Способ ускоренного линейного иммуноэлектрофореза для дифференцирования буркхольдерий



Способ ускоренного линейного иммуноэлектрофореза для дифференцирования буркхольдерий
Способ ускоренного линейного иммуноэлектрофореза для дифференцирования буркхольдерий
Способ ускоренного линейного иммуноэлектрофореза для дифференцирования буркхольдерий
Способ ускоренного линейного иммуноэлектрофореза для дифференцирования буркхольдерий
Способ ускоренного линейного иммуноэлектрофореза для дифференцирования буркхольдерий

 


Владельцы патента RU 2496112:

Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Изобретение относится к медицине, лабораторной диагностике и касается способа ускоренного линейного иммуноэлектрофореза (ЛИЭФ) для дифференцирования буркхольдерий. Способ включает получение антигенного препарата, линейный иммуноэлектрофорез антигенов исследуемых микроорганизмов и последующий учет результатов, причем для быстрого выявления патогенных возбудителей сапа и мелиоидоза с использованием сывороток иммунных кроличьих или козьих, с титром антител в РИД не ниже 1:16, полученных иммунизацией ВСЭ из ацетон-высушенных клеток штаммов В. pseudomallei 100 или В. mallei 10230, предварительно обработанных ультразвуком 2 раза в течение 2 мин при 50 Гц с охлаждением, содержащих антитела к специфическому высокомолекулярному антигенному комплексу с м.м. не ниже 336 kDa, линейный электрофорез проводят в следующей постановке: пластинку фирмы «GelBond», размером 8,5×10 см, заливают 10 мл 1% раствора агарозы фирмы «Calbiochem», приготовленного на трис-вероналовом буфере, содержащем 0,1 г лактата кальция и 0,7 г азида натрия в 1 л буфера, рН 8,6, разведенном в 5 раз (этот же буфер используется в электродных отсеках), на расстоянии 1 см от края пластинки с анодной стороны вырезают полосу геля шириной 4-5 см, гель растапливают, охлаждают до 48°С, добавляют к нему 5-10 об.% сыворотки, содержащей антитела к исследуемым антигенам, и снова заливают на пластинку, между гелем с сывороткой и исследуемыми пробами антигенов оставляют контактную полоску геля шириной 1-2 мм, после застывания геля с сывороткой на границе с контактной полосой располагают прямоугольные гель-образцы с антигенами, подлежащими исследованию, гель-образцы готовят так же, как сыворотку, внося в охлажденный гель 5-10 об.% исследуемых антигенов, к краям геля прикладывают мостики из 5 слоев фильтровальной бумаги, смоченные электродным буфером, электрофорез проводят при напряженности электрического поля - 4-5 В/см в течение 3-5 ч при комнатной температуре, после остановки электрофореза пластинки просматривают, наличие линий преципитата на границе гель-образца и геля с сыворотками иммунными кроличьими или козьими, содержащими антитела к искомому антигенному комплексу, при данных условиях ЛИЭФ свидетельствует о присутствии антигенов патогенных В. pseudomallei и В. mallei, отрицательный результат указывает на отсутствие антигенов патогенных микроорганизмов, что позволяет дифференцировать возбудители сапа и мелиоидоза от непатогенных близкородственных буркхольдерий. Способ обладает простотой и быстротой исполнения, наглядностью, возможностью определения общих и специфических антигенов буркхольдерий, отбора иммунных сывороток, содержащих антитела к соответствующим антигенам, возможностью количественной оценки результатов при отсутствии потребности в сложном оборудовании. Данный способ может применяться как дополнительный аналитический метод выявления антигенов патогенных буркхольдерий. 5 ил., 4 пр.

 

Изобретение относится к медицине, лабораторной диагностике и касается обнаружения специфического антигенного комплекса возбудителей сапа и мелиоидоза.

Изобретение может быть использовано для дифференцирования патогенных Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei от непатогенных близкородственных буркхольдерий.

