочтительно спирт, содержащий число атомов углерода от одного до десяти, более предпочтительно- этанол или изопропанол. В случае инсулинотропного пептида (например, эксендин-4) спирт может находиться в реакционной среде в количестве, изменяющемся от 0,1% до 100% по объему, предпочтительно от 25% до 90%, более предпочтительно от 35% до 60% на основе общего объема реакционной среды, для того, чтобы дать возможность непептидильному полимеру связываться с 27-м лизином, который не влияет на инсулинотропную активность.

В варианте настоящего изобретения, когда физиологически активный полипептид представляет собой эксендин-4 или его производное, pH, применяемый на стадии (i), может быть от 7,0 до 10,0, для того, чтобы увеличить отношение связывания непептидильного полимера с Lys27. В другом варианте настоящего изобретения, когда физиологически активный полипептид представляет собой кальцитонин, pH, применяемый на стадии (i), может быть от 4,0 до 6,0, для того, чтобы увеличить отношение связывания непептидильного полимера с N-концом. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения, когда физиологически активный полипептид представляет собой оксинтомодулин или его производное, pH, применяемый на стадии (i), может быть от 7,0 до 10,0, для того, чтобы увеличить отношение связывания непептидильного полимера с Lys27 или Lys30. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения когда физиологически активный полипептид представляет собой инсулин человека или его производное, pH, применяемый на стадии (i), может быть от 4,0 до 6,0, для того, чтобы увеличить отношение связывания непептидильного полимера с Phe1 (1-й фенилаланин) N-конца в B цепи. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения, когда физиологически активный полипептид представляет собой инсулин человека или его производное, pH применяемый на стадии (i), может быть от 7,0 до 10,0, для того, чтобы увеличить отношение связывания непептидильного полимера с Gly1 (1-й глицин) N-конца в A цепи или с Lys29 (29-й лизин) в B цепи. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения, когда физиологически активный полипептид представляет собой GLP-1 или его производное, pH, применяемый на стадии (i), может быть от 7,0 до 10,0, для того, чтобы увеличить отношение связывания непептидильного полимера с Lys34. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения, когда физиологически активный полипептид представляет собой GLP-2 или его производное, pH, применяемый на стадии (i), может быть от 7,0 до 10,0, для того, чтобы увеличить отношение связывания непептидильного полимера с Lys30.

Соответственно предпочтительный сайт-специфический физиологически активный полипептидный конъюгат представляет собой конъюгат эксендина-4, в котором PEG связан с Lys27, конъюгат кальцитонина, в котором PEG связан с N-концом, конъюгат оксинтомодулина или его аналога, в котором PEG связан с Lys27 или Lys30, конъюгат инсулина человека или его аналога, в котором PEG связан с Phe1 N-конца в B цепи, Gly1 N-конца в A цепи или с Lys29 в B цепи, или конъюгат GLP-1 или GLP-2, в котором PEG связан с Lys34 или Lys30.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения пептидное производное (или аналог) могут быть использованы для облегчения сайт-специфической связи между непептидильным полимером и физиологически активным полипептидом. Производное представляет собой пептид, содержащий любой из других не целевых аминокислотных сайтов, делетированных или защищенных для того, чтобы предотвратить нежелательное связывание. Например, в случае инсулинотропного пептида, такого как эксендин, могут быть использованы различные производные эксендина, такие как Des-аминогистидил (DA)-эксендин-4 формулы (I), Бета-гидроксиимидазопропионил(HY)-эксендин-4 формулы (II), Имидазоацетил(CA)-эксендин-4 формулы (III) и Диметил-гистидил(DM)-эксендин-4 формулы (IV), которые получены с использованием способов, в которых альфа аминогруппа N-концевой аминокислоты гистидина делетирована, N-концевая аминогруппа замещена гидроксильной группой, N-концевая альфа аминогруппа гистидина модифицирована с использованием двух метильных групп или альфа углерод N-концевого гистидина и аминогруппа, связанная с ним, делетированы для удаления имидазоацетильной группы, но не ограничиваясь ими. Структуры таких примерных эксендиновых производных и способы их получения описаны в Корейской нерассмотренной патентной публикации №2009-0008151, которая включена в объем настоящего изобретения посредством ссылок.

Аналогично оксинтомодулин, GLP-1 и GLP-2, содержащие гистидин как 1-ю аминокислоту, могут быть также использованы как производное, имеющее любую структуру, выбранную из формул (I)-(IV).

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения авторы настоящего изобретения исследовали эффекты pH и содержания спирта (%) реакционной среды на аспект сайт-специфического связывания непептидильного полимера и подтвердили, что отношение конъюгатов инсулинотропного пептида, содержащих полимер, связанный с 12-м лизином/27-м лизином, варьируется в зависимости от изменения pH и количества этанола или изопропанола, в частности. В частности, более предпочтительный изомер, содержащий непептидильный полимер, связанный с 27-м лизиновым остатком, преимущественно получали, когда от 35% до 55%, предпочтительно примерно 45% этанола или изопропанола используется при pH 7,5.

После увеличения отношения желательный непептидильный полимер-физиологически активный полипептидный конъюгат посредством регулирования специфического pH и содержания спирта на стадии (i), желательный конъюгат может быть выделен и очищен посредством ионообменной хроматографии с использованием спирта на стадии (ii).

Спирт, используемый на стадии (ii), присутствует в очищенном растворе и его специфические примеры такие же, как определены на стадии (i). Однако спирт стадии (i) применяется для цели увеличения полипептидной реакционной способности и сайт-специфичности посредством модификации его вторичной или третичной структуры, тогда как спирт стадии (ii) применяется с целью облегчения высокопроизводительного выделения и очистки сайт-специфического физиологически активного полипептидного конъюгата посредством снижения неспецифической связи между ионообменной колонкой и конъюгатом. Выделение и очистка могут быть выполнены посредством использования различных методов, известных специалисту в данной области, предпочтительно посредством ионообменной хроматографии, более предпочтительно- посредством ионообменной хроматографии при высоком давлении.

При этом для облегчения выделения и очистки позиционного изомера ионообменная хроматография может быть выполнена при специфическом pH. pH приемлемо регулировался для увеличения сайт-специфичности конъюгата на стадии (i), тогда как повторно регулировался для связывания конъюгата и удаления его из ионообменной колонки в очищающем растворе, содержащем спирт стадии (ii). Приемлемый pH, применяемый на стадии (ii), может находиться в диапазоне от примерно 2,0 до примерно 6,0.

