Композиции и способы для доставки лекарственных средств

Настоящее изобретение относится к поверхностно-модифицированным частицам и способам их изготовления и применения, фармацевтическим суспензиям, содержащим указанные поверхностно-модифицированные частицы, и способу усиления поглощения клетками активного агента. Поверхностно-модифицированные частицы содержат ядро частицы и покрытие, связанное с ядром частицы; указанное покрытие абсорбировано на поверхности ядра частицы, в котором содержится терапевтический агент; покрытие содержит опсонин; и поверхностно-модифицированная частица имеет средний размер приблизительно от 1 нм до 2000 нм; указанный опсонин выбран из белков и пептидов, которые связываются с частицами или клетками таким образом, что повышается подверженность указанных частиц или клеток фагоцитозу, где pH раствора, содержащего опсонин, находится ниже изоэлектрической точки опсонина. 5 н. и 30 з.п. ф-лы, 11 ил., 3 табл., 11 пр.

 

Права правительства на изобретение

Настоящее изобретение осуществлено при правительственной поддержке в виде гранта № R01NS036126-12, присужденного Национальными институтами здравоохранения. Правительство имеет определенные права на настоящее изобретение.

Уровень техники

Область техники

Описание относится, главным образом, к композициям, содержащим частицы с покрытием, и к способам изготовления и применения указанных композиций для направленной доставки лекарственных средств.

Краткое описание уровня техники

Наночастицы (включая наносферы) и микрочастицы (включая микросферы), обобщенно называемые в настоящем документе «частицами», представляют собой твердые или полутвердые частицы, имеющие диаметр приблизительно от 1 нм до 10000 нм (10 микрон). Указанные частицы можно изготавливать из различных материалов, включая белки, синтетические полимеры, полисахариды, нуклеиновые кислоты, малые молекулы и их комбинации, и использовать для множества различных целей, главным образом, для сепарации, диагностики и доставки лекарственных средств.

Композиции, содержащие указанные частицы, как было установлено, являются пригодными для доставки лекарственных средств. Например, патентная публикация США № 2006/0073199 описывает, что частицы, содержащие активный агент, можно изготавливать в форме водных суспензий и стабилизировать против агрегации и увеличения размеров частиц путем нанесения покрытий из поверхностно-активных агентов на частицы или вблизи частиц.

В настоящее время продолжает существовать потребность в разработке композиций, содержащих частицы, и способов их изготовления и применения, особенно, в области доставки лекарственных средств, представляющих интерес.

Раскрытие изобретения

Один аспект изобретения относится к поверхностно-модифицированной частице, содержащей ядро частицы и покрытие, связанное с ядром частицы. Ядро частицы содержит активный агент, такой как терапевтический агент или диагностический агент (например, малую органическую молекулу или биомакромолекулу). Покрытие содержит опсонин, например, антитело, имеющее изотип IgG, или комплементный белок, такой как C3b или С5. Можно использовать также другие белки, о которых известно, что они действуют как опсонины. Поверхностно-модифицированные частицы по настоящему изобретению обычно имеют средний размер приблизительно от 1 нм до 10000 нм.

Другой аспект изобретения относится к способу усиления поглощения клетками активного агента. Способ предусматривает контактирование клеток с поверхностно-модифицированными частицами в условиях, достаточных для усиления поглощения клетками поверхностно-модифицированных частиц. Частицы содержат ядро частицы и покрытие, связанное с ядром частицы, в которых ядро частицы содержит активный агент, покрытие содержит опсонин (например, антитело, имеющее изотип IgG, или комплементный белок, такой как C3b или С5), и поверхностно-модифицированная частица имеет средний размер приблизительно от 1 нм до 2000 нм.

Другой аспект изобретения относится к способу лечения субъекта, имеющего воспалительное заболевание или расстройство, который предусматривает введение указанному субъекту множества поверхностно-модифицированных частиц; указанные поверхностно-модифицированные частицы содержат ядро частицы и покрытие, связанное с ядром частицы, в которых ядро частицы содержит активный агент (например, противовоспалительный агент), покрытие содержит опсонин (например, антитело, имеющее изотип IgG, или комплементный белок, такой как C3b или С5), поверхностно-модифицированная частица имеет средний размер приблизительно от 1 нм до 2000 нм, а указанное введение является эффективным для облегчения, лечения и/или профилактики симптомов или патологический состояний, связанных с указанным воспалительным заболеванием или расстройством.

Другой аспект изобретения относится к способу лечения субъекта, имеющего пролиферативное заболевание или расстройство, который предусматривает введение указанному субъекту множества поверхностно-модифицированных частиц; указанные поверхностно-модифицированные частицы содержат ядро частицы и покрытие, связанное с ядром частицы, в которых ядро частицы содержит активный агент (например, антипролиферативный агент, такой как антинеопластический агент), покрытие содержит опсонин (например, антитело, имеющее изотип IgG, или комплементный белок, такой как C3b или С5), поверхностно-модифицированная частица имеет средний размер приблизительно от 1 нм до 2000 нм, а указанное введение является эффективным для облегчения, лечения и/или профилактики симптомов или патологических состояний, связанных с указанным пролиферативным заболеванием или расстройством.

Другой аспект изобретения относится к способу лечения субъекта, имеющего инфекционное заболевание или расстройство, который предусматривает введение указанному субъекту множества поверхностно-модифицированных частиц; указанные поверхностно-модифицированные частицы содержат ядро частицы и покрытие, связанное с ядром частицы, в которых ядро частицы содержит активный агент (например, антиинфекционный агент), покрытие содержит опсонин (например, антитело, имеющее изотип IgG, или комплементный белок, такой как C3b или С5), поверхностно-модифицированная частица имеет средний размер приблизительно от 1 нм до 2000 нм, а указанное введение является эффективным для облегчения, лечения и/или профилактики симптомов или патологических состояний, связанных с указанным инфекционным заболеванием или расстройством.

Другой аспект изобретения относится к способу лечения субъекта, имеющего нейродегенеративное заболевание или расстройство, который предусматривает введение указанному субъекту множества поверхностно-модифицированных частиц; указанные поверхностно-модифицированные частицы содержат ядро частицы и покрытие, связанное с ядром частицы, в которых ядро частицы содержит активный агент (например, антинейродегенеративный агент), покрытие содержит опсонин (например, антитело, имеющее изотип IgG, или комплементный белок, такой как C3b или С5), поверхностно-модифицированная частица имеет средний размер приблизительно от 1 нм до 2000 нм, а указанное введение является эффективным для облегчения, лечения и/или профилактики симптомов или патологических состояний, связанных с указанным нейродегенеративным заболеванием или расстройством.

Краткое описание рисунков

Фиг. 1 представляет собой график, показывающий профиль элюирования суперпарамагнитных наночастиц (NP) оксида железа (SPIO) из колонки с сефарозой 4B-CL. Показаны SPIO NP, конъюгированные с IgG, после инкубации IgG с окисленным SPIO (закрашенные кружки); IgG, инкубированными с неокисленным SPIO (закрашенные квадратики); и окисленные SPIO, блокированные добавлением избыточного количества аминогрупп (незакрашенные кружки).

Фиг. 2 представляет собой график, показывающий измерения размеров (в нанометрах) и индекса полидисперсности IgG-SPIO в различные моменты времени после конъюгирования, при хранении при 4°С.

Фиг. 3 представляет собой график, показывающий поглощение SPIO и IgG-SPIO моноцитами по истечении различных периодов времени, по оценке с использованием колориметрического феррозинового анализа.

Фиг. 4 представляет собой график, показывающий поглощение SPIO и IgG-SPIO моноцитами по истечении различных периодов времени, по оценке с использованием измерения релаксации (R2) с помощью МРТ.

Фиг. 5 представляет собой график, показывающий поглощение SPIO и IgG-SPIO моноцитами и макрофагами при различных условиях. (А) показывает график поглощения частиц SPIO различных размеров (62 нм, 122 нм, 266 нм и 394 нм), присоединенных к декстрану 100 кДа, и частиц SPIO размеров 130-170 нм, присоединенных к декстрану 10 кДа. (В) показывает график поглощения моноцитами частиц IgG-SPIO, изготовленных с использованием растворов с различной концентрацией IgG. (С) показывает график поглощения моноцитами нативных SPIO, инкубированных со свободным IgG. (D) показывает график поглощения моноцитами частиц IgG-SPIO при 4°С и 37°С. (Е) показывает график поглощения моноцитами и полученными из моноцитов макрофагами (MDM) частиц IgG-SPIO. (F) показывает график поглощения моноцитами частиц IgG-SPIO, инкубированных совместно с избытком свободного IgG. (G) показывает график поглощения моноцитами частиц SPIO, конъюгированных с человеческим сывороточным альбумином (HAS). (Н) показывает график, изображающий поверхностный заряд частиц (дзета-потенциал) и размер частиц для нативных, конъюгированных с IgG и конъюгированных с HSA частиц SPIO.