Изобретение может быть использовано для изучения иммунных сывороток к антигенам данных микроорганизмов и сывороток к антигенам непатогенных близкородственных буркхольдерий, а также для установления идентичности различных бактериальных антигенов.

В силу ряда причин до настоящего времени сохраняется повышенный интерес исследователей к изучению буркхольдерий, относящихся к группе «pseudomallei», и Burkholderia cepacia - комплексу. Возбудитель мелиоидоза является эндемичным для Юго-Восточной Азии, Северной Австралии, некоторых районов Африки, Северной и Центральной Америки. В ареалах обитания этот микроорганизм обычно выделяется из почвы и водоемов со стоячей водой. Клиническая картина заболевания у людей варьирует от острой септицемии до хронической или латентной инфекции. Показано, что уровень смертности от мелиоидоза в Северо-Восточном Таиланде достигает 50%, причем умирает 40% пациентов, получавших антибактериальные препараты, что связано со значительной устойчивостью возбудителя к антибиотикам (Harding S.V., Sarkar-Tyson М., Oyston P.C.F., Titball R.W. Immunogenic proteins of Burkholderia pseudomallei and uses thereof// Patent WO/2008/017826).

Возбудитель сапа способен передаваться от больных лошадей людям, профессионально занятым уходом за животными, алиментарным, аэрозольным или контактным путем (через кожные покровы) и вызывать острые и хронические заболевания, в том числе с летальным исходом. Заболевание до сих пор встречается в Азии, Африке, Южной и Центральной Америке, в западных странах случаи инфекции редки.

Установлено, что В. mallei и В. pseudomallei имеют сходное строение, в том числе и антигенный состав (Пивень Н.Н., Илюхин В.И. Патогенность Burkholderia pseudomallei как функция его внеклеточных и поверхностных антигенов // Журн. микробиол. - 2000. - №6. - С.94-99). Особенно высока вероятность заболевания указанными инфекциями у лиц, страдающих сахарным диабетом, алкоголизмом, или со сниженным иммунным статусом. Лечение часто безуспешно, вакцинопрофилактика не разработана (Sarkar-Tyson М., Titball R.W. Progress toward development of vaccines against melioidosis: A review // Clin. Ther. - 2010. - V.32, №8. - P.1437-1445). Кроме того, подтверждена возможность использования В. pseudomallei и В. mallei в качестве компонентов биологического оружия (Whitlock G.C., Robida M.D., Judy В.М. et al. Protective antigens against glanders identified by expression library immunization // Front Microbiol. - 2011. - №2. - P.227).

Burkholderia thailandensis входит в кластер из трех близкородственных микроорганизмов, характеризующихся высокой схожестью, включающий также В. pseudomallei и В. mallei. Однако В. thailandensis обладает гораздо меньшей вирулентностью и редко вызывает заболевания у человека, в связи с чем рекомендуется в качестве штамма-суррогата В. pseudomallei в ряде исследований (Morici L.A., Heang J.,Tate Т. et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to Burkholderia thailandensis aerosol infection // Microb. Pathog. - 2010. - V.48, №1. - P.9-17; Ngugi S.A., Ventura V.V., Qazi O. et al. // Vaccine. - 2010. - V.28, №47. - P.7551-7555). В частности, антиген из целых клеток В. thailandensis предлагают использовать в эндемичных районах для обнаружения у больных людей общих антител к В. pseudomallei с помощью иммунофлюоресцентного анализа (Puthucheary S.D., Anuar A.S., Tee T.S. Burkholderia thailandensis whole cell antigen cross-reacts with B. pseudomallei antibodies from patients with melioidosis in an immunofluorescent assay//Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health. - 2010. - V.41, №2. - P.395-400).

