Способ лазерного слияния бластомеров внутри ранних доимплантационных эмбрионов млекопитающих без нарушения их целостности



Способ лазерного слияния бластомеров внутри ранних доимплантационных эмбрионов млекопитающих без нарушения их целостности
Способ лазерного слияния бластомеров внутри ранних доимплантационных эмбрионов млекопитающих без нарушения их целостности
Способ лазерного слияния бластомеров внутри ранних доимплантационных эмбрионов млекопитающих без нарушения их целостности
Способ лазерного слияния бластомеров внутри ранних доимплантационных эмбрионов млекопитающих без нарушения их целостности
Способ лазерного слияния бластомеров внутри ранних доимплантационных эмбрионов млекопитающих без нарушения их целостности
Способ лазерного слияния бластомеров внутри ранних доимплантационных эмбрионов млекопитающих без нарушения их целостности

 

C12N15/00 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

Владельцы патента RU 2495932:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической физики им. Н.Н. Семенова Российской академии наук (ИХФ РАН) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам слияния эмбриональных клеток, конкретно к лазерному слиянию бластомеров внутри ранних доимплантационных эмбрионов млекопитающих без нарушения их целостности. Предложен способ лазерного слияния бластомеров внутри 4-клеточного мышиного эмбриона без нарушения его целостности, включающий выведение эмбриона на экран монитора и облучение лазерными импульсами визуально выбранной точки на линии плотного контакта бластомеров внутри эмбриона. Слиянию подвергают либо два бластомера внутри 4-клеточного эмбриона с образованием эмбриона из трех клеток, одна из которых тетраплоидная, либо последовательно две пары бластомеров с образованием эмбриона из двух тетраплоидных клеток, либо последовательно три бластомера с образованием эмбриона из двух клеток разного размера: гексаплоидной и интактной диплоидной. Облучение осуществляют последовательностью фемтосекундных лазерных импульсов с длиной волны 800 нм при частоте повторения 80 МГц мощностью 0,06-0,12 Вт и длительностью последовательности 10-30 мс. Для нахождения области наиболее плотного контакта бластомеров внутри эмбриона используют лазерный пинцет, позволяющий перемещать и поворачивать эмбрион на экране монитора. Способ позволяет воздействием фемтосекундного лазерного облучения проводить успешное слияние бластомеров внутри 4-клеточного мышиного эмбриона без нарушения его целостности с получением различных по структуре эмбрионов, содержащих клетки различной плоидности. Изобретение может быть использовано для повышения эффективности реконструирования эмбрионов. 1 з.п. ф-лы, 6 ил.

 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам слияния эмбриональных клеток, конкретно к лазерному слиянию бластомеров внутри ранних доимплантационных эмбрионов млекопитающих без нарушения их целостности, и может быть использовано для повышения эффективности реконструирования эмбрионов.

В настоящее время широко известно несколько способов слияния клеток. Первоначально при реконструировании животных клеток использовали химический способ слияния клеток - путем воздействия либо полиэтиленгликолем (Eglitis М.А. Formation of tetraploid mouse blastocysts following blastomere fusion with polyethylene glycol. J. Exp.Zool. 1980, 213(2), 309-313; Spindle A. Polyethylene glycol induced fusion of two-cell mouse embryo blastomeres. Exp.Cell. Res. 1981, 131(2), 465-470), либо инактивированным вирусом Сендай (O'Neill G.T., Speirs S., Kaufman M.H. Sex-chromosome constitution of postimplantation tetraploid mouse embryos. Cytogenet Cell Genet. 1990, 53(4), 191-195). Этот способ имел существенные недостатки, поэтому велись поиски новых более приемлемых способов слияния клеток.