Фиг. 6 представляет собой график, показывающий количественную оценку in vivo частиц SPIO и IgG-SPIO, с помощью МРТ картирования с использованием циклирования Т₂ фазы CPMG. (А) представляет собой график, показывающий изменения релаксивности (R₂=1/T₂) в селезенке после инъекции 12,5 мкг SPIO или IgG-SPIO в хвостовую вену мышей (n=6). (В) представляет собой график, показывающий изменения релаксивности (R₂=1/T₂) в селезенке после инъекции 62,5 мкг SPIO или IgG-SPIO в хвостовую вену мышей (n=5). (С) представляет собой график, показывающий изменения релаксивности (R₂=1/T₂) в печени после инъекции 12,5 мкг SPIO или IgG-SPIO в хвостовую вену мышей (n=6). (D) представляет собой график, показывающий изменения релаксивности (R₂=1/T₂) в печени после инъекции 62,5 мкг SPIO или IgG-SPIO в хвостовую вену мышей (n=6). (Е) представляет собой график, показывающий изменения релаксивности (R₂=1/T₂) в почке после инъекции 12,5 мкг SPIO или IgG-SPIO в хвостовую вену мышей (n=6). (F) представляет собой график, показывающий изменения релаксивности (R₂=1/T₂) в почке после инъекции 62,5 мкг SPIO или IgG-SPIO в хвостовую вену мышей (n=5).

Фиг. 7 представляет собой график, показывающий дзета-потенциал покрытых IgG частиц паклитаксела при различных соотношениях IgG и паклитаксела.

Фиг. 8 представляет собой график, показывающий дзета-потенциал покрытых IgG частиц ритонавира при различных соотношениях IgG и ритонавира.

Фиг. 9 представляет собой график, показывающий поглощение частиц паклитаксела без покрытия, меченных с использованием Oregon Green (без покрытия), покрытых IgG частиц паклитаксела, меченных с использованием Oregon Green (IgG), и покрытых протамином частиц паклитаксела, меченных с использованием Oregon Green (протамин).

Фиг. 10 представляет собой график, показывающий поглощение частиц паклитаксела без покрытия (без покрытия), покрытых IgG частиц паклитаксела, меченных с использованием Oregon Green (IgG), и покрытых протамином частиц паклитаксела, меченных с использованием Oregon Green (протамин).

Фиг. 11 представляет собой график, показывающий поглощение частиц паклитаксела без покрытия, меченных с использованием Oregon Green (без покрытия) и покрытых IgG частиц паклитаксела, меченных с использованием Oregon Green (IgG).

Подробное описание

Заявленное изобретение допускает варианты осуществления во многих различных формах. Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, описанные в настоящем документе, следует рассматривать как примеры принципов заявленного изобретения, которые, таким образом, не предназначены для ограничения широких аспектов заявленного изобретения описанными вариантами осуществления.

Один аспект изобретения относится к поверхностно-модифицированной частице, содержащей ядро частицы и покрытие, связанное с ядром частицы. Ядро частицы содержит активный агент, покрытие содержит опсонин (например, антитело, имеющее изотип IgG, или комплементный белок, такой как C3b или С5), и поверхностно-модифицированная частица имеет средний размер приблизительно от 1 нм до 2000 нм. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения частицы, имеющие покрытия, содержащие комплементные белки, можно использовать в комбинации с веществами, способными ослаблять эффекты высвобождения гистамина, которое может быть вызвано активированными комплементными белками.

Другой аспект изобретения относится к способу усиления поглощения активного агента фагоцитарными или нефагоцитарными клетками посредством воздействия на клетки поверхностно-модифицированной частицей, содержащей ядро частицы и покрытие, связанное с ядром частицы. Ядро частицы содержит активный агент, покрытие содержит опсонин (например, антитело, имеющее изотип IgG, или комплементный белок, такой как C3b или С5), и поверхностно-модифицированная частица имеет средний размер приблизительно от 1 нм до 2000 нм. Усиленное поглощение клетками активного агента наблюдается по сравнению с клетками, которые контактировали с частицами, не имеющими покрытия, содержащего опсонин.

Еще один аспект изобретения относится также к способам доставки поверхностно-модифицированной частицы с ткани-мишени млекопитающего субъекта посредством клеточного транспорта. Используемый в настоящем документе термин «ткань-мишень» или «тканевая мишень» относится к конкретной ткани млекопитающего, которое подвергается лечению. Примеры указанных тканей-мишеней предусматривают, без ограничения, головной мозг и другие отделы центральной нервной системы, лимфатическую систему, печень и любое место инфекции, воспаления или опухоли.

Например, в одном аспекте изобретение предполагает способы и композиции для лечения субъекта, имеющего воспалительное заболевание или расстройство, предусматривающие введение указанному субъекту множества поверхностно-модифицированных частиц; указанные поверхностно-модифицированные частицы содержат ядро частицы и покрытие, связанное с ядром частицы, в которых ядро частицы содержит активный агент, покрытие содержит опсонин (например, антитело, имеющее изотип IgG, или комплементный белок, такой как C3b или С5), поверхностно-модифицированная частица имеет средний размер приблизительно от 1 нм до 2000 нм, а указанное введение является эффективным для облегчения, лечения и/или профилактики симптомов или патологических состояний, связанных с указанным воспалительным заболеванием или расстройством. В одном аспекте активный агент представляет собой противовоспалительный агент.

В другом аспекте изобретение предполагает способы и композиции для лечения субъекта, имеющего нейродегенеративное заболевание или расстройство, предусматривающие введение указанному субъекту множества поверхностно-модифицированных частиц; указанные поверхностно-модифицированные частицы содержат ядро частицы и покрытие, связанное с ядром частицы, в которых ядро частицы содержит активный агент, покрытие содержит опсонин (например, антитело, имеющее изотип IgG, или комплементный белок, такой как C3b или С5), поверхностно-модифицированная частица имеет средний размер приблизительно от 1 нм до 2000 нм, а указанное введение является эффективным для облегчения, лечения и/или профилактики симптомов или патологических состояний, связанных с указанным нейродегенеративным заболеванием или расстройством. В одном аспекте активный агент представляет собой антинейродегенеративный агент.

В еще одном аспекте изобретение предполагает способы и композиции для лечения субъекта, имеющего пролиферативное заболевание или расстройство, предусматривающие введение указанному субъекту множества поверхностно-модифицированных частиц; указанные поверхностно-модифицированные частицы содержат ядро частицы и покрытие, связанное с ядром частицы, в которых ядро частицы содержит активный агент, покрытие содержит опсонин (например, антитело, имеющее изотип IgG, или комплементный белок, такой как C3b или С5), поверхностно-модифицированная частица имеет средний размер приблизительно от 1 нм до 2000 нм, а указанное введение является эффективным для облегчения, лечения и/или профилактики симптомов или патологических состояний, связанных с указанным пролиферативным заболеванием или расстройством. В одном аспекте активный агент представляет собой антипролиферативный агент, такой как антинеопластический агент.

В еще одном аспекте изобретение предполагает способы и композиции для лечения субъекта, имеющего инфекционное заболевание или расстройство, предусматривающие введение указанному субъекту множества поверхностно-модифицированных частиц; указанные поверхностно-модифицированные частицы содержат ядро частицы и покрытие, связанное с ядром частицы, в которых ядро частицы содержит активный агент, покрытие содержит опсонин (например, антитело, имеющее изотип IgG, или комплементный белок, такой как C3b или С5), поверхностно-модифицированная частица имеет средний размер приблизительно от 1 нм до 2000 нм, а указанное введение является эффективным для облегчения, лечения и/или профилактики симптомов или патологических состояний, связанных с указанным инфекционным заболеванием или расстройством. В одном аспекте активный агент представляет собой антиинфекционный агент, такой как противогрибковый агент, противовирусный агент, антибактериальный агент или антипаразитарный агент.

Таким образом, способы введения, описанные в настоящем документе, предполагают введение терапевтически эффективного количества указанных поверхностно-модифицированных частиц. Используемый в настоящем документе термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству частиц с покрытием, которое достаточно для облегчения, улучшения, устранения, лечения и/или профилактики симптомов или патологических состояний, связанных с заболеванием или расстройством, предполагаемым для лечения в соответствии со способами лечения, описанными в настоящем документе.

Используемый в настоящем документе термин «опсонин» относится к белкам или пептидам, которые связываются с частицами или клетками, повышая, таким образом, чувствительность указанной частицы или клетки к фагоцитозу. Фрагменты известных опсонинов, обладающих биологической активностью, сравнимой с соответствующим опсонином полной длины, считаются опсонинами, как это используется в настоящем документе. Например, фрагменты IgG обычно содержат фрагмент, достаточный для связывания с фагоцитом. Указанные фрагменты могут также содержать гидрофобные части, достаточные для нековалентного связывания с поверхностью гидрофобной частицы, как описано в настоящем документе. Подходящие фрагменты IgG содержат, например, фрагменты IgG-Fab и фрагменты IgG-Fc. Подобно этому, миметики опсонинов также считаются опсонинами, как это используется в настоящем документе. Используемый в настоящем документе термин «миметики опсонинов» относится к соединениям (включая пептиды), обладающим биологической активностью, сравнимой с опсонином, и к соединениям, которые имитируют активность опсонина. Специалист может легко определить, является ли соединение миметиком опсонинов в том, что касается известной биологической активности опсонина.

Следующее описание поверхностно-модифицированной частицы обычно используется во всех вариантах осуществления настоящего изобретения, описанных в настоящем документе. Активный агент поверхностно-модифицированной частицы может быть плохо растворимым в воде или водорастворимым. Активный агент может представляет собой терапевтический агент или диагностический агент. Активные агенты, используемые в соответствии с композициями и способами, описанными в настоящем документе, демонстрируют фармацевтическую активность, обычно присущую указанным активным агентам, даже если активные агенты захватываются и впоследствии доставляются фагоцитарными или нефагоцитарными клетками.