Близкородственные бактерии В. cepacia-комплекса (В. cepacia и Burkholderia gladioli) обитают во внешней среде и не являются патогенными для здоровых людей. Однако они способны вызывать респираторные заболевания у пациентов с кистозным фиброзом, а также нозокомиальные инфекции у лиц, находящихся на лечении в палатах интенсивной терапии (Harding S.V., Sarkar-Tyson М., Oyston P.C.F., Titball R.W. Immunogenic proteins of Burkholderia pseudomallei and uses thereof // Patent WO/2008/017826). Значительное родство буркхольдерий подтверждается в экспериментах по получению моноклональных антител. Так, мышиные моноклональные антитела к соматическому антигену 64 kDa В. cepacia из испытанного широкого спектра других бактерий давали перекрестные реакции только со штаммами В. pseudomallei, В. mallei и В. gladioli (Otterbein С.К., Splettstoesser W.D., Linde H.J. et al. Development and characterization of a murine monoclonal antibody reactive with a 64 kDa somatic antigen of Burkholderia cepacia/fHybridoma. - 1998. - V.17, №2. - P.143-150).

В связи с вышеизложенным представляют интерес методы, позволяющие отличать патогенные В. pseudomallei и В. mallei от близкородственных непатогенных в обычных условиях буркхольдерий.

Близким решением является предложенный Пивень Н.Н. с соавт. способ выявления перекрестно-реагирующих антигенов возбудителей мелиоидоза, сапа, чумы, туляремии и туберкулеза в ДСН-ПААГ электрофорезе (Пивень Н.Н., Тимошин В.Б., Алексеев В.В. и др. Способ выявления перекрестнореагирующих антигенов возбудителей мелиоидоза, сапа, чумы, туляремии и туберкулеза // Патент №2286576 от 27.10.2006 г.). Авторы указывают на значительную схожесть антигенных спектров близкородственных видов В. mallei, В. pseudomallei и В. thailandensis, поэтому данный метод позволяет выявлять у них индивидуальные белковые антигены, но не дифференцировать бактериальные виды друг от друга.

Предложен способ дифференцирования патогенных возбудителей мелиоидоза и сапа от непатогенных для людей буркхольдерий и близкородственных микроорганизмов путем выявления в составе микробных клеток поверхностного антигенного комплекса в ракетном иммуноэлектрофорезе (Корсакова И.И., Напалкова Г.М., Храпова Н.П. и др. Способ дифференцирования патогенных от непатогенных буркхольдерий // Патент №2378360 от 10.01.2010 г.). Применение метода может быть несколько ограничено в связи с использованием специфической сыворотки иммунной козьей, содержащей антитела к данному комплексу.

Наиболее близким аналогом изучения сывороток и разных образцов антигенов является метод линейного иммуноэлектрофореза (ЛИЭФ), предложенный И. Креллем (Аксельсен Н., Крелль И., Вееке Б. Руководство по количественному иммуноэлектрофорезу. Методы и применение // М.: Мир, 1977. - 216 с). Авторы использовали метод для определения характеристик большинства белков нормальных и патологических сывороток крови человека и для получения специфических сывороток иммунизацией чистыми комплексами антиген-антитело, выделенными методом линейного иммуноэлектрофореза. Для этих целей линейный иммуноэлектрофорез проводили в течение 18 ч при напряженности электрического поля (Н) 1,5 В/см при температуре 10°С.

Целью изобретения является разработка способа ускоренного ЛИЭФ для дифференцирования патогенных возбудителей сапа и мелиоидоза от непатогенных близкородственных буркхольдерий.

Поставленная цель достигается выявлением в составе микробных клеток специфического высокомолекулярного антигенного комплекса с м.м. не ниже 336 kDa с помощью иммунных сывороток кроличьих или козьих, с титром антител в РИД не ниже 1:16, полученных иммунизацией водно-солевыми экстрактами (ВСЭ) из ацетон-высушенных клеток штаммов В. pseudomallei 100 или В. mallei 10230, предварительно обработанных ультразвуком 2 раза в течение 2 мин при 50 Гц с охлаждением.