Кроме того, физиологически активный полипептид по настоящему изобретению может быть далее связан с физиологически активным носителем. В этом случае непептидильный полимер должен представлять собой непептидильный полимер с обоими концами, для того, чтобы связываться с физиологически активным носителем. То есть физиологический активный носитель ковалентно связывается с концом непептидильного полимера, который не ковалентно связан с физиологически активным полипептидом, и, таким образом, может быть получен конъюгат, в котором оба конца непептидильного полимера связаны с физиологически активным полипептидом и физиологически активным носителем.

Как описано выше, физиологически активный полипептидный конъюгат, полученный на стадии (ii), может далее связываться с физиологически активным носителем, и полученный в результате конъюгат полипептид-полимер-носитель проявляет совершенно различные свойства по сравнению с конъюгатом полипептид-полимер, т.е. выдающиеся физиологические свойства, такие как превосходное пролонгированное действие фармакологических эффектов физиологически активного полипептида, нацеленного на специфическую область, такую как повреждение, для лечения или индукции некроза.

Термин «физиологически активный носитель», как использован в данном описании, относится к физиологически активному веществу, проявляющему дополнительные свойства, отличающиеся от природной физиологической активности полипептида, которые могут поддерживать физиологическую активность полипептида, такую как фармакологические эффекты или индукция нацеливания на специфическую область или [область] некроза посредством связывания с непептидильным полипептидом совместно с физиологически активным полипептидом.

Физиологически активный носитель, используемый в настоящем изобретении, включает вещество, имеющее вышеупомянутые свойства без любого ограничения, например, альбумин, Fc область иммуноглобулина, трансферрин, аптамер, токсин, коллаген, декстран, полисахариды, жирные кислоты, фибриноген и подобное. Предпочтительно физиологически активный носитель может быть выбран из альбумина, Fc области иммуноглобулина и трансферрина, более предпочтительно Fc области иммуноглобулина.

Fc область иммуноглобулина по настоящему изобретению относится к константной области 2 тяжелой цепи (CH2) и константной области 3 тяжелой цепи (CH3) иммуноглобулина, исключая вариабельные области тяжелой и легкой цепей, константную область 1 тяжелой цепи (CH1) и константную область 1 легкой цепи (CL1). Она может далее включать шарнирную область константной области тяжелой цепи. Также Fc область иммуноглобулина по настоящему изобретению может представлять собой удлиненную форму, содержащую часть или всю Fc область, включающую константную область 1 тяжелой цепи (CH1) и/или константную область 1 легкой цепи (CL1), за исключением вариабельных областей тяжелой и легкой цепей до тех пор, пока она проявляет физиологическую функцию, существенно сходную или более лучшую, чем [физиологическая функция] природной Fc [области] иммуноглобулина, и может включать области Fc иммуноглобулина, модифицированные посредством фосфорилирования, сульфатирования, акрилирования, гликозилирования, метилирования, фарнезилирования, ацетилирования, амидирования и подобное. Область Fc иммуноглобулина, способ ее получения и способ ковалентного связывания Fc иммуноглобулина с конъюгатом- непептидильный полимер-физиологически активный полипептид раскрыты в Корейском патенте №№775343, 725314, 725315 и 824505, которые включены в объем настоящего изобретения посредством ссылок.

В соответствии со способом по настоящему изобретению желательный полипептидный конъюгат, имеющий превосходную физиологическую активность, может быть получен с высоким выходом посредством сайт-специфического связывания непептидильного полимера со специфической аминокислотой физиологически активного полипептида, который минимизирует образование дополнительных конъюгатов.

Следующие примеры предназначены для дальнейшей иллюстрации настоящего изобретения без ограничения его объема.

Пример 1: Получение и выделение конъюгата пегилированный DA-эксендин-4 (Lys27)

<1-1> Получение конъюгата пегилированный DA-эксендин-4 (Lys27)

Для того чтобы получить пегилированный пептидный конъюгат посредством ковалентного связывания Lys в пептиде с PEG des-амино-гистидил-эксендин-4 (DA-эксендин-4, AP, США) и 3.4K PropionALD(2) PEG (PEG, имеющий две пропиональдегидные группы, IDB Inc., Корея) подвергали реакции при 4°C в течение 12 часов в молярном отношении 1:30 с пептидной концентрацией 3 мг/мл. В это время 100 мМ HEPES буфер (pH 7,5), содержащий 45% изопропанол, использовали в качестве реакционной среды, и 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент добавляли в нее.

<1-2> Выделение позиционного изомера

Моно-пегилированный пептид сначала очищали из реакционной смеси примера <1-1> посредством использования SOURCE Q ионообменной хроматографии (XK 16 мл, GE healthcare, Корея) при следующих условиях, и позиционные изомеры выделяли посредством использования SOURCE S ионообменной хроматографии (XK 16 мл GE healthcare, Корея) при следующих условиях. В этом процессе этанол использовали для облегчения выделения изомеров посредством включения его в очищающий раствор. Пегилированные сайты подтверждали по элюированным пикам посредством метода пептидного картирования.

Колонка: SOURCE Q

Скорость потока: 2,0 мл/мин

Элюирующий раствор: A (20 мМ Трис, pH 8,5) и B (A+0,5М NaCl); градиент A 0→40%, 80 мин

Колонка:SOURCE S

Скорость потока: 2,0 мл/мин

Элюирующий раствор: A (20 мМ лимонная кислота, pH 3,0+45% этанол) и B (A+45% этанол+0,5М KCl); градиент A 0→100%, 45 мин

Из анализа профиля очистки позиционных изомеров обнаружили, что пик Lys12-пегилированный DA-эксендин-4 элюировался раньше, и затем Lys27-пегилированный пик элюировался в последней порции (фиг.1).

Пример 2: Получение и выделение конъюгата пегилированный CA-эксендин-4 (Lys27)

Процедуру примера 1 повторяли за исключением использования имидазоацетил-эксендин-4 (CA-эксендин-4, Bachem, США) вместо DA-эксендина-4 в примере 1 с получением конъюгата пегилированный CA-эксендин-4 (Lys27). Из анализа профиля очистки позиционных изомеров обнаружили, что пик Lys12-пегилированного CA-эксендин-4 элюировался раньше, и затем Lys27-пегилированного пик элюировался с последней порцией (фиг.2).