Активный агент может быть выбран из ряда известных фармацевтических соединений, таких как, без ограничения, анальгетики, анестетики, аналептики, адренергические агенты, адреноблокаторы, адренолитики, адренокортикоиды, адреномиметики, антихолинергические агенты, антихолинэстеразные агенты, противосудорожные агенты, алкилирующие агенты, алкалоиды, аллостерические ингибиторы, анаболические стероиды, анорексианты, антациды, агенты против диареи, антидоты, жаропонижающие агенты, противоревматические агенты, психотерапевтические агенты, нейроблокирующие агенты, противовоспалительные агенты, противоглистные агенты, антикоагулянты, антидепрессанты, противоэпилептические агенты, антиинфекционные агенты (например, противогрибковые агенты, противовирусные агенты, такие как антиретровирусные агенты, и антибиотики), антигистаминные агенты, антимускариновые агенты, антимикобактериальные агенты, антинеопластические агенты, антипротозойные агенты, анксиолитические седативные агенты, бета-адреноблокаторы, кортикостероиды, агенты, подавляющие кашель, дофаминергические агенты, гемостатики, гематологические агенты, снотворные, иммунологические агенты, мускариновые агенты, парасимпатомиметики, простагландины, радиофармацевтические агенты, седатирующие агенты, стимуляторы, симпатомиметики, витамины, ксантины, факторы роста, гормоны и антиприонные агенты.

Примеры антинеопластических агентов включают в себя, без ограничения, пакситаксел, производные пакситаксела, алкалоиды, антиметаболиты, ингибиторы ферментов, алкилирующие агенты и их комбинации.

Активный агент может также представлять собой ингибитор протеаз, такой как ингибитор ВИЧ-протеазы. Примеры ингибиторов протеаз включают в себя, без ограничения, индинавир, ритонавир, саквинавир, нелфинавир и их комбинации.

Активный агент может представлять собой нуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы. Примеры нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы включают в себя, без ограничения, зидовудин, диданозин, ставудин, зальцитабин, ламивудин и их комбинации.

Активный агент может представлять собой ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы. Примеры ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы включают в себя, без ограничения, эфавиренц, невирапин, делавирадин и их комбинации.

Примеры противовоспалительных агентов включают в себя, без ограничения, нестероидные противовоспалительные агенты, неселективные ингибиторы циклооксигеназы (СОХ), ингибиторы СОХ-1, ингибиторы СОХ-2, ингибиторы липоксигеназы, кортикостероиды, антиоксиданты, ингибиторы фактора некроза опухолей (TNF) и их комбинации. Примеры ингибиторов СОХ-2 включают в себя, без ограничения, целекоксиб, рофекоксиб, вальдекоксиб, парекоксиб, лумиракоксиб, эторикоксиб и их комбинации.

Диагностические агенты включают в себя рентгенологические агенты и контрастные среды. Примеры рентгенологических агентов включают в себя WIN-8883 (этил 3,5-диацетамидо-2,4,6-трийодобензоат), также известный как этиловый эфир диатразоевой кислоты (EEDA), WIN 67722, т.е., (6-этокси-6-оксогексил-3,5-бис(ацетамидо)-2,4,6-трийодобензоат; этил-2-(3,5-бис(ацетамидо)-2,4,6-трийодобензоилокси)бутират (WIN 16318); этил диатризоксиацетат (WIN 12901); этил-2-(3,5-бис(ацетамидо)-2,4,6-трийодобензоилокси)пропионат (WIN 16923); N-этил 2-(3,5-бис(ацетамидо)-2,4,6-трийодобензоилокси ацетамид (WIN 65312); изопропил 2-(3,5-бис(ацетамидо)-2,4,6-трийодобензоилокси) ацетамид (WIN 12855); диэтил 2-(3,5-бис(ацетамидо)-2,4,6-трийодобензоилокси) малонат (WIN 67721); этил-2-(3,5-бис(ацетамидо)-2,4,6-трийодобензоилокси) фенилацетат (WIN 67585); [[3,5-бис(ацетиламино)-2,4,5-трийодобензоил]окси]бис(1-метил) эфир пропандиоевой кислоты (WIN 68165) и 3,5-бис(ацетиламино)-2,4,6-трийодо-4-(этил-3-этокси-2-бутеноат) эфир бензойной кислоты (WIN 68209). Контрастные агенты включают в себя такие агенты, от которых ожидают относительно быстрого разложения в физиологических условиях, что сводит к минимуму любые воспалительные реакции, связанные с частицами. Разложение может происходить в результате ферментативного гидролиза, солюбилизации карбоновых кислот при физиологических значениях рН или в результате других механизмов. Таким образом, включены плохо растворимые йодированные карбоновые кислоты, такие как йодипамид, диатризоевая кислота и метризоевая кислота, а также гидролитически лабильные йодированные виды, такие как WIN 67721, WIN 12901, WIN 68165 и WIN 68209.

Другие контрастные среды включают в себя, без ограничения, состоящие из частиц препараты веществ для магнитно-резонансной томографии, такие как хелаты гадолиния или другие парамагнитные контрастные агенты. Примерами указанных соединений являются гадопентетат димеглумина (MAGNEVIST®) и гадотеридол (PROHANCE®).

Описание классов терапевтических агентов и диагностических агентов и перечень видов в каждом классе можно найти в Martindale, The Extra Pharmacopoeia, 31-е издание, The Pharmaceutical Press, Лондон, 1996 г., включенном в настоящий документ в качестве ссылки и составляющим его часть. Перечисленные терапевтические агенты и диагностические агенты имеются в продаже и/или их можно изготовить с использованием известных методик.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения активный агент представляет собой плохо растворимое в воде соединение. Под «плохой растворимостью в воде» подразумевается растворимость соединения в воде менее приблизительно 10 мг/мл, и, предпочтительно, менее приблизительно 1 мг/мл. Указанные плохо растворимые в воде соединения являются особенно подходящими для водных суспензионных препаратов, поскольку существует ограниченное количество альтернатив помещения указанных соединений в водную среду. Преимущественно, опсонины, такие как IgG, которые обеспечивают покрытия по настоящему изобретению, могут адсорбироваться на поверхности частиц, включая указанные плохо растворимые в воде активные агенты, для формирования на них практически однородного покрытия. Например, гидрофобные хвостовые части опсонинов, таких как IgG, способны связываться с гидрофобными областями на поверхности частицы. Помимо этого, опсонины, такие как IgG, имеют положительный заряд, в случаях, когда рН ниже изоэлектрической точки для опсонина, и, таким образом, сильное электростатическое взаимодействие между опсонином и гидрофобной частицей (которая может иметь отрицательный заряд) может стабилизировать покрытие, содержащее опсониновый белок. Альтернативно, опсонины, такие как IgG, имеют отрицательный заряд, в случаях, когда рН выше изоэлектрической точки для опсонина, и, таким образом, сильное электростатическое взаимодействие между опсонином и гидрофобной частицей (которая также может иметь положительный заряд) может стабилизировать покрытие, содержащее опсониновый белок. В одном предпочтительном аспекте плохо растворимый в воде активный агент представляет собой органическое соединение, имеющее молекулярную массу менее 2500 граммов/моль, менее 2000 граммов/моль, и, наиболее типично, менее 1000 граммов/моль, например, от 200 граммов/моль до 900 граммов/моль. Указанные органические соединения иногда называют «малыми молекулами».

Альтернативно, на практике в настоящем изобретении можно использовать водорастворимые соединения. Указанные водорастворимые активные соединения можно заключать в твердый матрикс-носитель (например, сополимер полилактат-полигликолят, альбумин, крахмал) или инкапсулировать в пузырек, который является практически непроницаемым для активного агента. Указанный инкапсулирующий пузырек может представлять собой полимерное покрытие, такое как полиакрилат. Кроме того, маленькие частицы, изготовленные из указанных водорастворимых соединений, можно модифицировать, чтобы улучшить химическую стабильность и контролировать фармакокинетические свойства соединений путем контролирования высвобождения соединений из частиц. Примеры водорастворимых соединений включают в себя, без ограничения, простые органические соединения, белки, пептиды, нуклеотиды, олигонуклеотиды и углеводы.

Следующее описание частиц также используется во всех вариантах осуществления настоящего изобретения, изложенных в настоящем документе. Частицы могут быть аморфными, полукристаллическими, кристаллическими или представлять собой их комбинацию, как определяется с использованием подходящих аналитических методик, таких как дифференциальная сканирующая калориметрия (DSC) или рентгеновская дифракция. Перед введением частицы можно гомогенизировать с использованием процесса гомогенизации. Частицы можно также гомогенизировать с использованием процесса микропреципитации/гомогенизации.

Частицы с покрытием обычно имеют средний действительный размер приблизительно от 1 нм до 2 мкм (или 2000 нанометров), по измерению динамическими методами рассеяния света (например, фотокорреляционная спектроскопия, лазерная дифракция, малоугловая лазерная фотометрия светорассеяния (LALLS), среднеугловая лазерная фотометрия светорассеяния (MALLS)), методами light obscuration (например, методом Коултера), реологическими методами или микроскопией (световой или электронной). Предпочтительный средний действительный размер частиц зависит от таких факторов, как планируемый путь введения, композиция, растворимость, токсичность и биодоступность соединения. Другие подходящие размеры частиц содержат, без ограничения, приблизительно от 10 нм до 1 мкм, приблизительно от 50 нм до 500 нм и/или приблизительно от 100 нм до 250 нм.