Авторами изобретения предпринимались попытки проводить дифференцирование патогенных буркхольдерий от непатогенных с помощью линейного иммуноэлектрофореза, используя различные условия его постановки. Были испытаны несколько буферных растворов с ионной силой 0,016-0,032 (трис-вероналовый с лактатом кальция, рН 8,6; барбитал-трис-глициновый, рН 8,8). Варьировали величину напряженности электрического поля (2-12 В/см), длительность (0,5-18 ч), температуру (10-25°С).

В процессе исследований были подобраны следующие условия постановки ЛИЭФ: пластинку фирмы «GelBond», размером 8,5×10 см, заливают 10 мл 1% раствора агарозы фирмы «Calbiochem», приготовленного на трис-вероналовом буфере, содержащем 0,1 г лактата кальция и 0,7 г азида натрия в 1 л буфера, рН 8,6, разведенном в 5 раз (этот же буфер используется в электродных отсеках). На расстоянии 1 см от края пластинки с анодной стороны вырезают полосу геля шириной 4-5 см. Гель растапливают, охлаждают до 48°С, добавляют к нему 5-10 об.% сыворотки, содержащей антитела к исследуемым антигенам, и снова заливают на пластинку. Между гелем с сывороткой и исследуемыми пробами антигенов оставляют контактную полоску геля шириной 1-2 мм. После застывания геля с сывороткой на границе с контактной полосой располагают прямоугольные гель-образцы с антигенами, подлежащими исследованию. Гель-образцы готовят так же, как сыворотку, внося в охлажденный гель 5-10 об.% исследуемых антигенов. К краям геля прикладывают мостики из 5 слоев фильтровальной бумаги, смоченные электродным буфером. Электрофорез проводят при напряженности электрического поля - 4-5 В/см в течение 3-5 ч при комнатной температуре. После остановки электрофореза пластинки просматривают. Наличие линий преципитата на границе гель-образца и геля с сыворотками иммунными кроличьими или козьими, содержащими антитела к искомому антигенному комплексу, при данных условиях ЛИЭФ свидетельствует о присутствии антигенов патогенных В. pseudomallei и В. mallei. Отрицательный результат указывает на отсутствие антигенов патогенных микроорганизмов, что позволяет дифференцировать возбудители сапа и мелиоидоза от непатогенных близкородственных буркхольдерий.

Исследование по этому признаку штаммов методом ускоренного линейного иммуноэлектрофореза в данной модификации с антителами, полученными к ВСЭ из ацетон-высушенных клеток возбудителей сапа и мелиоидоза, может быть использовано при изучении антигенного материала и сывороток. Наличие непрерывных преципитационных линий, образуемых расположенными рядом гель-образцами, свидетельствует об идентичности исследуемых антигенов.

Примеры конкретного выполнения, подтверждающие осуществление предлагаемого способа.

Пример 1. Дифференцирование патогенных штаммов В. mallei и В. pseudomallei от близкородственных буркхольдерий.

Линейный иммуноэлектрофорез проводят на пластинке фирмы «GelBond», размером 8,5×10 см, заливают 10 мл 1% раствора агарозы фирмы «Calbiochem», приготовленного на трис-вероналовом буфере, содержащем 0,1 г лактата кальция и 0,7 г азида натрия в 1 л буфера, рН 8,6, разведенном в 5 раз (этот же буфер используется в электродных отсеках). На расстоянии 1 см от края пластинки с анодной стороны вырезают полосу геля шириной 4 см. Гель растапливают, охлаждают до 48°С, добавляют к нему 10 об.% сыворотки (кроличьей или козьей), содержащей антитела к исследуемым антигенам, и снова заливают на пластинку. Между гелем с сывороткой и исследуемыми пробами антигенов оставляют контактную полоску геля шириной 1,5 мм. После застывания геля с сывороткой на границе с контактной полосой располагают прямоугольные гель-образцы с антигенами, подлежащими исследованию (ВСЭ из ацетон-высушенных клеток): В. thailandensis 264, 294, В. gladioli 8495, 1298, В. cepacia 25416, В. mallei 10230, В. pseudomallei 100. Гель-образцы готовят так же, как сыворотку, внося в охлажденный гель 10 об.% исследуемых антигенов. К краям геля прикладывают мостики из 5 слоев фильтровальной бумаги, смоченные электродным буфером. Условия электрофореза: напряженность электрического поля - 4,8 В/см, время электрофореза - 4,5 ч при комнатной температуре. После остановки электрофореза пластинки просматривают.