Пример 3: Изменение в отношении конъюгата пегилированный CA-эксендин-4 (Lys27) в соответствии с pH реакционной среды

Для исследования изменения в отношении полипептида, пегилированного в специфическом сайте посредством pH, CA-эксендин-4 и 3.4K PropionALD(2) PEG подвергали пегилированию посредством реакции пептида и PEG при 4°C в течение 12 часов в молярном отношении 1:30 с пептидной концентрацией 3 мг/мл. В это время 100 мМ лимонной кислоты (pH 3,0), 100 мМ NaOAc (pH 4,5), 100 мМ Na-P (pH 7,5), 100 мМ Na-P (pH 8,5), 100 мМ HEPES (pH 8,0) и 100 мМ Na-бората (pH 9,2) буферы использовали в качестве реакционной среды соответственно и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент. Каждую реакционную смесь очищали посредством метода, описанного в примере 1, с последующим анализом отношения Lys27-пегилированного конъюгата. Как показано на фиг.3, отношение Lys27-пегилированного конъюгата увеличивалось на основе увеличения pH и подтвердили, что оптимальный pH составляет от 7,0 до 10,0.

Пример 4: Изменение в отношении конъюгата пегилированный CA-эксендин-4 (Lys27) в соответствии с pH реакционной среды, содержащей этанол

Для исследования изменения в отношении полипептида, пегилированного в специфическом сайте посредством этанола и pH, CA-эксендин-4 и 3.4K PropionALD(2) PEG подвергали пегилированию посредством реакции пептида и PEG при 4°C в течение 12 часов в молярном отношении 1:30 с пептидной концентрацией 3 мг/мл. В это время 100 мМ лимонной кислоты (pH 3,0)/45% этанол, 100 мМ NaOAc (pH 4,5)/45% этанол, 100 мМ Na-P (pH 7,5)/45% этанол, 100 мМ HEPES (pH 8,0)/45% этанол и 100 мМ Na-P (pH 8,5)/45% этанол буферы использовали в качестве реакционной среды, соответственно, и 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент добавляли к ней. Каждую реакционную смесь очищали посредством метода, описанного в примере 1, с последующим анализом отношения Lys27-пегилированного конъюгата. Как показано на фиг.4, отношение Lys27-пегилированного конъюгата увеличивалось на основе увеличения pH в 45% EtOH-содержащей реакционной среде и подтвердили, что оптимальный pH составляет от 7,0 до 9,0.

Пример 5: Изменение в отношении конъюгата пегилированный CA-эксендин-4 (Lys27) в соответствии с концентрацией этанола в реакционной среде

Для исследования изменения в отношении полипептида, пегилированного в специфическом сайте посредством концентрации этанола в реакционной среде, CA-эксендин-4 и 3.4K PropionALD(2) PEG подвергали пегилированию посредством реакции пептида и PEG при 4°C в течение 12 часов в молярном отношении 1:30 с пептидной концентрацией 3 мг/мл. В это время 100 мМ HEPES (pH 7,5)/0% этанол, 100 мМ HEPES (pH 7,5)/25% этанол, 100 мМ HEPES (pH 7,5)/35% этанол, 100 мМ HEPES (pH 7,5)/45% этанол, 100 мМ HEPES (pH 7,5)/55% этанол, 100 мМ HEPES (pH 7,5)/75% этанол и 100 мМ HEPES (pH 7,5)/90% этанол буферы использовали в реакционной среде, соответственно, и 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент добавляли в нее. Каждую реакционную смесь очищали посредством метода, описанного в примере 1, с последующим анализом отношения Lys27-пегилированного конъюгата. Как показано на фиг.5, отношение Lys27-пегилированного конъюгата увеличивалось до тех пор, пока количество этанола достигало примерно 50%, в то время как снижалось при более чем 50% этанола и подтвердили, что оптимальное количество этанола составляет от 35% до 60%.

Пример 6: Изменение в отношении конъюгата пегилированный CA-эксендин-4 (Lys27) в соответствии с концентрацией изопропанола в реакционной среде

Для исследования изменения в отношении полипептида, пегилированного в специфическом сайте посредством использования изопропанола вместо этанола в реакционной среде, CA-эксендин-4 и 3.4K PropionALD(2) PEG подвергали пегилированию посредством реакции пептида и PEG при 4°C в течение 12 часов в молярном отношении 1:30 с пептидной концентрацией 3 мг/мл. В это время 100 мМ HEPES (pH 7,5)/0% изопропанол, 100 мМ HEPES (pH 7,5)/30% изопропанол, 100 мМ HEPES (pH 7,5)/45% изопропанол и 100 мМ HEPES (pH 7,5)/60% изопропанол буферы использовали в качестве реакционной среды, соответственно, и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент. Каждую реакционную смесь очищали посредством метода, описанного в примере 1, с последующим анализом отношения Lys27-пегилированного конъюгата. Как показано на фиг.6, отношение Lys27-пегилированного конъюгата увеличивалось до тех пор, пока количество изопропанола достигало примерно 50%, в то время как снижалось при более чем 50% изопропанола и подтвердили, что оптимальное количество изопропанола составляет от 35% до 60%.

Пример 7: Получение конъюгата CA-эксендин-4 (Lys27)-PEG и Fc иммуноглобулина

Конъюгат CA-эксендин-4 (Lys27)-PEG сочетали с фрагментом Fc иммуноглобулина (Hanmi Pharm. Co. Ltd., Корея) посредством реакции конъюгата и фрагмента при 4°C в течение 16 часов в молярном отношении 1:8 с пептидной концентрацией 20 мг/мл. В это время 100 мМ K-P буфер (pH 6,0) использовали в качестве реакционной среды и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент. После реакции сочетания двустадийную очистку выполняли с использованием колонок SOURCE phe и SOURCE Q при следующих условиях.

Колонка: SOURCE Phe (XK 16 мл, GE healthcare)

Скорость потока: 2,0 мл/мин

Элюирующий раствор: A (20 мМ Трис, pH 7,5) и B (A+1,5М NaCl); градиент A 0→40%, 80 мин

Колонка SOURCE Q (XK 16 мл, GE healthcare )

Скорость потока: 2,0 мл/мин

Элюирующий раствор: A (20 мМ Трис, pH 7,5) и B (A+1М NaCl); градиент A 0→40%, 80 мин

Конъюгат, полученный ранее, анализировали с использованием SDS-PAGE. Как показано на фиг.7, одну полосу с 60K наблюдали при не восстанавливающих условиях, тогда как две полосы с 35K и 25K наблюдали при восстанавливающих условиях.