Изготовление ядра частицы

Процессы изготовления частиц, используемых в настоящем изобретении, можно осуществлять с использованием множества методик. Далее приводится репрезентативное, но не исчерпывающее, обсуждение методик изготовления частиц.

I. Методики приложения энергии для формирования дисперсий малых частиц

В целом, способ изготовления дисперсий малых частиц с использованием методики приложения энергии предусматривает этап добавления в форме массы активного агента или фармацевтически активного соединения, которое иногда будет называться лекарственным средством, к подходящему носителю, такому как вода или водный раствор, обычно содержащий одно или более поверхностно-активных веществ, перечисленных ниже, или другая жидкость, в которой фармацевтическое соединение не растворяется значительным образом, с получением первой суспензии, которая будет называться далее пресуспензией. Энергию прикладывают к пресуспензии для получения дисперсии частиц, которая является физически более стабильной, чем пресуспензия. Энергию прикладывают путем механического измельчения (например, с использованием бисерной мельницы, шаровой мельницы, молотковой мельницы, мельницы с использованием энергии жидкости, струйной мельницы или мокрого измельчения). Указанные технологии описаны в патенте США № 5145684, который включен в настоящий документ в качестве ссылки и составляет его часть.

Методики приложения энергии также включают в себя воздействие на пресуспензию условиями высокого усилия сдвига, включая кавитацию, усилие сдвига или ударную силу, с использованием микрофлюидизатора. Настоящее изобретение также использует приложение энергии к пресуспензии с использованием пистонного гомогенизатора или противоточного гомогенизатора, которые описаны в патенте США № 5091188, который включен в настоящий документ в качестве ссылки и составляет его часть. Подходящие пистонные гомогенизаторы имеются в продаже под торговыми наименованиями EMULSIFLEX™ (Avestin) и FRENCH® Pressure Cell (Thermo Spectronic). Подходящие микрофлюидизаторы можно приобрести у компании Microfluidics Corp.

Этап приложения энергии также можно осуществлять с использованием ультразвуковых технологий. Этап ультразвуковой обработки можно осуществлять с использованием любого подходящего ультразвукового устройства. Подходящие устройства включают в себя Branson модель S-450A и Cole-Parmer модель 500/750 ватт. Указанные устройства хорошо известны в промышленности. Обычно ультразвуковые устройства имеют ультразвуковой щуп или зонд, который погружают в пресуспензию для испускания ультразвуковой энергии в раствор. Ультразвуковое устройство в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения действует на частоте приблизительно от 1 кГц до 90 кГц, и, более предпочтительно, приблизительно от 2 кГц до 40 кГц или в любых пределах или комбинациях указанных пределов. Размеры зонда могут варьировать и предпочтительно имеют определенный размер, такой как Ѕ дюйма или ј дюйма или т.п.

Дисперсию малых частиц можно стерилизовать перед введением. Стерилизацию можно осуществлять нагреванием, гамма-излучением, фильтрованием (как непосредственно, в виде дисперсии с размером частиц менее 200 нм, так и стерильным фильтрованием растворов, использованных в процессе преципитации, до формирования дисперсии твердого вещества) и приложением очень высокого давления (более 2000 атмосфер) или комбинацией высокого давления и повышенной температуры.

II. Способы преципитации для изготовления дисперсий частиц субмикронных размеров

Дисперсии малых частиц можно также изготавливать с использованием методик преципитации. Далее описаны примеры методик преципитации.

Способы микропреципитации. Один пример способа микропреципитации описан в патенте США № 5780062, который включен в настоящий документ в качестве ссылки и составляет его часть. Патент 5780062 описывает способ преципитации органических соединений, предусматривающий: (i) растворение органического соединения в смешивающемся с водой первом растворителе; (ii) изготовление раствора полимера и амфифильного соединения в водном втором растворителе (в указанном втором растворителе органическое соединение является практически нерастворимым), благодаря чему образуется комплекс полимер/амфифильное соединение; и (iii) смешивание растворов с этапов (i) и (ii), чтобы вызвать преципитацию агрегата органического соединения и комплекса полимер/амфифильное соединение.

Другие подходящие способы преципитации описаны в патентах США №№ 6607784, 7037528, 6869617, 6884436, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки и составляют его часть. Описанные способы предусматривающие этапы: (1) растворение органического соединения в смешивающемся с водой первом органическом растворителе для получения первого раствора; (2) смешивание первого раствора со вторым растворителем или водой для осаждения органического соединения, с получением пресуспензии; и (3) приложение энергии к пресуспензии в форме перемешивания с высоким усилием сдвига, с получением дисперсии малых частиц. Необязательно, первый органический растворитель удаляют из смеси с использованием любых подходящих средств, таких как способы центрифугирования или фильтрования. Помимо этого, непрерывную фазу дисперсии можно, необязательно, заменить другой непрерывной фазой посредством удаления первой непрерывной фазы с использованием таких способов как центрифугирование и фильтрование, и добавления второй непрерывной фазы и последующего редиспергирования твердого материала во второй непрерывной фазе. Одно или более поверхностно-активных агентов, перечисленных ниже, можно добавлять в первый органический растворитель или второй водный раствор.

Эмульсионные способы преципитации. Одна подходящая эмульсионная методика преципитации описана в патентной публикации США № 2005/0037083, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки и составляет его часть. При указанном подходе способ предусматривает этапы: (1) изготовление мультифазной системы, имеющей органическую фазу и водную фазу; органическая фаза включает в себя фармацевтически активное соединение; и (2) воздействие на систему ультразвуком для выпаривания части органической фазы, чтобы вызвать преципитацию соединения в водной фазе с образованием дисперсии малых частиц. Этап изготовления мультифазной системы включает в себя этапы: (1) смешивание не смешивающегося с водой растворителя с фармацевтически активным соединением с получением органического раствора, (2) изготовление раствора на водной основе с одним или более поверхностно-активных соединений и (3) смешивание органического раствора с водным раствором с получением мультифазной системы. Этап смешивания органической фазы и водной фазы может включать в себя использование пистонных гомогенизаторов, коллоидных мельниц, высокоскоростного перемешивающего оборудования, экструзионного оборудования, оборудования для ручного перемешивания или встряхивания, микрофлюидизатора или другого оборудования или технологии для создания условий высокого усилия сдвига. Необработанная эмульсия будет содержать масляные капли в воде размером приблизительно менее 1 мкм в диаметре. На необработанную эмульсию воздействуют ультразвуком с получением микроэмульсии и, в конечном итоге, получают дисперсию малых частиц.

Эмульсионные способы преципитации. Одна подходящая эмульсионная методика преципитации описана в патентной публикации США № 2005/0037083, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки и составляет его часть. При указанном подходе способ предусматривает этапы: (1) изготовление мультифазной системы, имеющей органическую фазу и водную фазу; органическая фаза включает в себя фармацевтически активное соединение; и (2) воздействие на систему ультразвуком для выпаривания части органической фазы, чтобы вызвать преципитацию соединения в водной фазе с образованием дисперсии малых частиц. Этап изготовления мультифазной системы включает в себя этапы: (1) смешивание не смешивающегося с водой растворителя с фармацевтически активным соединением с получением органического раствора, (2) изготовление раствора на водной основе с одним или более поверхностно-активных соединений и (3) смешивание органического раствора с водным раствором с получением мультифазной системы. Этап смешивания органической фазы и водной фазы может включать в себя использование пистонных гомогенизаторов, коллоидных мельниц, высокоскоростного перемешивающего оборудования, экструзионного оборудования, оборудования для ручного перемешивания или встряхивания, микрофлюидизатора или другого оборудования или технологии для создания условий высокого усилия сдвига. Необработанная эмульсия будет содержать масляные капли в воде размером приблизительно менее 1 мкм в диаметре. На необработанную эмульсию воздействуют ультразвуком с получением микроэмульсии и, в конечном итоге, получают дисперсию малых частиц.

Другой подход к получению дисперсии малых частиц описан в патенте США № 6835396, который включен в настоящий документ в качестве ссылки и составляет его часть. Способ предусматривает этапы: (1) изготовление необработанной дисперсии мультифазной системы, имеющей органическую фазу и водную фазу; органическая фаза включает в себя фармацевтически активное соединение; (2) приложение энергии к необработанной дисперсии с получением тонкой дисперсии; (3) замораживание тонкой дисперсии и (4) лиофильная сушка тонкой дисперсии с получением малых частиц фармацевтического соединения. Малые частицы можно стерилизовать с использованием методик, перечисленных ниже, или малые частицы можно повторно растворять в водной среде и стерилизовать.

Этап изготовления мультифазной системы включает в себя этапы: (1) смешивание не смешивающегося с водой растворителя с фармацевтически эффективным соединением с получением органического раствора, (2) изготовление раствора на водной основе с одним или более поверхностно-активных соединений и (3) смешивание органического раствора с водным раствором с получением мультифазной системы. Этап смешивания органической фазы и водной фазы включает в себя использование пистонных гомогенизаторов, коллоидных мельниц, высокоскоростного перемешивающего оборудования, экструзионного оборудования, оборудования для ручного перемешивания или встряхивания, микрофлюидизатора или другого оборудования или технологии для создания условий высокого усилия сдвига.