Позднее для слияния растительных и животных клеток был разработан способ, основанный на использовании электрического тока. Принцип способа электростимулируемого слияния клеток основан на создании электрического пробоя, то есть резкого (шокового) увеличения проводимости и проницаемости клеточных мембран в электрическом поле постоянного тока с образованием в них сквозных пор, обеспечивающих слияние цитоплазмы. Электрослияние является весьма популярным методом, и, в частности, было использовано для слияния бластомеров 2-х клеточных эмбрионов животных (см., например, Kubiak J.Z., Tarkowski А.К. Electro fusion of mouse blastomeres. Exp.Cell. Res. 1985 Apr., 157(2), 561-566). Однако метод электрослияния имеет ряд недостатков. Главный из них -невозможность слияния определенных клеток внутри таких многоклеточных структур, как доимплантационные эмбрионы. Кроме того, электрослияние приводит к значительному снижению жизнеспособности реконструированных эмбрионов - повреждающий эффект электрического поля недавно был продемонстрирован на ооцитах, зиготах и 2-х клеточных эмбрионах крыс и мышей (Popova Е., Bader М., Krivokharchenko A. Effects of electric field on early preimplantation development in vitro in mice and rats. Hum. Reprod. 2011, 26(3), 662-670).

Наименее травматичным вмешательством в клетку являются оптические способы воздействия. Одним из первых это предложил и осуществил с помощью сфокусированного ультрафиолетового излучения известный биофизик С.С.Чахотин (Чахотин С.С.Цитология. 1959. Т.1, №6, с.614-626). С появлением лазеров оптические приемы воздействия на клетку получили дальнейшее развитие (Сахаров В.Н. Успехи соврем, биологии. 1972. Т. 73, №2, с.231-249; Liov L. et al. Hum. Reprod. 1996. V.11, p.1273-1280). Однако для слияния эмбриональных клеток лазерные технологии начали применяться лишь недавно. Получены данные успешного лазерного слияния мышиных ооцитов с соматическими кумулюсными клетками (А.К. Шахбазян, А.В. Карменян и др. ДАН, Клет. Биол. 2009, том 429, №4, с.550-553) и позднее бластомеров двухклеточного партеногенетического эмбриона свиней (Kuetemeyer К. et al. J.Biomed. Opt. 2011, 16(8), 088001).

Наиболее близким к предлагаемому способу лазерного слияния бластомеров внутри ранних доимплантационных эмбрионов млекопитающих без нарушения их целостности является способ лазерного слияния двух бластомеров внутри двухклеточного мышиного эмбриона, описанный в работе: Karmenyan A.V., Shakhbazyan А.К., Sviridova-Chailakhyan Т.А., Krivokharchenko A.S., Chiou A.E., Chailakhyan L.M. Use of picosecond infrared laser for micromanipulation of early mammalian embryos. Mol. Reprod. Dev. 2009, 76(10), 975-983 (прототип). В способе-прототипе использовался инвертированный микроскоп "Olympus 1X71" (Япония), сопряженный с лазером Tsunami ("Spectra Physics", США). В данной работе были проведены экспериментальные исследования влияния условий лазерного облучения на эффективность процесса слияния двух бластомеров и на дальнейшую жизнеспособность полученной слитой клетки. Было установлено, что для повышения эффективности слияния лазерный луч необходимо фокусировать на середине линии плотного контакта бластомеров, параметры воздействия лазером Tsunami при этом были выбраны следующие: пикосекундный режим работы с длительностью импульса 2 пс на длине волны 800 нм, частота повторения 80 МГц, мощность излучения от 0.08 до 0.80 Вт, длительность последовательности лазерных импульсов от миллисекунд до секунд.

Способ-прототип позволяет проводить достаточно эффективное слияние двух бластомеров внутри двухклеточного мышиного эмбриона и получать при культивировании in vitro жизнеспособные тетраплоидные бластоцисты, но из-за использования пикосекундного лазера способ-прототип не пригоден для слияния более мелких бластомеров внутри 4-клеточных эмбрионов.

Задачей изобретения является разработка эффективного способа лазерного слияния бластомеров внутри ранних доимплантационных эмбрионов млекопитающих на примере мышиных эмбрионов без нарушения их целостности, который позволит осуществлять слияние двух и трех бластомеров внутри 4-клеточного эмбриона без нарушения его целостности и дальнейшей жизнеспособности.