Пример 8: Идентификация пегилированного сайта конъюгата CA-эксендин-4 (Lys27)-PEG

Для идентификации сайта связывания PEG с CA-эксендин-4 конъюгаты CA-эксендин-4(Lys27)-PEG переваривали протеазным ферментом лизином-C и анализировали с использованием обращенной хроматографии.

В частности, изомеры CA-эксендин-4-PEG анализировали посредством SDS-PAGE (фиг.8) и затем очищенный конъюгат CA-эксендин-4-PEG и CA-эксендин-4 растворяли в буфере триэтиламин-соляная кислота (10 мМ/л; pH 7,5), 10 мкл фермента (0,1 мг/мл) добавляли к нему и проводили реакцию при 37°C в течение 4 часов. После окончания реакции реакционную смесь анализировали посредством обращенной хроматографии (HPLC (Agilent), Jupiter C18 (Phenomenex)). Анализ результатов показан на фиг.9 и 10. Lys12-пегилированный CA-эксендин-4 изомер подтвердили посредством одновременного исчезновения #1 и #2, как показано на фиг.9, и изомер Lys27-пегилированный CA-эксендин-4 подтвердили посредством одновременного исчезновения #2 и #3, как показано на фиг.10.

Пример 9: Идентификация выхода пегилирования посредством концентрации изопропанола при N-концевом пегилировании

Для пегилирования метокси полиэтиленгликоля 5K ALD (NOF Inc., Япония) на N-конце кальцитонина лосося (Bachem, США), кальцитонин лосося и PEG подвергали пегилированию посредством реакции пептида и PEG при 4°C в течение 1 часа в молярном отношении 1:1 с пептидной концентрацией 1 мг/мл. В это время 100 мМ NaAc pH 5,2/0% изопропанола, 100 мМ NaAc pH 5,2/45% изопропанола буферы использовали в качестве реакционной среды, соответственно, и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент. Моно-пегилированный пептид очищали из каждой реакционной смеси посредством колонки SOURCE S (XK 16 мл, GE healthcare, Корея) при следующем условии. Результаты показаны в таблице 1 ниже.

Колонка: SOURCE S

Скорость потока: 2,5 мл/мин

Элюирующий раствор: A (20 мМ ацетат, pH 5,2) и B (A+1М NaCl); градиент A 0→40%, 60 мин

Таблица 1
Раствор реакционного буфера Выход моно-пегилированного кальцитонина-5K (%)
0,1М NaAc pH 5,2 36
0,1М NaAc pH 5,2/45% IPA 51,3

Как показано в таблице 1, выход пегилированного кальцитонина увеличивается посредством добавления изопропанола.

Пример 10: Измерение in vitro активности эксендин-4 посредством пегилирования и пегилированного сайта

Для измерения эффективности длительно действующего препарата эксендин-4 посредством пегилирования и пегилированного сайта использовали метод измерения in vitro активности. Измерение in vitro активности GLP-1 представляет собой метод измерения того, увеличивается ли в клетке уровень цАМФ после обработки GLP-1 в клеточных линиях CHO, в которых клонировали рецепторы GLP-1.

В частности, CHO/GLP-1R, клеточную линию, в которой клонируется GLP-1, обрабатывали GLP-1, эксендин-4 и тестируемыми материалами, описанными в таблице 1, при варьирующих концентрациях. Наличие цАМФ измеряли и отсюда значения EC50 сравнивали друг с другом. В качестве контроля использовали коммерчески пригодный Баета (Eli Lilly). In vitro активности (%) в соответствии с обработкой тестируемыми материалами показаны в таблице 2.

Таблица 2
Тестируемый материал In vitro активность (%)
Баета 100
CA-эксендин-4 77
CA-эксендин-4-PEG (Lys12) 2,1
CA-эксендин-4-PEG (Lys27) 8,5

Как показано в таблице 2, физиологическая активность пептида относительно мало изменялась, когда PEG модифицирует Lys27 в сравнении с Lys12.

Пример 11: Получение и выделение конъюгата пегилированный оксинтомодулин (Lys30)

<11-1> Получение конъюгата пегилированный оксинтомодулин (Lys30)

Для получения конъюгата пегилированный оксинтомодулин 3.4K PropionALD(2) PEG и оксинтомодулин (Anygen, Корея) подвергали пегилированию посредством реакции пептида и PEG при 4°C в течение 4,5 часов в молярном отношении 1:15 с пептидной концентрацией 3 мг/мл. В это время 100 мМ Na-борат буфер (pH 9,0), содержащий 45% изопропанол, использовали в качестве реакционной среды и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 в качестве восстанавливающего агента.

<11-2> Выделение позиционного изомера

Lys30-пегилированные позиционные изомеры очищали из реакционной смеси посредством использования колонки SOURCE 15S (XK 16 мл, Amersham Bioscience). В этом процессе этанол использовали в очищающем растворе для облегчения выделения изомеров (фиг.11).

Колонка: SOURCE S

Скорость потока: 2,0 мл/мин

Элюирующий раствор: A (20 мМ Na-цитрат, pH 3,0+45% этанол) и B (A+1М KCl); градиент A 0→3%, 1 мин, градиент B 0→40%, 222 мин

Пример 12: Получение и выделение конъюгата пегилированный имидазоацетил оксинтомодулин (Lys30)

Процедуру примера 11 повторяли за исключением использования имидазоацетил оксинтомодулина (Anygen, Корея) вместо оксинтомодулина и использования 100 мМ HEPES буфера (pH 7,5), содержащего 45% изопропанола, в примере 11 с получением конъюгата пегилированный имидазоацетил оксинтомодулин (Lys30).

Изомеры, очищенные с использованием колонки SOURCE Q, показаны на фиг.12, и пептидное картирование с использованием протеазы Asp-N показано на фиг.13. Как показано на фиг.13, часть #4:Asp(22)-(37) исчезала посредством PEG-модификации Lys30.

Пример 13: Получение конъюгата имидазоацетил оксинтомодулин (Lys30)-PEG и Fc иммуноглобулина

Конъюгат имидазоацетил оксинтомодулин-PEG (Lys30) и Fc иммуноглобулина (Hanmi Pharm. Co. Ltd., Корея) подвергали реакции при 4°C в течение 16 часов в молярном отношении 1:10 с общей белковой концентрацией 20 мг/мл. В это время 100 мМ фосфата калия (pH 6,0) использовали в качестве реакционной среды и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 в качестве восстанавливающего агента. После окончания реакции реакционную смесь очищали с использованием колонки SOURCE 15Q при следующих условиях.