Наличие линий преципитата на границе гель-образца и геля с сыворотками иммунными свидетельствует о присутствии антигенов патогенных В. mallei и В. pseudomallei, отрицательный результат указывает на отсутствие антигенов патогенных буркхольдерий.

Пример 2. Дифференцирование патогенных штаммов В. mallei и В. pseudomallei от близкородственных буркхольдерий и установление идентичности антигенов.

Линейный иммуноэлектрофорез проводят, как описано в примере 1. В гель добавляют 5 об.% сыворотки козьей к В. mallei 10230. Гель-образцы готовят так же, как сыворотку, внося в охлажденный гель 5 об.% исследуемых антигенов: ВСЭ из ацетон-высушенных клеток В. cepacia 25416, В. pseudomallei 57576, В. mallei Ц-4, В. thailandensis 264. Между гелем с сывороткой и исследуемыми пробами антигенов оставляют контактную полоску геля шириной 2 мм. К краям геля прикладывают мостики из 5 слоев фильтровальной бумаги, смоченные электродным буфером. Условия электрофореза: напряженность электрического поля - 4,2 В/см, время электрофореза - 5 ч при комнатной температуре. После остановки электрофореза пластинки просматривают.

Наличие линий преципитата на границе гель-образца и геля с сыворотками иммунными свидетельствует о присутствии антигенов патогенных В. mallei и В. pseudomallei, отрицательный результат указывает на отсутствие антигенов патогенных буркхольдерий; наличие непрерывных преципитационных линий, образуемых расположенными рядом гель-образцами, свидетельствует об идентичности исследуемых антигенов штаммов В. mallei и В. pseudomallei.

Пример 3. Обнаружение общих антигенов у патогенных и непатогенных буркхольдерий.

Линейный иммуноэлектрофорез проводят, как описано в примере 1. В гель добавляют 10 об.% сыворотки кроличьей к В. mallei 10230. Гель-образцы готовят так же, как сыворотку, внося в охлажденный гель 10 об.% исследуемых антигенов: ВСЭ из ацетон-высушенных клеток В. pseudomallei 100, В. mallei 10230, В. thailandensis 264. Между гелем с сывороткой и исследуемыми пробами антигенов оставляют контактную полоску геля шириной 1 мм. К краям геля прикладывают мостики из 5 слоев фильтровальной бумаги, смоченные электродным буфером. Условия электрофореза: напряженность электрического поля - 4,5 В/см, время электрофореза - 50 мин при комнатной температуре. После остановки электрофореза пластинки просматривают.

Линии преципитата на границе гель-образца и геля с сывороткой иммунной отсутствуют; наличие на расстоянии 5 см от контактной полосы непрерывных преципитационных линий, образуемых расположенными рядом гель-образцами, свидетельствует об идентичности исследуемых общих антигенов штаммов В. mallei, В. pseudomallei и В. thailandensis.

Пример 4. Обнаружение общих и специфических антигенов у патогенных и непатогенных буркхольдерий в ускоренном линейном иммуноэлектрофорезе.

Линейный иммуноэлектрофорез проводят, как описано в примере 1. В гель добавляют 10 об.% сыворотки кроличьей к В. pseudomallei 100. Гель-образцы готовят так же, как сыворотку, внося в охлажденный гель 10 об.% исследуемых антигенов: ВСЭ из ацетон-высушенных клеток В. pseudomallei 57274, 60913, В. mallei 10230, В. cepacia 25416. Между гелем с сывороткой и исследуемыми пробами антигенов оставляют контактную полоску геля шириной 2 мм. К краям геля прикладывают мостики из 5 слоев фильтровальной бумаги, смоченные электродным буфером. Условия электрофореза: напряженность электрического поля - 4,2 В/см, время электрофореза - 3,5 ч при комнатной температуре. После остановки электрофореза пластинки просматривают.