Решение поставленной задачи достигается предлагаемым способом лазерного слияния бластомеров внутри ранних доимплантационных мышиных эмбрионов без нарушения их целостности, включающим выведение мышиного эмбриона на экран монитора и облучение лазерными импульсами с длиной волны 800 нм при частоте повторения 80 МГц визуально выбранной точки на линии плотного контакта бластомеров внутри мышиного эмбриона, в котором в качестве раннего доимплантационного мышиного эмбриона используют мышиный эмбрион на стадии 4-х клеток, слиянию подвергают либо два бластомера внутри четырехклеточного эмбриона с образованием эмбриона из трех клеток, одна из которых тетраплоидная, либо последовательно две пары бластомеров с образованием эмбриона из двух тетраплоидных клеток, либо последовательно три бластомера с образованием эмбриона из двух клеток разного размера: гексаплоидной и интактной диплоидной, облучение осуществляют последовательностью фемтосекундных лазерных импульсов с мощностью 0,06-0,12 Вт длительностью 10-30 мс и для нахождения области наиболее плотного контакта бластомеров внутри эмбриона используют лазерный пинцет, позволяющий перемещать и поворачивать эмбрион на экране монитора.

Визуально выбираемую точку для облучения лазерным импульсом желательно выбирать на середине линии плотного контакта бластомеров внутри эмбриона.

Получение полиплоидных клеток (бластомеров) при слиянии бластомеров внутри эмбрионов на ранней стадии их развития является важной исследовательской задачей, так как позволяет создавать уникальные модели для изучения влияния различных типов полиплодии на развитие эмбриона.

Слияние бластомеров внутри 4-клеточного эмбриона осложняется уменьшением размера клеток по сравнению с 2-клеточным эмбрионом и объемным характером 4-клеточной структуры эмбриона. При микроманипуляциях с клеткой внутри четырехклеточного эмбриона легко повредить соседние бластомеры, что исключает использование метода электрослияния (будут сливаться все четыре бластомера с образованием нежизнеспособной клетки) и затрудняет лазерное слияние.

Многолетние исследования авторов данного изобретения по использованию лазерных технологий в клеточной инженерии (А.К. Шахбазян и др. ДАН, Клет. Биол. 2009, том 428, №3, с.1-4; А.К. Шахбазян, А.В. Карменян и др. ДАН, Клет. Биол. 2009, том 429, №4, с.550-553; Karmenyan A.V. et al. Mol. Reprod. Dev. 2009, 76(10), p.975-83 и др.) позволили разработать заявляемый способ.

Предлагаемый способ на примере мышиных эмбрионов осуществляют следующим образом.

Мышиные эмбрионы на стадии 4-х клеток либо непосредственно достают из яйцевода, либо культивируют in vitro до стадии 4-х клеток из зиготы или из двухклеточных эмбрионов. Четырехклеточные мышиные эмбрионы помещают в экспериментальную камеру из двух покровных стекол (Свиридова-Чайлахян Т.А. и др. ДАН, 2005. Т. 404, №3, с.422-424). Один из эмбрионов выводят на экран монитора и находят визуально область наиболее плотного контакта двух или трех бластомеров внутри эмбриона, для чего при помощи лазерного пинцета эмбрион поворачивают и перемещают. Для лазерного облучения визуально выбирают точку по возможности ближе к середине линии плотного контакта бластомеров. Для слияния двух или трех бластомеров внутри 4-клеточного эмбриона достаточно однократного облучения выбранной точки последовательностью фемто-секундных лазерных импульсов с длиной волны 800 нм при частоте повторения 80 МГц с мощностью 0,06-0,12 Вт и длительностью последовательности 10-30 мс. Все манипуляции проводят в среде М2.

Успешность слияния, то есть наличие двух или трех ядер в одном полученном при слиянии цитопласте (экспериментальном бластомере), подтверждалась путем окрашивания ядерной ДНК витальным красителем Хекст 33342 и наблюдением флуоресценции в УФ-свете. Жизнеспособность экспериментальных эмбрионов оценивалась культивированием in vitro до стадии бластоцисты, при этом способность эмбрионов со слитыми бластомерами развиваться in vitro до стадии бластоцисты была сопоставима с жизнеспособностью контрольных не обработанных лазером эмбрионов.

На прилагаемых рисунках приведены результаты примеров осуществления заявляемого способа. В экспериментах были использованы самцы мышей СВА в возрасте 3-4 мес и самки C57BL/6 в возрасте 1,5-2,5 мес. Суперовуляцию самок C57BL/6 проводили по стандартной методике путем внутрибрюшинной инъекции гормонов PMSG и hCG ("Sigma") (Karmenyan A.V. at al. Mol. Reprod. Dev. 2009, 76(10), 975-983).