Колонка: SOURCE Q

Скорость потока: 2,0 мл/мин

Элюирующий раствор: A (20 мМ Трис-HCl, pH 7,5) и B (A+1М NaCl); градиент A 0→20%, 100 мин

Хроматограмма, которую получают посредством связывания Lys30-пегилированного CA-оксинтомодулина с Fc иммуноглобулина и очищения конъюгата с использованием SOURCE Q, показана на фиг.14, и результаты SDS-PAGE конъюгата CA-оксинтомодулин (Lys30)-PEG и Fc иммуноглобулина показаны на фиг.15. Как показано на фиг.15, одну полосу с 60K наблюдали при не восстанавливающих условиях и две полосы с 35K и 25K наблюдали при восстанавливающих условиях.

Пример 14: Получение и выделение конъюгата пегилированный аналог оксинтомодулина (Lys27)

<14-1> Получение конъюгата пегилированный аналог оксинтомодулина (Lys27)

Для пегилирования 3.4K PropionALD(2) PEG лизина, аналога оксинтомодулина ([20Asp, 24Ala, 28Ser]-оксинтомодулин-[делеция30-37]), PEG и аналог оксинтомодулина (Anygen, Корея) подвергали реакции при 4°C в течение 3,5 часов в молярном отношении 1:15 с пептидной концентрацией 3 мг/мл. В это время 100 мМ Na-борат буфер (pH 9,0), содержащий 45% изопропанол, использовали в качестве реакционной среды и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 в качестве восстанавливающего агента.

<14-2> Выделение позиционного изомера

Lys27-пегилированные позиционные изомеры очищали из реакционной смеси посредством использования колонки SOURCE 15S (XK 16 мл, Amersham Bioscience). Условия очистки и выделения такие же, как описано в примере 11. В этом процессе этанол использовали в очищающем растворе для облегчения выделения изомеров (фиг.16). Селективность лизина очищенных моно-пегилированных аналогов оксинтомодулина подтверждали посредством метода пептидного картирования с использованием протеазы Lys-C (фиг.17). Как показано на фиг.17, часть #2 исчезала посредством PEG-модификации Lys27.

Пример 15: Получение и выделение конъюгата пегилированный аналог имидазоацетил оксинтомодулина (Lys27)

<15-1> Получение конъюгата пегилированный аналог имидазоацетил оксинтомодулина (Lys27)

Для пегилирования 3.4K PropionALD(2) PEG Lys27 аналога имидазоацетил оксинтомодулина ([20Asp, 24Ala, 28Ser]-оксинтомодулин-[удаление 30-37]) - аналога имидазоацетил оксинтомодулина (Anygen, Корея) и PEG подвергали реакции при 4°C в течение 2,5 часов в молярном отношении 1:10 с общей белковой концентрацией 3 мг/мл. В это время 100 мМ HEPES (pH 7,5), содержащий 45% изопропанол, использовали в качестве реакционной среды и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент.

<15-2> Выделение позиционного изомера

Lys27-пегилированные позиционные изомеры очищали из реакционной смеси посредством использования колонки SOURCE 15S (XK 16 мл, Amersham Bioscience). Условия очистки и выделения были сходными с условиями, описанными в примере 11. В этом процессе этанол использовали в очищающем растворе для облегчения выделения изомеров (фиг.18). Селективность лизина очищенных моно-пегилированных аналогов оксинтомодулина подтверждали посредством метода пептидного картирования с использованием протеазы Lys-C (фиг.19). Как показано на фиг.19, часть #2 исчезала посредством PEG-модификации Lys27.

Пример 16: Получение и выделение конъюгата пегилированный аналог имидазоацетил оксинтомодулина (Lys27) и Fc иммуноглобулина

Lys27-пегилированный аналог имидазоацетил оксинтомодулин-PEG, полученный в примере 15, и Fc иммуноглобулина подвергали реакции при 4°C в течение 16 часов в молярном отношении 1:10 с пептидной концентрацией 20 мг/мл. В это время 100 мМ фосфата калия (pH 6,0) использовали в качестве реакционной среды и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент. После окончания реакции реакционную смесь очищали с использованием колонки SOURCE 15Q при следующих условиях.

Колонка: SOURCE Q

Скорость потока: 2,0 мл/мин

Элюирующий раствор: A (20 мМ Трис-HCl, pH 7,5) и B (A+1М NaCl); градиент A 0→20%, 100 мин

Хроматограмма, которую получают посредством связывания Lys27-пегилированного аналога CA-оксинтомодулина с Fc иммуноглобулина и очищения конъюгата с использованием SOURCE Q, показана на фиг.20, и результаты SDS-PAGE конъюгата аналога CA-оксинтомодулина (Lys27)-PEG и Fc иммуноглобулина показаны на фиг.21. Как показано на фиг.21, одну полосу с 60K наблюдали при не восстанавливающих условиях и две полосы с 35K и 25K наблюдали при восстанавливающих условиях.

Пример 17: Получение и выделение конъюгата пегилированный GLP-1 (Lys34)

<17-1> Получение конъюгата пегилированный GLP-1 (Lys34)

Для пегилирования 3.4K PropionALD(2) PEG лизинового остатка GLP-1 GLP-1 и PEG подвергали реакции при 4°C в течение 3,5 часов в молярном отношении 1:15 с общей белковой концентрацией 3 мг/мл. В это время 100 мМ Na-бората (pH 9,0), содержащего 45% изопропанол, использовали в качестве реакционной среды и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент.

<17-2> Выделение позиционного изомера

Lys34-пегилированные позиционные изомеры очищали из реакционной смеси посредством использования колонки SOURCE 15S (XK 16 мл, Amersham Bioscience). В этом процессе этанол использовали в очищающем растворе для облегчения выделения изомеров (фиг.22). Селективность лизина очищенных моно-пегилированных аналогов оксинтомодулина подтверждали посредством метода пептидного картирования с использованием протеазы Lys-C (фиг.23).

Колонка: SOURCE S

Скорость потока: 2,0 мл/мин

Элюирующий раствор: A (20 мМ Na-цитрат, pH 3,0+45% этанол) и B (A+1М KCl); градиент A 0→3%, 1 мин, градиент B 3→40%, 150 мин

Как показано на фиг.23, часть #2 исчезала посредством PEG-модификации Lys34.