Наличие линий преципитата на границе гель-образцов и геля с сывороткой иммунной свидетельствует о присутствии антигенов патогенных В. pseudomallei и В. mallei, отрицательный результат указывает на отсутствие антигенов патогенных буркхольдерий; непрерывные преципитационные линии свидетельствуют об идентичности исследуемых антигенов штаммов В. mallei и В. рseudomallei; наличие на расстоянии 5 см от контактной полосы непрерывных преципитационных линий показывает идентичность исследуемых общих антигенов штаммов В. mallei, В. pseudomallei и В. cepacia.

Краткое описание рисунков.

На рис.1 приведены результаты изучения патогенных и непатогенных буркхольдерий в ускоренном линейном иммуноэлектрофорезе при напряженности электрического поля - 4,8 В/см, длительности электрофореза - 4,5 ч при комнатной температуре. Использованы сыворотка кроличья к В. pseudomallei 100 и антигены: ВСЭ из ацетон-высушенных клеток В. thailandensis 264 (1), В. gladioli 8495 (2), В. cepacia 25416 (3), В. mallei 10230 (4).

На рис.2 приведены результаты изучения патогенных и непатогенных буркхольдерий в ускоренном линейном иммуноэлектрофорезе при напряженности электрического поля - 4,8 В/см, длительности электрофореза - 4,5 ч при комнатной температуре. Использованы сыворотка козья к В. mallei 10230 и антигены: ВСЭ из ацетон-высушенных клеток В. pseudomallei 100 (1), В. gladioli 1298 (2), В. thailandensis 294 (3), В. cepacia 25416 (4).

На рис.3 приведены результаты дифференцирования патогенных и непатогенных буркхольдерий и установления идентичности антигенов в ускоренном линейном иммуноэлектрофорезе при напряженности электрического поля - 4,2 В/см, длительности электрофореза - 5 ч при комнатной температуре. Использованы сыворотка козья к В. mallei 10230 и антигены: ВСЭ из ацетон-высушенных клеток В. cepacia 25416 (1), В. pseudomallei 57576 (2), В. mallei Ц-4 (3), В. thailandensis 264 (4).

На рис.4 приведены результаты обнаружения общих антигенов у патогенных и непатогенных буркхольдерий в ускоренном линейном иммуноэлектрофорезе при напряженности электрического поля - 4,5 В/см, длительности электрофореза - 50 мин при комнатной температуре. Использованы сыворотка кроличья к В. pseudomallei 100 и антигены: ВСЭ из ацетон-высушенных клеток В. pseudomallei 100 (1), В. thailandensis 264 (2), В. mallei 10230 (3).

На рис.5 приведены результаты обнаружения общих и специфических антигенов у патогенных и непатогенных буркхольдерий в ускоренном линейном иммуноэлектрофорезе при напряженности электрического поля - 4,2 В/см, длительности электрофореза - 3,5 ч при комнатной температуре. Использованы сыворотка кроличья к В. pseudomallei 100 и антигены: ВСЭ из ацетон-высушенных клеток В. pseudomallei 57274 (1), В. mallei 10230 (2), В. cepacia 25416 (3), В. pseudomallei 60913 (4).

Таким образом, разработан способ ускоренного линейного иммуноэлектрофореза для дифференцирования патогенных возбудителей сапа и мелиоидоза, относящихся к особо опасным микроорганизмам, от непатогенных близкородственных буркхольдерий за счет изменения условий его проведения (напряженности электрического поля, длительности, температуры и состава буферного раствора) с сывороткой, полученной к В. pseudomallei 100 или к В. mallei 10230, который отличает простота и быстрота исполнения, наглядность, возможность определения общих и специфических антигенов буркхольдерий, отбора иммунных сывороток, содержащих антитела к соответствующим антигенам, возможность количественной оценки результатов, отсутствие потребности в сложном оборудовании. Данный способ может применяться как дополнительный аналитический метод выявления антигенов патогенных буркхольдерий.