На рис.1 показано слияние двух бластомеров внутри 4-клеточного эмбриона: (А) трехклеточные эмбрионы, полученные при слиянии двух бластомеров внутри 4-клеточного эмбриона; (В) окрашивание ядерной ДНК красителем Хекст 33342 демонстрирует наличие двух ядер в одном цитопласте - в одном из бластомеров полученного трехклеточного эмбриона. Слияние двух бластомеров внутри 4-клеточных эмбрионов, подвергнутых воздействию лазерным облучением, наблюдали в 61,5% (32\52) эмбрионов, и 78,1% (25\32) из них достигли стадий бластоцисты при культивировании. (Из контрольной группы 4-клеточных эмбрионов, не подвергавшихся облучению, стадии бластоцисты достигали 80%). Некоторые из бластоцист вылуплялись из прозрачной оболочки, что подтверждает их высокую жизнеспособность. На рис.2 показано развитие in vitro полученных 3-клеточных эмбрионов с двумя слившимися бластомерами: (А) морулы и ранние бластоцисты; (В) экспандированные бластоцисты; (С) вылупление бластоцист из прозрачной оболочки; (D) вылупляющиеся и вылупившиеся бластоцисты.

На рис.3 приведены результаты лазерного слияния двух пар бластомеров внутри 4-клеточного эмбриона. Пары бластомеров сливались последовательно с получением 2-клеточных эмбрионов с тетраплоидными бластомерами: (А) слияние первой пары бластомеров; (В) слияние второй пары бластомеров; (С) полученные 2-клеточные эмбрионы; (D) окрашивание красителем Хекст 33342 подтверждает наличие двух ядер в каждом бластомере. Эффективность слияния составила 52.2% (12\23). В результате in vitro культивирования полученных 2-х клеточных эмбрионов 90% (9\10) из них достигали стадии бластоцисты, и некоторые из них вылуплялись из zona pellucida (из прозрачной оболочки): см. на рис.4 - (А) компактные морулы; (В) экспандированные бластоцисты. (С) начало вылупления бластоцист; (D) вылупляющиеся и вылупившиеся бластоцисты.

На рис.5 приведены результаты лазерного слияния трех бластомеров внутри 4-клеточного эмбриона: (А) эмбрион на стадии 4-клеток с видимым контактом между тремя бластомерами; (В) эмбрион с одним нормальным и одним большим бластомером, полученным путем слияния трех бластомеров; (С) окрашивание красителем Хекст 33342 подтверждает наличие трех ядер в большом бластомере. Успешное слияние трех бластомеров внутри 4-клеточного эмбриона наблюдали в 44.4% случаев (8\18), при культивировании in vitro полученных 2-клеточных эмбрионов половина из них (3\6) развились до стадии бластоцисты. На рис.6 показано: (А) начало деления полученных эмбрионов, состоящих из двух клеток разного размера: гексаплоидной (полученной слиянием трех бластомеров) и интактной диплоидной; (В) морулы и ранние бластоцисты; (С) экспандированная и средние бластоцисты.

Таким образом, из приведенных примеров видно, что предлагаемый способ позволяет воздействием фемтосекундного лазерного облучения проводить успешное слияние бластомеров внутри 4-клеточного мышиного эмбриона без повреждения его наружной оболочки и без нарушения его целостности с получением различных по структуре эмбрионов, содержащих клетки различной плоидности. Культивирование in vitro полученных экспериментальных эмбрионов до стадии бластоцисты (вплоть до вылупляющихся и вылупившихся бластоцист) подтверждает их жизнеспособность.