Пример 18: Получение и выделение конъюгата пегилированный имидазоацетил GLP-1 (Lys34)

<18-1> Получение конъюгата пегилированный имидазоацетил GLP-1 (Lys34)

Для пегилирования 3.4K PropionALD(2) PEG лизинового остатка имидазоацетил GLP-1 имидазоацетил GLP-1 и PEG подвергали реакции при 4°C в течение 4 часов в молярном отношении 1:10 с общей белковой концентрацией 3 мг/мл. В это время 100 мМ HEPES (pH 7,5), содержащий 45% изопропанол, использовали в качестве реакционной среды и 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент добавляли в нее.

<18-2> Выделение позиционного изомера

Lys34-пегилированные позиционные изомеры очищали из реакционной смеси посредством использования колонки SOURCE 15S (XK 16 мл, Amersham Bioscience). В этом процессе этанол использовали в очищающем растворе для облегчения выделения изомеров (фиг.24). Селективность лизина очищенных моно-пегилированных аналогов оксинтомодулина подтверждали посредством метода пептидного картирования с использованием протеазы Glu-C Lys-C (фиг.25).

Колонка: SOURCE S

Скорость потока: 2,0 мл/мин

Элюирующий раствор: A (20 мМ Na-цитрат, pH 3,0+45% этанол) и B (A+1М KCl); градиент A 0→3%, 1 мин, градиент B 3→40%, 150 мин

Как показано на фиг.25, часть #4 исчезала посредством PEG-модификации Lys34.

Пример 19: Получение и выделение конъюгата пегилированный имидазоацетил GLP-1 (Lys34) и Fc иммуноглобулина

Lys34-пегилированный имидазоацетил GLP-1-PEG, полученный в примере 18, и Fc иммуноглобулина подвергали реакции при 4°C в течение 17 часов в молярном отношении 1:8 с пептидной концентрацией 50 мг/мл. В это время 100 мМ фосфата калия (pH 6,0) использовали в качестве реакционной среды и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент. После окончания реакции реакционную смесь очищали с использованием колонки SOURCE Phe при следующих условиях.

Колонка: SOURCE Phe

Скорость потока: 2,0 мл/мин

Элюирующий раствор: A (20 мМ Трис-HCl, pH 7,5) и B (A+2М NaCl); градиент A 100→0%, 100 мин

Хроматограмма, которую получают посредством связывания Lys34-пегилированного изомера CA-GLP-1 с Fc иммуноглобулина и очищения конъюгата с использованием SOURCE Phe, показана на фиг.26, и результаты SDS-PAGE конъюгата CA-GLP-1 (Lys34)-PEG и Fc иммуноглобулина показаны на фиг.27. Как показано на фиг.27, одну полосу с 60K наблюдали при не восстанавливающих условиях и две полосы с 35K и 25K наблюдали при восстанавливающих условиях.

Пример 20: Получение и выделение конъюгата пегилированный GLP-2 (Lys30)

<20-1> Получение конъюгата пегилированный GLP-2 (Lys30)

Для пегилирования 3.4K PropionALD(2) PEG лизинового остатка GLP-2 GLP-2 и PEG подвергали реакции при 4°C в течение 3 часов в молярном отношении 1:12 с общей белковой концентрацией 5 мг/мл. В это время 100 мМ Na-бората (pH 9,0), содержащего 45% изопропанол, использовали в качестве реакционной среды и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент.

<20-2> Выделение позиционного изомера

Lys30-пегилированные позиционные изомеры очищали из реакционной смеси посредством использования колонки SOURCE 15S (XK 16 мл, Amersham Bioscience). В этом процессе этанол использовали в очищающем растворе для облегчения выделения изомеров (фиг.28). Селективность лизина подтверждали посредством метода пептидного картирования с использованием трипсиновой протеазы (фиг.29).

Колонка: SOURCE S

Скорость потока: 2,0 мл/мин

Элюирующий раствор: A (20 мМ Na-цитрат, pH 3,0+45% этанол) и B (A+1М KCl); градиент A 0→3%, 1 мин, градиент B 3→40%, 150 мин

Как показано на фиг.29, часть #2 исчезала посредством PEG-модификации Lys30.

Пример 21: Получение и выделение конъюгата пегилированный имидазоацетил GLP-2 (Lys30)

<21-1> Получение конъюгата пегилированный имидазоацетил GLP-2 (Lys30)

Для пегилирования 3.4K PropionALD(2) PEG остатка лизина 30 имидазоацетил GLP-2 (Anygen, Корея) имидазоацетил GLP-2 и PEG подвергали реакции при 4°C в течение 6 часов в молярном отношении 1:20 с общей белковой концентрацией 3 мг/мл. В это время 100 мМ HEPES (pH 7,5), содержащий 45% изопропанол, использовали в качестве реакционной среды и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент.

<21-2> Выделение позиционного изомера

Lys30-пегилированные позиционные изомеры очищали из реакционной смеси посредством использования колонки SOURCE 15S (XK 16 мл, Amersham Bioscience). В этом процессе этанол использовали в очищающем растворе для облегчения выделения изомеров (фиг.30).

Колонка: SOURCE S

Скорость потока: 2,0 мл/мин

Элюирующий раствор: A (20 мМ Na-цитрат, pH 3,0+45% этанол) и B (A+1М KCl); градиент A 0→3%, 1 мин, градиент B 3→40%, 150 мин

Пример 22: Получение и выделение конъюгата пегилированный имидазоацетил GLP-2 (Lys30) и Fc иммуноглобулина

Lys30-пегилированный имидазоацетил GLP-2-PEG, полученный в Примере 21, и Fc иммуноглобулина подвергали реакции при 4°C в течение 16 часов в молярном отношении 1:15 с пептидной концентрацией 20 мг/мл. В это время 100 мМ фосфата калия (pH 6,0) использовали в качестве реакционной среды и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент. После окончания реакции реакционную смесь очищали с использованием колонки SOURCE Phe при следующих условиях.

Колонка: SOURCE Phe

Скорость потока: 2,0 мл/мин

Элюирующий раствор: A (20 мМ Трис-HCl, pH 7,5) и B (A+2М NaCl); градиент A 100→0%, 100 мин

Хроматограмма, которую получают посредством связывания Lys30-пегилированного CA-GLP-2 изомера с Fc иммуноглобулина и очищения конъюгата с использованием SOURCE Phe, показана на фиг.31, и результаты SDS-PAGE конъюгата CA-GLP-2 (Lys30)-PEG и Fc иммуноглобулина показаны на фиг.32. Как показано на фиг.32, одну полосу с 60K наблюдали при не восстанавливающих условиях и две полосы с 35K и 25K наблюдали при восстанавливающих условиях.