Преципитация с использованием методики растворителя-антирастворителя. Дисперсии малых частиц также можно изготавливать с использованием методики растворителя-антирастворителя, описанной Fessi et al. в патенте США № 5118528 и Leclef et al. в патенте США № 5100591, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки и составляют его часть. Оба способа предусматривают этапы: (1) изготовление жидкой фазы биологически активного вещества в растворителе или в смеси растворителей, к которой можно добавлять один или более поверхностно-активных агентов; (2) изготовление второй жидкой фазы нерастворителя или смеси нерастворителей, причем нерастворитель является смешивающимся с растворителем или смесью растворителей для вещества; (3) объединение растворов (1) и (2) при перемешивании и (4) удаление нежелательных растворителей с получением дисперсии малых частиц. Указанные способы отличаются от способов, описанных выше в разделе «Способы микропреципитации», тем, что они не имеют последнего этапа приложения энергии к суспензии в форме перемешивания в условиях высокого усилия сдвига или нагревания.

Преципитация с использованием инверсии фазы. Дисперсии малых частиц можно получать с помощью преципитации с использованием инверсии фазы, как описано в патентах США №№ 6235224, 6143211 и 6616869, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки и составляют его часть. Инверсия фазы представляет собой термин, используемый для описания физических феноменов, посредством которых полимер, растворенный в непрерывной фазе системы растворителей, превращается в твердую макромолекулярную сеть, в которой полимер представляет собой непрерывную фазу. Один способ индуцировать инверсию фазы заключается в добавлении нерастворителя к непрерывной фазе. Полимер претерпевает переход от однофазной системы к нестабильной двухфазной смеси: фракциям с высоким и низким содержанием полимера. Мицеллярные капли нерастворителя в фазе с высоким содержанием полимера служат центрами зародышеобразования и покрываются полимером. Патент № 6235224 говорит о том, что инверсия фазы полимерных растворов при определенных условиях может приводить к спонтанному образованию дискретных микрочастиц, включая наночастицы. Патент № 6235224 описывает растворение или диспергирование полимера в растворителе. Фармацевтический агент также растворяется или диспергируется в растворителе. Для того, чтобы этап затравки кристаллообразования был эффективным в указанном процессе, желательно, чтобы агент был растворен в растворителе. Полимер, агент и растворитель образуют смесь, имеющую непрерывную фазу, в которой непрерывной фазой является растворитель. Смесь затем добавляют в по меньшей мере в десятикратный избыток смешивающегося нерастворителя, чтобы вызвать спонтанное образование микроинкапсулированных микрочастиц агента, имеющих средний размер от 10 нм до 10 мкм. На размер частиц влияет соотношение растворитель:нерастворитель, концентрация полимера, вязкость раствора полимер-растворитель, молекулярная масса полимера и характеристики пары растворитель-нерастворитель.

Преципитация с использованием сдвига рН. Дисперсии малых частиц можно получать с помощью методик преципитации с использованием сдвига рН. Указанные методики обычно включают в себя этап растворения лекарственного средства в растворителе, имеющем величину рН, при которой лекарственное средство является растворимым, с последующим этапом изменения рН до величины, при которой лекарственное средство более не является растворимым. Величина рН может быть кислой или основной, в зависимости от конкретного фармацевтического соединения. Раствор затем нейтрализуют с получением дисперсии малых частиц. Один подходящий способ преципитации с использованием сдвига рН описан в патенте США № 5665331, который включен в настоящий документ в качестве ссылки и составляет его часть. Способ предусматривает этап растворения фармацевтического агента вместе с модификатором роста кристаллов (CGM) в щелочном растворе, а затем нейтрализацию раствора кислотой в присутствии подходящего модифицирующего поверхность поверхностно-активного агента или агентов, с получением дисперсии малых частиц фармацевтического агента. За этапом преципитации могут следовать этапы диафильтрационной очистки дисперсии, а затем доведения концентрации дисперсии до желаемого уровня.

Другие примеры способов преципитации с использованием сдвига рН описаны в патентах США №№ 5716642, 5662883, 5560932 и 4608278, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки и составляют его часть.

Инфузионный способ преципитации. Подходящие инфузионные методики преципитации для получения дисперсий малых частиц описаны в патентах США №№ 4997454 и 4826689, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки и составляют его часть. Сначала подходящее твердое соединение растворяют в подходящем органическом растворителе с получением смеси растворителя. Затем осаждающий нерастворитель, смешивающийся с органическим растворителем, вливают в смесь растворителя при температуре приблизительно от -10°С до 100°С и скорости вливания приблизительно от 0,01 мл в минуту до 1000 мл в минуту на объем 50 мл, для получения суспензии осажденных неагрегированных твердых частиц соединения с подходящим однородным средним диаметром менее 10 мкм. Предпочтительно смешивание (например, путем перемешивания) раствора, в который вливают осаждающий нерастворитель. Нерастворитель может содержать поверхностно-активный агент для стабилизации частиц против агрегации. Частицы затем отделяют от растворителя. В зависимости от твердого соединения и желаемого размера частиц, параметры температуры, соотношение нерастворителя и растворителя, скорость инфузии, скорость перемешивания и объем можно варьировать в соответствии с настоящим изобретением. Размер частиц является пропорциональным соотношению объемов нерастворитель:растворитель и температуре инфузии и является обратно пропорциональным скорости инфузии и скорости перемешивания. Осаждающий нерастворитель может быть водным и неводным, в зависимости от относительной растворимости соединения и желательного суспендирующего носителя.

Преципитация с использованием температурного сдвига. Методики преципитации с использованием температурного сдвига также можно использовать для получения дисперсий малых частиц. Указанная методика описана в патенте США № 5188837, который включен в настоящий документ в качестве ссылки и составляет его часть. В одном варианте осуществления указанного изобретения изготавливают липосферы с использованием следующих этапов: (1) расплавление или растворение вещества, такого как лекарственное средство, которое предполагается доставить, в расплавленный носитель, с образованием жидкости из вещества, которое предполагается доставить; (2) добавление фосфолипида совместно с водной средой к расплавленному веществу или носителю при температуре, превышающей температуру плавления вещества или носителя; (3) смешивание суспензии при температуре, превышающей температуру плавления носителя, до получения гомогенного тонкого препарата и затем (4) быстрое охлаждение препарата до комнатной температуры или ниже.

Преципитация с использованием выпаривания растворителя. Методика преципитации с использованием выпаривания растворителя описана в патенте США № 4973465, который включен в настоящий документ в качестве ссылки и составляет его часть. Патент № 4973465 описывает способы изготовления микрокристаллов, предусматиривающие этапы: (1) обеспечение раствора фармацевтической композиции и фосфолипида, растворенных в распространенном органическом растворителе или комбинации растворителей; (2) выпаривание растворителя или растворителей и (3) суспендирование пленки, полученной выпариванием растворителя или растворителей, в водном растворе путем интенсивного перемешивания, с получением дисперсии малых частиц. Растворитель можно удалять выпариванием достаточного количества растворителя, чтобы вызвать преципитацию соединения. Растворитель можно удалять также с использованием других хорошо известных методик, таких как применение вакуума к раствору или продувание азота через раствор.

Реакционная преципитация. Реакционная преципитация включает в себя этапы растворения фармацевтического соединения и, необязательно, других наполнителей, в подходящем растворителе для получения раствора. Соединение можно добавлять в количестве, равном или менее точки насыщения соединения в растворителе. Соединение или любой из наполнителей осаждают из раствора путем взаимодействия с химическим агентом или путем модификации в ответ на приложение энергии, такой как тепло или УФ свет, или т.п., таким образом, что модифицированное соединение имеет более низкую растворимость в растворителе и осаждается из раствора с образованием дисперсии малых частиц. Преципитация наполнителя создает твердый матрикс, в котором сорбируется лекарственное средство.

Преципитация с использованием сжатой жидкости. Подходящая методика преципитации с использованием сжатой жидкости описана в WO 97/14407. Johnston, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки и составляет его часть. Способ предусматривает этапы растворения нерастворимого в воде лекарственного средства в растворителе с получением раствора. Раствор затем распыляют в сжатую жидкость, которая может представлять собой газ, жидкость или сверхкритическую жидкость. Добавление сверхкритической жидкости к раствору соединения в растворителе вызывает приобретение соединением или приближение соединения к сверхнасыщенному состоянию и осаждению его в виде мелких частиц. В данном случае сжатая жидкость действует как антирастворитель, который понижает плотность энергии сцепления растворителя, в котором растворено лекарственное средство.

Альтернативно, лекарственное средство можно растворять в сжатой жидкости, которую затем распыляют в водную фазу. Быстрое расширение сжатой жидкости уменьшает растворяющую способность жидкости, что, в свою очередь, вызывает преципитацию растворенного соединения в виде малых частиц в водной фазе. В данном случае сжатая жидкость действует как растворитель.

Для того, чтобы стабилизировать частицы против агрегации, в данную методику включен модификатор поверхности, такой как поверхностно-активный агент.

Распыление в криогенные жидкости. Подходящая методика преципитации с использованием сжатой жидкости описана Williams et al. в патентной публикации США № 2004/0022861, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки и составляет его часть. Способ предусматривает систему и способ получения малых частиц, в которых активный ингредиент смешивают с водой, одним или более растворителей или их комбинацией, а полученную смесь распыляют на поверхность или под поверхность криогенной жидкости. Таким образом получают замороженные частицы. Также можно добавлять материалы для инкапсуляции твердых частиц, чтобы получать замороженные частицы, в которых инкапсулирующий агент окружает активный агент.