1. Способ лазерного слияния бластомеров внутри ранних доимплантационных мышиных эмбрионов без нарушения их целостности, включающий выведение мышиного эмбриона на экран монитора и облучение лазерными импульсами с длиной волны 800 нм при частоте повторения 80 МГц визуально выбранной точки на линии плотного контакта бластомеров внутри мышиного эмбриона, отличающийся тем, что в качестве раннего доимплантационного мышиного эмбриона используют мышиный эмбрион на стадии 4-х клеток, слиянию подвергают либо два бластомера внутри четырехклеточного эмбриона с образованием эмбриона из трех клеток, одна из которых тетраплоидная, либо последовательно две пары бластомеров с образованием эмбриона из двух тетраплоидных клеток, либо последовательно три бластомера с образованием эмбриона из двух клеток разного размера: гексаплоидной и интактной диплоидной, облучение осуществляют последовательностью фемтосекундных лазерных импульсов с мощностью 0,06-0,12 Вт длительностью 10-30 мс и для нахождения области наиболее плотного контакта бластомеров внутри эмбриона используют лазерный пинцет, позволяющий перемещать и поворачивать эмбрион на экране монитора.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что визуально выбираемую точку для облучения лазерным импульсом выбирают на середине линии плотного контакта бластомеров внутри эмбриона.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области генной инженерии, молекулярной и клеточной биологии. Предложена плазмидная генетическая конструкция pOL-DsRed2, построенная на основе плазмидного вектора pIRES (Clontech), в который помещены фрагменты кДНК генов ОСТ4 и LIN28 человека, соединенные нуклеотидной последовательностью, кодирующей F2А-пептид, и кДНК гена, кодирующая флуоресцентный белок DsRed2.

Изобретение относится к области генной инженерии, молекулярной и клеточной биологии, биотехнологии. Получена плазмидная генетическая конструкция pOK-DsRed2, построенная на основе плазмидного вектора pIRES (Clontech), в который помещены фрагменты кДНК генов ОСТ4 и KLF4 человека, соединенные нуклеотидной последовательностью, кодирующей F2А-пептид и кДНК гена, кодирующего флуоресцентный белок DsRed2.

Изобретение относится к области генной инженерии, молекулярной и клеточной биологии, биотехнологии. Плазмидная генетическая конструкция pSN-ZsGreen построена на основе плазмидного вектора pIRES (Clontech), в который помещены фрагменты кДНК генов SOX2 и NANOG человека, соединенные нуклеотидной последовательностью, кодирующей Р2А-пептид и к ДНК гена, кодирующего флуоресцентный белок ZsGreen.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и химии. Предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая флуоресцентный биосенсор для детекции пероксида водорода, а также соответствующая кассета экспрессии, клетка-продуцент биосенсора и выделенный флуоресцентный биосенсор.

Изобретение относится к генной диагностике офтальмологических расстройств и предназначено для диагностики аутосомно-доминантной оптической нейропатии. .
Изобретение относится к области медицины и биотехнологии. .

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины. .

Изобретение относится к области молекулярной биотехнологии и химии и предназначено для выделения и очистки ДНК и РНК из биологических образцов - проб с чистотой, пригодной для их последующего анализа методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (Real Time PCR).
Изобретение относится к области генной инженерии и может быть использовано для диагностики болезни Альцгеймера. .