Пример 23: Получение и выделение конъюгата пегилированный инсулин (B1Phe) человека

<23-1> Получение конъюгата пегилированный инсулин (B1Phe) человека

Для пегилирования 5K PropionALD(1) метоксиPEG (PEG, содержащий одну пропиональдегидную группу, NOF., Япония) на N-конце фенилаланина, который представляет собой первую аминокислоту B цепи в инсулине человека (Sigma), PEG и инсулин человека подвергали реакции при 4°C в течение 12 часов в молярном отношении 1:2 с пептидной концентрацией 2,3 мг/мл. В это время 100 мМ буфера фосфата калия (pH 6,0) использовали в качестве реакционной среды и добавляли в нее 20 мМ NaCNBH3 как восстанавливающий агент.

<23-2> Выделение позиционного изомера

Позиционные изомеры очищали из реакционной смеси посредством использования колонки SOURCE 15S (XK 16 мл, Amersham Bioscience). В этом процессе этанол использовали в очищающем растворе для облегчения выделения изомеров (фиг.33). Моно-пегилирование элюированных пиков подтверждали посредством анализа SDS-PAGE, и селективность лизина подтверждали посредством метода пептидного картирования с использованием протеазы Glu-C (фиг.36).

Колонка: SOURCE S

Скорость потока: 2,0 мл/мин

Элюирующий раствор: A (20 мМ Na-цитрат, pH 2,0+60% этанол) и B (A+0,5М KCl); градиент A 0→3%, 1 мин, градиент B 0→50%, 80 мин

Как показано на фиг.36, часть #2 исчезала посредством PEG-модификации B1F.

Пример 24: Получение и выделение конъюгата пегилированный инсулин ((A1Gly) человека

<24-1> Получение конъюгата пегилированный инсулин (A1Gly) человека

Для пегилирования 5K метоксиPEG-сукцинимидил бутаноат(1) (PEG, содержащий одну реакционноспособную группу SBA, NOF., Япония) на N-конце глицина, который представляет собой первую аминокислоту A цепи в инсулине человека (Sigma), PEG и инсулин человека подвергали реакции при 25°C в течение 3 часов в молярном отношении 1:4 с пептидной концентрацией 2 мг/мл. В это время 100 мМ Na-боратного буфера (pH 9,0), содержащего 35% изопропанола, использовали в качестве реакционной среды.

<24-2> Выделение позиционного изомера

Позиционные изомеры очищали из реакционной смеси посредством использования колонки SOURCE 15S (XK 16 мл, Amersham Bioscience). Процедура очистки была сходна с процедурой очистки, описанной в примере 23. В этом процессе этанол использовали в очищающем растворе для облегчения выделения изомеров (фиг.34). Моно-пегилирование элюированных пиков подтверждали посредством анализа SDS-PAGE, и селективность лизина подтверждали посредством метода пептидного картирования с использованием протеазы Glu-C (фиг.36).

Как показано на фиг.36, часть #1 исчезала посредством PEG-модификации A1G.

Пример 25: Получение и выделение конъюгата пегилированный инсулин (B29Lys) человека

<25-1> Получение конъюгата пегилированный инсулин (B29Lys) человека

Для пегилирования 5K метоксиPEG-сукцинимидил бутаноата(1) лизинового остатка, который представляет собой 29-ю аминокислоту B цепи в инсулине человека (Sigma), PEG и инсулин человека подвергали реакции при 25°C в течение 1 часа в молярном отношении 1:2 с пептидной концентрацией 2 мг/мл. В это время 100 мМ Na-боратного буфера (pH 9,0), содержащего 45% изопропанола, использовали в качестве реакционной среды.

<25-2> Выделение позиционного изомера

Позиционные изомеры очищали из реакционной смеси посредством использования колонки SOURCE 15S (XK 16 мл, Amersham Bioscience). Процедура очистки была сходна с процедурой очистки, описанной в примере 23. В этом процессе этанол использовали в очищающем растворе для облегчения выделения изомеров (фиг.35). Моно-пегилирование элюированных пиков подтверждали посредством анализа SDS-PAGE, и селективность лизина подтверждали посредством метода пептидного картирования с использованием протеазы Glu-C (фиг.36).

Как показано на фиг.36, часть #4 исчезала посредством PEG-модификации B29K.

Хотя изобретение было описано в отношении вышеупомянутых специфических вариантов осуществления изобретения, следует признать, что различные модификации и изменения могут быть сделаны по изобретению специалистами в данной области, которые также входят в объем изобретения как определенные прилагаемой формулой изобретения.

1. Способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера, включающий стадии:
i) определения количества спирта и значения рН, дающих возможность непептидильному полимеру связываться с целевым сайтом физиологически активного полипептида;
ii) обработки физиологически активного полипептида непептидильным полимером в реакционной среде, которая содержит количество спирта и имеет рН, дающие возможность непептидильному полимеру связаться с целевым сайтом физиологически активного полипептида; и
iii) выделения и очистки физиологически активного полипептидного конъюгата из реакционной смеси стадии (ii) посредством ионообменной хроматографии с использованием спирта.

2. Способ по п.1, где физиологически активный полипептид выбран из группы, состоящей из инсулинотропного пептида, фактора крови, пищеварительного гормона, адренокортикотропного гормона, гормона щитовидной железы, кишечного гормона, цитокина, фермента, фактора роста, нейропептида, гипофизеотропного гормона, гипофизиотропного гормона, пептида против ожирения, противовирусного пептида и неприродного пептидного производного, сохраняющего физиологически активное свойство.

3. Способ по п.1, где физиологически активный полипептид выбран из группы, состоящей из эритропоэтина, GM-CSF (колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов), амилина, глюкагона, инсулина, соматостатина, PYY (пептид YY), NPY (нейропептид Y), GLP-1, GLP-2, эксендина-4, оксинтомодулина, грелина, ангиотензина, брадикинина, кальцитонина, кортикотропина, эледоисина, гастрина, лептина, окситоцина, вазопрессина, LH (лютеинизирующий гормон), пролактина, FSH (фолликулостимулирующий гормон), РТН (паратиреоидный гормон), секретина, серморелина, hGH (гормон роста человека), высвобождающего гормон роста пептида, G-CSF (колониестимулирующий фактор гранулоцитов), интерферонов, интерлейкинов, высвобождающего пролактин пептида, орексина, пептида тиролиберина, холецистокинина, ингибирующего гастрин пептида, кальмодулина, высвобождающего гастрин пептида, мотилина, вазоактивного кишечного пептида, ANP (предсердный натрийуретический пептид), BNP (натрийуретический пептид головного мозга), CNP (натрийуретический пептид С-типа), нейрокинина А, нейромедина, ренина, эндотелина, пептида сарафотоксина, пептида карсоморфина, дерморфина, динорфина, эндорфина, энкефалина, Т-клеточного фактора, фактора некроза опухоли, рецептора фактора некроза опухоли, урокиназного рецептора, опухоль ингибирующего фактора, коллагеназного ингибитора, тимопоэтина, тимулина, тимопентина, тимозина, гуморального фактора тимуса, адреномодуллина, аллатостатина, фрагмента белка бета-амилоида, противомикробного пептида, антиоксидантного пептида, бомбезина, остеокальцина, CART пептида, Е-селектина, ICAM-1, VCAM-1, лейкокина, kringle-5, ламинина, ингибина, галанина, фибронектина, панкреастатина и фузеона.