Преципитация с использованием белковых наносфер/микросфер. Частицы, используемые в настоящем изобретении, также можно изготавливать с использованием процесса, включающего в себя смешивание или растворение макромолекул, таких как белки, в водорастворимом полимере. Данный процесс описан в патентах США №№ 5849884, 5981719, 6090925, 6268053, 6458387 и в патентной публикации США № 2004/0043077, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки и составляют его часть. В одном варианте осуществления настоящего изобретения частицы изготавливают смешиванием макромолекулы в растворе с полимером или смесью полимеров в растворе при величине рН, близкой к изоэлектрической точке макромолекулы. Смесь инкубируют в присутствии источника энергии, такого как тепло, излучение или ионизация, в течение определенного периода времени. Полученные частицы можно отделять от любых не инкорпорированных компонентов, присутствующих в растворе физическими способами сепарации.

Существуют многочисленные другие подходящие методики изготовления дисперсий малых частиц, пригодных для использования в настоящем изобретении.

III. Дополнительные способы изготовления дисперсий частиц фармацевтических композиций

Следующие дополнительные способы изготовления частиц фармацевтических композиций (т.е., активного агента или органического соединения), используемых в настоящем изобретении, можно разделить на четыре основные категории. Каждая из категорий способа предусматривает общие для всех категорий этапы: (1) растворение органического соединения в смешивающемся с водой первом растворителе для получения первого раствора, (2) смешивание первого раствора со вторым растворителем воды для осаждения органического соединения с получением пресуспензии и (3) приложение энергии к пресуспензии в форме смешивания в условиях высокого усилия сдвига или тепла или их комбинации, с получением стабильной формы органического соединения, имеющей желательные размеры, определенные выше. Этапы смешивания и этап приложения энергии можно осуществлять последовательно или одновременно.

Категории способов отличаются друг от друга на основе физических свойств органического соединения, определенных с использованием рентгеновской дифракции, дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) или других подходящих исследований, проведенных до этапа приложения энергии и после этапа приложения энергии. В первой категории способов, до этапа приложения энергии органическое соединение в пресуспензии принимает аморфную форму, полукристаллическую форму или форму сверхохлажденной жидкости и имеет средний действительный размер частиц. После этапа приложения энергии органическое соединение находится в кристаллической форме, имеющей средний действительный размер частиц, практически тот же или менее такового в пресуспензии.

Во второй категории способов, до этапа приложения энергии органическое соединение находится в кристаллической форме и имеет средний действительный размер частиц. После этапа приложения энергии органическое соединение находится в кристаллической форме, имеющей практически тот же средний действительный размер частиц, как и до этапа приложения энергии, но кристаллы после этапа приложения энергии менее склонны к агрегации или образованию больших кристаллов.

Менее выраженная тенденция органического соединения к агрегации или образованию больших кристаллов наблюдается посредством исследований с использованием рассеяния лазерного света и световой микроскопии.

В третьей категории способов, до этапа приложения энергии органическое соединение находится в кристаллической форме, которая является хрупкой и имеет средний действительный размер частиц. Под термином «хрупкая» подразумевается, что частицы являются хрупкими и более легко разбиваются на частицы меньших размеров. После этапа приложения энергии органическое соединение находится в кристаллической форме, имеющей средний действительный размер частиц, который меньше, чем кристаллы в пресуспензии. Путем осуществления этапов, необходимых для придания органическому соединению кристаллической формы, которая является хрупкой, последующий этап приложения энергии можно осуществлять более быстро и эффективно, по сравнению с органическим соединением, находящимся в менее хрупкой кристаллической форме.

В четвертой категории способов первый раствор и второй растворитель одновременно подвергаются этапу приложению энергии. Таким образом, физические свойства органического соединения до и после этапа приложения энергии не измерялись.

Этап приложения энергии можно осуществлять любым способом, при котором пресуспензия или первый раствор и второй растворитель подвергаются воздействию сил кавитации, сдвига или удара. В одной форме этап приложения энергии представляет собой этап отжига. Отжиг в настоящем изобретении определяется как процесс превращения вещества, которое является термодинамическим нестабильным, в более стабильную форму, путем однократного или повторного приложения энергии (прямого нагревания или механического напряжения), с последующей тепловой релаксацией. Указанное понижение энергии можно достигать конверсией твердой формы из менее в более упорядоченную структуру решетки. Альтернативно, указанная стабилизация может наблюдаться при перегруппировке молекул поверхностно-активного агента на поверхности раздела твердого вещества и жидкости.

Указанные четыре категории процессов ниже показаны по отдельности. Следует понимать, однако, что условия процессов, такие как выбор поверхностно-активных агентов или комбинаций поверхностно-активных агентов, количество используемого поверхностно-активного агента, температура реакции, скорость смешивания растворов, скорость преципитации и т.п., можно подбирать таким образом, чтобы любое лекарственное средство можно было обрабатывать с использованием любой категории, обсуждаемой далее.

Первая категория способов, а также вторая, третья и четвертая категории способов можно дополнительно разделить на две подгруппы, способ А и В.

Первый растворитель, согласно следующим способам, представляет собой растворитель или смесь растворителей, в котором органическое соединение, представляющее интерес, является относительно растворимым и который смешивается со вторым растворителем. Указанные растворители включают в себя, без ограничения, смешивающиеся с водой протонные соединения, в которых атом водорода в молекуле связан с электроотрицательным атомом, таким как кислород, азот или другие элементы из групп V A, VI A и VII A периодической таблицы элементов. Примеры указанных растворителей включают в себя, без ограничения, спирты, амины (первичные или вторичные), оксимы, гидроксамовые кислоты, карбоновые кислоты, сульфоновые кислоты, фосфоновые кислоты, фосфорные кислоты, амиды и мочевины.

Другие примеры первого растворителя также включают в себя апротонные органические растворители. Некоторые из указанных апротонных растворителей могут образовывать водородные связи с водой, но могут действовать только как акцепторы протонов, поскольку они не имеют эффективных групп-доноров протонов. Один класс апротонных растворителей представляет собой диполярный апротонный растворитель, по определению международного союза теоретической и прикладной химии (IUPAC Compendium of Chemical Terminology, 2-е изд., 1997 г.).

Растворитель со сравнительно высокой относительной проницаемостью (или диэлектрической постоянной), превышающей приблизительно 15, и со значительным перманентным дипольным моментом, который не может отдавать подходящие лабильные атомы водорода для образования прочных водородных связей, например, диметилсульфоксид.

Диполярные апротонные растворители можно выбрать из группы, состоящей из амидов (полностью замещенных, с присоединенными атомами водорода в отсутствии азота), мочевин (полностью замещенных, без атомов водорода, присоединенных к азоту), эфиров, циклических эфиров, нитрилов, кетонов, сульфонов, сульфоксидов, полностью замещенных фосфатов, фосфонатных эфиров, фосфорамидов, нитросоединений и т.п. Диметилсульфоксид (DMSO), N-метил-2-пирролидинон (NMP), 2-пирролидинон, 1,3-диметилимидазолидинон (DMI), диметилацетамид (DMA), диметилформамид (DMF), диоксан, ацетон, тетрагидрофуран (THF), тетраметиленсульфон (сульфолан), ацетонитрил и гексаметилфосфорамид (HMPA), нитрометан, среди прочих, являются членами данного класса.

Можно выбирать также растворители, которые в целом не смешиваются с водой, но обладают достаточной растворимостью в воде в малых объемах (менее 10%), чтобы действовать как смешивающийся с водой первый растворитель при указанных уменьшенных объемах. Примеры включают в себя ароматические углеводороды, алкены, алканы и галогенированные ароматические соединения, галогенированные алкены и галогенированные алканы. Ароматические соединения включают в себя, без ограничения, бензол (замещенный или незамещенный) и моноциклические или полициклические арены. Примеры замещенных бензолов включают в себя, без ограничения, ксилолы (орто-, мета- или пара-) и толуол. Примеры алканов включают в себя, без ограничения, гексан, неопентан, гептан, изооктан и циклогексан. Примеры галогенированных ароматических соединений включают в себя, без ограничения, хлорбензол, бромбензол и хлортолуол. Примеры галогенированных алканов и алкенов включают в себя, без ограничения, трихлорэтан, метиленхлорид, этилендихлорид (EDC) и т.п.

Другие конкретные примеры растворителей, подходящих для использования в качестве первого растворителя, включают в себя, без ограничения, N-метил-2-пирролидинон (также называемый N-метил-2-пирролидоном), 2-пирролидинон (также называемый 2-пирролидоном), 1,3-диметил-2-имидазолидинон (DMI), диметилсульфоксид, диметилацетамид, уксусную кислоту, молочную кислоту, метанол, этанол, изопропанол, 3-пентанол, н-пропанол, бензиловый спирт, глицерин, бутиленгликоль (бутандиол), этиленгликоль, пропиленгликоль, моноацилированные и диацилированные моноглицериды (такие как глицерилкаприлат), диметилизосорбид, ацетон, диметилсульфон, диметилформамид, 1,4-диоксан, тетраметиленсульфон (сульфолан), ацетонитрил, нитрометан, тетраметилмочевину, гексаметилфосфорамид (HMPA), тетрагидрофуран (THF), диоксан, диэтиловый эфир, трет-бутилметиловый эфир (ТВМЕ), ароматические углеводороды, алкены, алканы, галогенированные ароматические соединения, галогенированные алкены, галогенированные алканы, ксилол, толуол, бензол, замещенный бензол, этилацетат, метилацетат, бутилацетат, хлорбензол, бромбензол, хлортолуол, трихлорэтан, метиленхлорид, этилендихлорид (EDC), гексан, неопентан, гептан, изооктан, циклогексан, полиэтиленгликоль (PEG, например, PEG-4, PEG-8, PEG-9, PEG-12, PEG-14, PEG-16, PEG-120, PEG-75, PEG-150), сложные эфиры полиэтиленгликоля (например, PEG-4 дилаурат, PEG-20 дилаурат, PEG-6 изостеарат, PEG-8 пальмитостеарат, PEG-150 пальмитостеарат), сорбитаны полиэтиленгликоля (такие как PEG-20 сорбитан изостеарат), моноалкиловые эфиры полиэтиленгликоля (например, PEG-3 диметиловый эфир, PEG-4 диметиловый эфир), полипропиленгликоль (PPG), полипропиленальгинат, PPG-10 бутандиол, PPG-10 эфир метилглюкозы, PPG-20 эфир метилглюкозы, PPG-15 стеариловый эфир, пропиленгликоль дикаприлат/дикапрат, пропиленгликоль лаурат и гликоферол (эфир тетрагидрофурфурилового спирта и полиэтиленгликоля). Предпочтительным первым растворителем является N-метил-2-пирролидинон. Другим предпочтительным первым растворителем является молочная кислота.