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК pMALTEV-legumain, молекулярной массой 4,78 мегадальтон и размером 7839 п.н., кодирующую полипептид, обладающий антигенными свойствами белка легумаин Opisthorchis felineus, и содержащую фрагмент векторной плазмиды pMALTEV, включающий Ptac промотор; lac-операторную последовательность; последовательность гена malE, кодирующего мальтоза-связывающий белок; сочетание терминаторов транскрипции rrnB Т1Т2 E.coli; ген β-лактамазы и участок ori (pBR322) инициации репликации; кДНК гена легумаин O.felineus без сигнального пептида, фланкированную сайтами рестрикции BamHI и HindIII; промотор гибридный Ptac; lac-операторную последовательность для усиления связывания lac-репрессора; терминаторы транскрипции гена rrnB E.coli (t1 и t2); в качестве генетического маркера ген β-лактамазы (ampR), детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pMALTEV-legumain клеток E.coli к ампициллиновым антибиотикам; нуклеотидную последовательность, кодирующую MBP (мальтоза-связывающий белок), являющийся частью гибридной последовательности рекомбинантного белка MBP-legumain и позволяющий выделять рекомбинантный полипептид методами аффинной хроматографии; уникальные сайты эндонуклеаз рестрикции, имеющие следующие координаты: BamHI (2668), EcoRI (2675), StuI (2685), SalI (2691), SpeI (2704), NotI (2711), XbaI (2725), PstI (2737), XhoI (2740), SphI (2750), KpnI (2756), HindIII (2758). Изобретение относится также к штамму E.coli BL21(DE3)pLysS-pMALTEV-legumain, полученному с помощью рекомбинантной плазмидной ДНК pMALTEV-legumain, депонированному в коллекции культур микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером В-1253. Изобретение позволяет получить рекомбинантный гибридный полипептид с антигенными свойствами белка легумаина O.felineus, обеспечивающий высокую специфичность к антителам паразитарной инфекции O.felineus, что позволяет создавать высокочувствительные тест-системы с использованием указанного полипептида. 2 н.п. ф-лы, 6 ил., 5 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и генетической инженерии и представляет собой вектор для получения вектора для экспрессии в бактериальной клетке предшественника целевого рекомбинантного белка, слитого с N-концевым пептидом, содержащим декагистидиновый кластер и сайт узнавания протеиназой, по существу состоящий из участка инициации репликации pBR322 ori; гена репрессора лактозного оперона; бактериального промотора; области, кодирующей N-концевой лидерный пептид, содержащий декагистидиновый кластер и, необязательно, сайт узнавания протеиназой; участка клонирования (полилинкера); участка терминации транскрипции, функционирующего в бактериальной клетке; фрагмента, кодирующего негеномную пару токсин-антитоксин, при этом ген антитоксина ориентирован таким образом, что направление его транскрипции совпадает с направлением транскрипции целевого гена; гена, кодирующего бактериальный маркер селекции. Изобретение относится также к вектору для экспрессии в бактериальной клетке предшественника целевого рекомбинантного белка, слитого с N-концевым пептидом, бактерии, содержащей такой вектор, и способу получения рекомбинантного белка с использованием бактерии. Изобретение позволяет получить новый вектор с повышенной сегрегационной стабильностью для высокоэффективной экспрессии рекомбинантных белков со слитым в рамке N-концевым лидерным пептидом, содержащим декагистидиновый кластер и сайт узнавания протеиназой. 4 н. и 5 з.п. ф-лы, 12 ил, 1 табл., 4 пр.

Изобретение относится к области генной инженерии и может быть использовано в биотехнологических процессах в качестве средства для объединения фрагментов ДНК и получения сложных ДНК-конструкций. Предложены векторные плазмиды («стыковочные векторы») для синтеза трансгенов (РЕ3), представляющие собой клонирующий вектор, в который включен модуль клонирования, состоящий из четырех генных шарниров (ГШ 1-4) и расположенных между ними трех нуклеотидных последовательностей (НП 1-3), где каждый из ГШ содержит от 2 до 4 невариабельных редких сайтов рестрикции из более чем 6 нуклеотидов, а нуклеотидные последовательности между ГШ включают «вкладыши», которые при клонировании заменяются в НП 1 - модулем промотора; в НП 2 - модулем экспрессии, а в НП 3 - 3'-регуляторным модулем. При этом либо ГШ 1, либо ГШ 2 независимо содержат 3-4 невариабельных редких сайта рестрикции более чем из 6 нуклеотидов. Предлагается также вариация стыковочного вектора РЕ3 по изобретению, предназначенная для множественного клонирования (МС) и отличающаяся тем, что, по меньшей мере, одна из трех НП является модулем множественного клонирования с сайтом множественного клонирования, включающим распространенные сайты рестрикции, которые являются уникальными в стыковочном векторе РЕ3. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 21 ил.