Способ ускоренного линейного иммуноэлектрофореза для дифференцирования буркхольдерий, включающий получение антигенного препарата, линейный иммуноэлектрофорез антигенов исследуемых микроорганизмов и последующий учет результатов, отличающийся тем, что для быстрого выявления патогенных возбудителей сапа и мелиоидоза с использованием сывороток иммунных кроличьих или козьих, с титром антител в РИД не ниже 1:16, полученных иммунизацией ВСЭ из ацетон-высушенных клеток штаммов В. pseudomallei 100 или В. mallei 10230, предварительно обработанных ультразвуком 2 раза в течение 2 мин при 50 Гц с охлаждением, содержащих антитела к специфическому высокомолекулярному антигенному комплексу с м.м. не ниже 336 kDa, линейный электрофорез проводят в следующей постановке: пластинку фирмы «GelBond», размером 8,5×10 см, заливают 10 мл 1(раствора агарозы фирмы «Calbiochem», приготовленного на трис-вероналовом буфере, содержащем 0,1 г лактата кальция и 0,7 г азида натрия в 1 л буфера, рН 8,6, разведенном в 5 раз (этот же буфер используется в электродных отсеках), на расстоянии 1 см от края пластинки с анодной стороны вырезают полосу геля шириной 4-5 см, гель растапливают, охлаждают до 48°С, добавляют к нему 5-10 об.(сыворотки, содержащей антитела к исследуемым антигенам, и снова заливают на пластинку, между гелем с сывороткой и исследуемыми пробами антигенов оставляют контактную полоску геля шириной 1-2 мм, после застывания геля с сывороткой на границе с контактной полосой располагают прямоугольные гель-образцы с антигенами, подлежащими исследованию, гель-образцы готовят так же, как сыворотку, внося в охлажденный гель 5-10 об.(исследуемых антигенов, к краям геля прикладывают мостики из 5 слоев фильтровальной бумаги, смоченные электродным буфером, электрофорез проводят при напряженности электрического поля - 4-5 В/см в течение 3-5 ч при комнатной температуре, после остановки электрофореза пластинки просматривают, наличие линий преципитата на границе гель-образца и геля с сыворотками иммунными кроличьими или козьими, содержащими антитела к искомому антигенному комплексу, при данных условиях ЛИЭФ свидетельствует о присутствии антигенов патогенных В. pseudomallei и В. mallei, отрицательный результат указывает на отсутствие антигенов патогенных микроорганизмов, что позволяет дифференцировать возбудители сапа и мелиоидоза от непатогенных близкородственных буркхольдерий.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицины и касается способа определения степени тяжести тканевой гипоксии при хронических диффузных заболеваниях печени (ХДЗП). .

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной онкологии, и может быть использовано для молекулярно-генетической диагностики чувствительности опухоли у пациентов с раком легкого на терапию гефитинибом.
Изобретение относится к медицине, онкологии и гематологии и может быть использовано для определения кардиотоксических осложнений у больных хроническим лимфолейкозом, получающих полихимиотерапию.
Изобретение относится к области медицины, а именно к инфектологии, и касается способа диагностики хронической скрытой хламидийной инфекции в центральной нервной системе (ЦНС).

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике. .
Изобретение относится к области клинической лабораторной диагностики и может быть использовано для прогнозирования перехода облигатного предрака в ранний рак гортани у мужчин.

Изобретение относится к медицине, а именно к лепрологии, и может быть использовано для диагностики лепры. .

Изобретение относится к медицине, в частности, может быть использовано в качестве одного из критериев выявления излеченности больных лепрой. .

Изобретение относится к иммунологии, в частности к методу количественного имму-ноэлектрофореза, и может быть использовано для изучения количественных изменений антигенов.
Наверх