Второй растворитель представляет собой водный растворитель. Указанный водный растворитель может представлять собой собственно воду. Указанный растворитель может также содержать буферы, соли, поверхностно-активный агент (агенты), водорастворимые полимеры и комбинации указанных наполнителей.

Способ А. В способе А органическое соединение («активный агент» или «лекарственное средство») сначала растворяют в первом растворителе с получением первого раствора. Органическое соединение можно добавлять в количестве приблизительно от 0,1% (масс./об.) до 50% (масс./об.), в зависимости от растворимости органического соединения в первом растворителе. Нагревание концентрата приблизительно от 30°С до 100°С может быть необходимо для гарантии полного растворения соединения в первом растворителе.

Второй водный растворитель изготавливают с добавлением одного или более необязательных модификаторов поверхности, таких как анионогенный поверхностно-активный агент, катионогенный поверхностно-активный агент, цвиттерионный поверхностно-активный агент, неионогенный поверхностно-активный агент или биологическая поверхностно-активная молекула. Подходящие анионогенные поверхностно-активные агенты включают в себя, без ограничения, алкилсульфонаты, алкилфосфаты, алкилфосфонаты, лаурат калия, триэтаноламинстеарат, лаурилсульфат натрия, додецилсульфат натрия, сульфаты алкилполиоксиэтилена, альгинат натрия, сульфосукцинат диоктил-натрия, фосфатидилглицерин, фосфатидилинозин, фосфатидилинозитол, дифосфатидилглицерин, фосфатидилсерин, фосфатидную кислоту и ее соли, натрий-карбоксиметилцеллюлозу, холевую кислоту и другие желчные кислоты (например, холевую кислоту, дезоксихолевую кислоту, гликохолевую кислоту, таурохолевую кислоту, гликодеоксихолевую кислоту) и их соли (например, дезоксихолат натрия и т.п.).

Цвиттерионные поверхностно-активные агенты являются электрически нейтральными, но имеют локальные положительные и отрицательные заряды в пределах одной и той же молекулы. Подходящие цвиттерионные поверхностно-активные агенты включают в себя, без ограничения, цвиттерионные фосфолипиды. Подходящие фосфолипиды включают в себя фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, диацилглицерофосфоэтаноламин (такой как димиристоилглицерофосфоэтаноламин (DMPE), дипальмитоилглицерофосфоэтаноламин (DPPE), дистеароилглицерофосфоэтаноламин (DSPE) и диолеолилглицерофосфоэтаноламин (DOPE). Смеси фосфолипидов, которые включают в себя анионогенные и цвиттерионные фосфолипиды, могут использоваться в настоящем изобретении. Указанные смеси включают в себя, без ограничения, лизофосфолипиды, фосфолипид яйца или соевого боба или любую их комбинацию. Фосфолипид, будь то анионогенный, цвиттерионный или смесь фосфолипидов, может быть солевым или обессоленным, гидрогенизированным или частично гидрогенизированным или натуральным, полусинтетическим или синтетическим. Фосфолипид может также быть конъюгирован с водорастворимым или гидрофильным полимером для специфической целевой доставки макрофагам по настоящему изобретению. Однако, конъюгированные фосфолипиды можно использовать для нацеливания на другие клетки или ткань для других вариантов применения. Предпочтительным полимером является полиэтиленгликоль (PEG), который известен также как монометоксиполиэтиленгликоль (mPEG). Молекулярная масса PEG может варьировать, например, от 200 до 50000. Некоторые широко распространенные PEG, которые имеются в продаже, включают в себя PEG 350, PEG 550, PEG 750, PEG 1000, PEG 2000, PEG 3000 и PEG 5000. Фосфолипид или конъюгат PEG-фосфолипид могут также включать в себя функциональную группу, которая может ковалентно связываться с лигандом, включая, без ограничения, белки, пептиды, углеводы, гликопротеины, антитела или фармацевтически активные агенты. Указанные функциональные группы могут конъюгировать с лигандами, посредством, например, образования амидных связей, дисульфидных или тиоэфирных связей или связывания биотин/стрептавидин. Примеры связывающихся с лигандами функциональных групп включают в себя, без ограничения, гексаноиламин, додеканиламин, 1,12-додекандикарбоксилат, тиоэтанол, 4-(п-малеимидофенил)бутирамид (МРВ), 4-(п-малеимидометил)циклогексанкарбоксамид (МСС), 3-(2-пиридилдитио)пропионат (PDP), сукцинат, глутарат, додеканоат и биотин.

Подходящие катионогенные поверхностно-активные агенты включают в себя, без ограничения, четвертичные аммониевые соединения, такие как хлорид бензалкония, бромид цетилтриметиламмония, хитозаны, хлорид лаурилдиметилбензиламмония, гидрохлориды ацилкарнитина, бромид диметилдиоктадециламмония (DDAB), диолеоилтриметиламмонийпропан (DOTAP), димиристоилтриметиламмонийпропан (DMTAP), диметиламиноэтанкарбамоил-холестерин (DC-Chol), 1,2-диацилглицеро-3-(О-алкил)фосфохолин, О-алкилфосфатидилхолин, галогениды алкилпиридиния или длинноцепочечные алкиламины, такие как, например, н-октиларнин и олеиламин.

Подходящие неионогенные поверхностно-активные агенты включают в себя глицериловые эфиры, эфиры полиоксиэтилена и жирных спиртов (MACROGOL™ и BRIJ™), эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот (полисорбаты), эфиры полиоксиэтилена и жирных кислот (MYRJ™), эфиры сорбитана (SPAN™), моностеарат глицерина, полиэтиленгликоли, полипропиленгликоли, цетиловый спирт, цетостеариловый спирт, стеариловый спирт, арилалкилполиэфирные спирты, сополимеры полиоксиэтилен-полиоксипропилен (полоксамеры), полоксамины, метилцеллюлозу, гидроксиметилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, некристаллическую целлюлозу, полисахариды, включая крахмал и производные крахмала, такие как гидроксиэтилкрахмал (HES), поливиниловый спирт и поливинилпирролидон. В предпочтительной форме неионогенный поверхностно-активный агент представляет собой сополимер полиоксиэтилена и полиоксипропилена, и, предпочтительно, блок-сополимер пропиленгликоля и этиленгликоля. Указанные полимеры имеются в продаже под торговым наименованием POLOXAMER, также иногда называемые PLURONIC® от нескольких поставщиков, включая Spectrum Chemical и Ruger. Среди эфиров полиоксиэтилена и жирных кислот включены соединения, имеющие короткие алкильные цепи. Одним примером указанного поверхностно-активного агента является SOLUTOL® HS 15, полиэтилен-660-гидроксистеарат, производства компании BASF Aktiengesellschaft.

Поверхностно-активные биологические молекулы включают в себя такие молекулы как альбумин, казеин, гирудин и другие подходящие белки. Например, белки, имеющие гидрофильные и гидрофобные домены, также можно использовать. Полисахаридные поверхностно-активные биологические молекулы также включены и представлены, без ограничения, крахмалами, гепаринами и хитозанами. Другие подходящие поверхностно-активные агенты включают в себя любые аминокислоты, такие как лейцин, аланин, валин, изолейцин, лизин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, метионин, фенилаланин или любые производные указанных аминокислот, такие как, например, амидные и сложноэфирные производные и полипептиды, образованные из указанных аминокислот.

Может быть желательным добавление агента, корригирующего рН, во второй растворитель. Подходящие агенты, корригирующие рН, включают в себя, без ограничения, хлористоводородную кислоту, серную кислоту, фосфорную кислоту, монокарбоновые кислоты (такие как, например, уксусная кислота и молочная кислота), дикарбоновые кислоты (такие как, например, янтарная кислота), трикарбоновые кислоты (такие как, например, лимонная кислота), ТНАМ (трис(гидроксиметил)аминометан), меглумин (N-метилглюкозамин), гидроксид натрия и аминокислоты, такие как глицин, аргинин, лизин, аланин, гистидин и лейцин. Второй растворитель должен иметь величину рН в пределах приблизительно от 3 до 11. Водная среда может дополнительно включать в себя агент, корригирующий осмотическое давление, такой как, без ограничения, глицерин, моносахарид, такой как декстроза, дисахарид, такой как сахароза, трисахарид, такой как раффиноза, и сахарные спирты, такие как маннит, ксилит и сорбит.