Изобретение относится к области биохимии, молекулярной биологии и медицины. Предложен способ получения наноразмерной системы доставки фрагментов нуклеиновых кислот (ФНК) и их аналогов в клетки млекопитающих. Получают суспензию наночастиц TiO2 с концентрацией 1-2 мг/мл в 0,1-0,5 M растворе NaCl. При этом частицы TiO2 имеют размер 3-20 нм, преимущественно 3-5 нм, и находятся в аморфной или в кристаллической форме анатаз или брукит. Полученную суспензию TiO2 смешивают с водным раствором полилизина с концентрацией 20 мг/мл в соотношении TiO2:полилизин равном 1:(0,05-0,8). Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение не менее 30 мин. Далее к полученной суспензии полилизинсодержащих наночастиц добавляют 5-70 мкл раствора ФНК с концентрацией 10-4-10-7 М и инкубируют в 0,1-0,5 М растворе NaCl при комнатной температуре в течение 20-30 мин. Получают нанокомпозит TiO2-PL·ФНК с емкостью по ФНК 0,2-60 нмоль/мг. Изобретение позволяет упростить способ получения системы доставки ФНК и сократить его длительность. 3 з.п. ф-лы, 3 ил., 14 пр.
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения L-аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина, L-аргинина, L-цитруллина и L-орнитина. Способ, включающий выращивание в питательной среде бактерии рода Escherichia, которая модифицированная таким образом, что экспрессия гена ycfR в указанной бактерии усилена, и выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости. Изобретение позволяет получать L-аминокислоту с высокой степенью эффективности. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 14 пр., 2 табл.
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения L-аминокислоты, выбранной из группы, включающей L-глутамин, L-глутаминовую кислоту, L-пролин, L-аргинин, L-цитруллин, L-орнитин. Способ включает выращивание бактерии семейства Enterobacteriaceae, модифицированной таким образом, что экспрессия гена yeel в указанной бактерии усилена, и выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости. Изобретение позволяет получать L-аминокислоты с высокой степенью эффективности. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 2 табл., 14 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой бактерию рода Escherichia, которая продуцирует L-аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина, L-аргинина, L-цитруллина и L-орнитина. При этом бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия гена bssR в указанной бактерии усилена. Изобретение относится также к способу получения L-аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина, L-аргинина, L-цитруллина и L-орнитина, с использованием указанной бактерии. Изобретение позволяет получать аминокислоты с высокой степенью эффективности. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 табл., 14 пр.

Изобретение относится к области медицины, нейробиологии и фармакогенетике и касается способа получения валидной молекулярно-генетической модели абсансной эпилепсии человека. Представленный способ заключается в том, что с помощью генотипирования локуса Taq 1А DRD2 среди крыс линии WAG/Rij выявляются родительские особи Р с генотипом А1/А1 гена DRD2, скрещиваются между собой, получают потомство F1, которое выращивают до половозрелого возраста, затем среди потомства F1 выделяют неаудиогенных особей, после чего неаудиогенных особей потомства F1 скрещивают между собой для получения потомства F2, которое затем также доращивается до половозрелого возраста, среди них также производится отбор неаудиогенных особей, при этом скрещивание и отбор производится неоднократно для получения однородной популяции неаудиогенных крыс линии WAG/Rij с генотипом А1/А1 гена DRD2, контроль типа ПВР у отобранных особей потомства F1 для последующего скрещивания производится посредством электроэнцефалографического анализа, включающего морфологический контроль. Представленное изобретение может быть использовано для доклинических испытаний антиэпилептических препаратов. 1 ил., 1 табл.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Вектор экспрессии содержит: (a) ориджин репликации OriP, полученный из вируса Эпштейна-Барр (EBV), где ориджин репликации содержит: 1) элемент симметрии второго порядка (DS); и 2) участок дупликации (FR), который содержит участок связывания EBNA; (b) ориджин репликации SV40; (c) участок инсерции для вставки представляющего интерес гена; (d) промотор EF-1б, функционально связанный с участком инсерции; (e) сигнал поли-A; (f) бактериальный ориджин репликации; (g) селектируемый маркер; и необязательно содержащий (h) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую константную область тяжелой или легкой цепи антитела, функционально связанную с участком инсерции. Причем ориджин репликации OriP связан с действующим извне фактором инициации репликации EBNA 1, который не кодируется вектором экспрессии. Использование вектора экспрессии в выделенной клетке-хозяине, наборе и способе получения рекомбинантного белка обеспечивает получение обильной экспрессии белка. 4 н. и 22 з.п. ф-лы, 25 ил., 3 табл., 4 пр.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено гуманизированное антитело к человеческому интегрину альфа-9 (α9), полученное из антитела Y9A2 мыши и обладающее улучшенной активностью и термостабильностью. Также рассмотрен полинуклеотид, вектор экспрессии, клетка-хозяин и способ продуцирования гуманизированного антитела по изобретению с их использованием, а также терапевтическое лекарственное средство от ревматоидного артрита, способ профилактики или лечения ревматоидного артрита и применения гуманизированного антитела по изобретению при изготовлении фармацевтического препарата для профилактики или лечения ревматоидного артрита. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в терапии ассоциированных с интегрином α9 заболеваний человека. 8 н. и 6 з.п. ф-лы, 6 ил., 6 табл., 11 пр.
Наверх