4. Способ по п.1, где физиологически активный полипептид представляет собой эксендин, инсулин, GLP-1, GLP-2, оксинтомодулин, грелин, кальцитонин или одно из их производных.

5. Способ по п.4, где производное имеет любую структуру, выбранную из формул (I)-(IV):



6. Способ по п.1, где непептидильный полимер выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимеров этиленгликоля и полипропиленгликоля, полиоксиэтилированных полиолов, поливинилового спирта, полисахаридов, декстрана, простого поливинилэтилового эфира, биодеградируемых полимеров, таких как PLA (поли(молочная кислота)) и PLGA (полимолочная-гликолевая кислота), липидных полимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинаций.

7. Способ по п.1, где спирт, используемый на стадиях (ii) и (iii), представляет собой первичный, вторичный или третичный спирт, имеющий число атомов углерода от одного до десяти.

8. Способ по п.7, где спирт представляет собой этанол или изопропанол.

9. Способ по п.1, где спирт присутствует в реакционной среде в количестве от 35% до 60% по объему в расчете на общее количество реакционной среды.

10. Способ по п.1, где рН, применяемый на стадии (ii), составляет от 7,0 до 10,0, когда физиологически активный полипептид представляет собой эксендин-4 или его производное.

11. Способ по п.1, где рН, применяемый на стадии (ii), составляет от 7,0 до 10,0, когда физиологически активный полипептид представляет собой оксинтомодулин или его производное.

12. Способ по п.1, где рН, применяемый на стадии (ii), составляет от 4,0 до 10,0, когда физиологически активный полипептид представляет собой инсулин человека или его производное.

13. Способ по п.1, где рН, применяемый на стадии (ii), составляет от 7,0 до 10,0, когда физиологически активный полипептид представляет собой GLP-1 или его производное.

14. Способ по п.1, где рН, применяемый на стадии (ii), составляет от 7,0 до 10,0, когда физиологически активный полипептид представляет собой GLP-2 или его производное.

15. Способ по п.1, где сайт-специфический физиологически активный полипептидный конъюгат представляет собой конъюгат эксендина-4, в котором PEG связан с Lys27, конъюгат кальцитонина, в котором PEG связан с N-концом, конъюгат оксинтомодулина, в котором PEG связан с Lys27 или Lys30, конъюгат инсулина человека, в котором PEG связан с N-концом Gly1 в А цепи или связан с Lys29 в В-цепи, конъюгат GLP-1 или GLP-2, в котором PEG связан с Lys34 или Lys30, или их аналоги.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно, и может быть использовано для получения рекомбинантного инсулина гларгина. Способ включает стадию культивирования дрожжей, трансформированных вектором, содержащим последовательность ДНК, определенную формулой Х-В-Y-А, кодирующей предшественника инсулина гларгина, в которой Х представляет собой последовательность лидерного пептида, содержащую по меньшей мере одну аминокислоту, В представляет собой В1-В30 последовательность аминокислот В-цепи молекулы инсулина гларгина, Y представляет собой линкерный пептид, содержащий по меньшей мере две аминокислоты, А представляет собой А1-А21 последовательность аминокислот А-цепи молекулы инсулина гларгина, стадию выделения экспрессирующегося предшественника инсулина гларгина, стадию кристаллизации выделенного предшественника инсулина гларгина, стадию проведения ферментативной конверсии кристаллов предшественника инсулина гларгина при рН от 8 до 10 в присутствии трипсина или трипсиноподобного фермента и водорастворимых органических растворителей в соотношении от 40% до 60% реакционной смеси с образованием инсулина гларгина, содержащего по меньшей мере одну родственную примесь.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению аналогов инсулина из их соответствующих предшественников, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к комплексу, включающему конъюгат инсулина, содержащий нативный инсулин или его полипептидный аналог, конъюгированные с модифицирующей группировкой, где полипептидный аналог проявляет сходную активность относительно нативного инсулина, и где модифицирующая группировка содержит полиалкиленгликолевый (PAG) компонент и алкильный компонент, и катион, где конъюгат инсулина образует комплекс с двухвалентным катионом металла группы II или переходного металла.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения инсулиновых соединений. .

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению рекомбинантного проинсулина человека, и может быть использовано в биомедицинской промышленности.

Изобретение относится к новым пептидным аналогам оксинтомодулина, их фармацевтическим композициям и их применению для лечения и/или профилактики избыточной массы тела, а также нарушений и заболеваний, сопутствующих ожирению.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению аналогов глюкагона, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к способу очистки циклического или нециклического пептида, выбранного из группы пептидов, включающей эптифибатид, эксенатид, атозибан и незиритид или их комбинацию, из смеси, содержащей по меньшей мере одну примесь, включающему контактирование указанной смеси с матрицей для ОФ-ВЭЖХ и матрицей для ионообменной хроматографии и получение очищенного пептидного продукта с чистотой по меньшей мере 96% и, предпочтительно, составляет, по меньшей мере, около 99%.

Изобретение относится к области медицины и химической технологии. .

Изобретение относится к получению инсулинотропных пептидов, которые синтезируют с использованием подхода, основанного на применении твердофазного и жидкофазного («гибридного») синтеза.

Изобретение относится к новым соединения GLP-1 пролонгированного действия и их терапевтическому применению. .

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к новым производным глюкагон-подобного пептида (GLP-1), которые имеют пролонгированный профиль действия, их фармацевтическим композициям и применению соединений для приготовления лекарственного средства для лечения или предотвращения гипергликемии, диабета 2 типа или ожирения.

Изобретение относится к биотехнологии. .
Наверх