Для пероральных лекарственных форм можно использовать один или более следующих наполнителей: желатин, казеин, лецитин (фосфатиды), аравийскую камедь, холестерин, трагакант, стеариновую кислоту, хлорид бензалкония, стеарат кальция, глицерилмоностеарат, цетостеариловый спирт, цетомакрогол эмульгирующий воск, сложные эфиры сорбитана, алкиловые эфиры полиоксиэтилена, например, макроголовые эфиры, такие как цетомакрогол 1000, полиоксиэтиленовые производные касторового масла, эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот, например, имеющийся в продаже TWEENS™, полиэтиленгликоли, стеараты полиоксиэтилена, коллоидный диоксид кремния, фосфаты, додецилсульфат натрия, кальций-карбоксиметилцеллюлозу, натрий-карбоксиметилцеллюлозу, метилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, фталат гидроксипропилметилцеллюлозы, некристаллическую целлюлозу, алюмосиликат магния, триэтаноламин, поливиниловый спирт (PVA) и поливинилпирролидон (PVP). Большинство из указанных наполнителей подробно описаны в Handbook of Pharmaceutical Excipients, опубликованным совместно американской фармацевтической ассоциацией и фармацевтическим обществом Великобритании, the Pharmaceutical Press, 1986. Модификаторы поверхностей имеются в продаже и/или могут быть изготовлены с использованием методик, известных специалистам. Два или более модификаторов поверхностей можно использовать в комбинации.

В предпочтительной форме способ изготовления малых частиц органического соединения предусматривает этапы добавление первого раствора ко второму растворителю. Скорость добавления зависит от размера партии и кинетики преципитации органического соединения. Обычно для лабораторного процесса с небольшим объемом (изготовление 1 литра) скорость добавления составляет приблизительно от 0,05 см³ до 10 см³ в минуту. Во время добавления растворы следует постоянно перемешивать. С помощью световой микроскопии было установлено, что образуются аморфные частицы, полукристаллические твердые вещества или сверхохлажденная жидкость для получения пресуспензии. Способ предусматривает также этап приложения энергии к пресуспензии, чтобы конвертировать аморфные частицы, сверхохлажденную жидкость или полукристаллическое твердое вещество в более стабильное кристаллическое состояние твердого вещества. Полученные частицы будут иметь средний действительный размер, по измерению динамическими методами рассеяния света (например, фотокорреляционная спектроскопия, лазерная дифракция, малоугловая лазерная фотометрия светорассеяния (LALLS), среднеугловая лазерная фотометрия светорассеяния (MALLS)), методами light obscuration (например, методом Коултера), реологическими методами или микроскопией (световой или электронной), в пределах, описанных выше. В четвертой категории способов первый раствор и второй растворитель объединяют, одновременно осуществляя этап приложения энергии.

Этап приложения энергии включает в себя приложение энергии посредством воздействия ультразвука, гомогенизации, противоточной гомогенизации, микрофлюидизации или других способов, создающих силы удара, сдвига или кавитации. Образец можно охлаждать или нагревать во время указанной стадии. В одной форме этап приложения энергии осуществляют с использованием пистонного гомогенизатора, такого как гомогенизатор, продающийся компанией Avestin Inc., под торговым наименованием EmulsiFlex-C160. В другой форме этап приложения энергии осуществляют воздействием ультразвука с использованием ультразвукового процессора, такого как Vibra-Cell Ultrasonic Processor (600 Ватт), производства Sonics and Materials, Inc. В еще одной форме этап приложения энергии осуществляют путем использования аппарата для эмульгирования, как описано в патенте США № 5720551, который включен в настоящий документ в качестве ссылки и составляет его часть.

В зависимости от скорости приложения энергии может быть желательно подбирать температуру обрабатываемого образца в пределах приблизительно от -30°С до 30°С. Альтернативно, для того, чтобы влиять на желательное изменение фазы обрабатываемого твердого вещества, может быть также необходимо нагревать пресуспензию до температуры в пределах приблизительно от 30°С до 100°С во время этапа приложения энергии.

Способ В. Способ В отличается от способа А в следующем. Первое отличие заключается в том, что поверхностно-активный агент или комбинацию поверхностно-активных агентов добавляют в первый раствор. Поверхностно-активные агенты можно выбрать из анионогенных, неионогенных, катионогенных поверхностно-активных агентов и поверхностно-активных биологических модификаторов, перечисленных выше.

Сравнительный пример способа А и способа В и Патент США № 5780062

Патент США № 5780062 описывает способ изготовления малых частиц органического соединения посредством, сначала, растворения соединения в смешивающемся с водой первом растворителе. Второй раствор изготавливают посредством растворения полимера и амфифильного соединения в водном растворителе. Первый раствор затем добавляют ко второму раствору, в результате чего образуется осадок, который состоит из органического соединения и комплекса полимер-амфифильное соединение. Патент № 5780062 не описывает использование этапа приложения энергии в данном процессе способов А и В. О недостатке стабильности обычно свидетельствует быстрая агрегация и рост частиц. В некоторых случаях аморфные частицы рекристаллизуются в виде больших кристаллов. Приложение энергии к пресуспензии способами, описанными выше, дает частицы, которые демонстрируют пониженные скорости агрегации и роста частиц, а также отсутствие рекристаллизации во время хранения продукта.

Способы А и В также отличаются от процесса патента № 5780062 отсутствием этапа образования комплекса полимер-амфифильное соединение до преципитации. В способе А указанный комплекс не может образоваться, так как к фазе разбавителя (водного) не был добавлен полимер. В способе В поверхностно-активный агент, который может также действовать как амфифильное соединение, или полимер растворяют с органическим соединением в первом растворителе. Это предотвращает образование любых комплексов амфифильное соединение-полимер до преципитации. В патенте № 5780062 успешная преципитация малых частиц зависит от образования комплекса амфифильное соединение-полимер до преципитации. Патент № 5780062 описывает, что комплекс амфифильное соединение-полимер образует агрегаты в водном втором растворе. Патент № 5780062 объясняет, что гидрофобное органическое соединение взаимодействует с комплексом амфифильное соединение-полимер, уменьшая, таким образом, растворимость указанных агрегатов и вызывая преципитацию. В настоящем способе было показано, что включение поверхностно-активного агента или полимера в первый раствор (способ В) приводит, после добавления ко второму растворителю, к образованию более однородных, более мелких частиц, чем в результате процесса, описанного в патенте № 5780062.

Нанесение покрытия на частицы

Способы нанесения покрытия на частицы, изготовленные по настоящему изобретению, можно осуществлять с использованием различных методик, известных специалистам. Покрытие может быть связано с частицей через различные связи, включая ковалентные и/или нековалентные связи (например, ковалентное связывание, ионные взаимодействия, электростатические взаимодействия, диполь-дипольные взаимодействия, водородное связывание, силы Ван дер Ваальса, взаимодействия гидрофобных/гидрофобных доменов, поперечная сшивка и/или любые другие взаимодействия).

Покрытия с нековалентным связыванием можно изготавливать, например, смешиванием множества частиц с раствором, содержащим опсонин, такой как иммуноглобулин G (IgG), или комплементный белок, такой как C3b или С5. Раствор можно смешивать в условиях высокого усилия сдвига, с использованием, например, микрофлюидизатора, пистонного гомогенизатора, противоточного гомогенизатора или ультразвукового процессора. Для того, чтобы подтвердить, что покрытие успешно абсорбировалось на частицах, можно определить поверхностный электрический потенциал частиц путем измерения дзета-потенциала до и после процесса нанесения покрытия. Можно использовать также другие известные способы измерения абсорбции покрытия, например, опсонин можно модифицировать флюоресцентной меткой, и абсорбцию меченного флюоресцентной меткой опсонина можно выявить с использованием флюоресцентной микроскопии. Способы ELISA и другие системы выявления на основе антител также можно использовать для обнаружения опсонина. Преимущественно, опсониновые покрытия могут легко абсорбироваться на поверхности частиц, особенно частиц, включающих в себя плохо растворимые в воде активные агенты, как объяснялось выше.

Покрытие может быть также ковалентно связано с ядром частицы. Покрытия с ковалентным связыванием можно изготавливать, например, смешиванием множества частиц, включающих в себя реакционно-способную функциональную группу, с раствором, содержащим опсонин. Реакционно-способные функциональные группы включают в себя электрофильные функциональные группы, способные взаимодействовать, например, с амино-, гидроксил- и/или тиолсодержащими аминокислотами опсонина. Подходящие реакционно-способные функциональные группы включают в себя, например, альдегиды, N-гидроксисукцинимидные эфиры и малеимиды. Нестабильные ковалентные связи, образованные вышеупомянутыми реакциями, можно стабилизировать следующими реакционными этапами. Например, взаимодействие амина с альдегидом образует гидролитически нестабильный имин, который можно стабилизировать восстановлением иминной связи с использованием такого реагента как борогидрид натрия или цианборогидрид натрия.

В еще одном аспекте покрытие может включать в себя опсонин, который ковалентно связан с другой молекулой покрытия, такой как полисахарид. Обычно частицу, включающую в себя активный агент, сначала покрывают полисахаридом, а затем полисахарид взаимодействует с опсонином, например, с использованием способов ковалентного связывания, описанных непосредственно выше. Полисахаридную или любую другую подходящую молекулу, конъюгированную с опсонином, можно использовать для модификации свойств покрытия, например, путем улучшения аффинности связывания покрытия и ядром частицы. Подходящие полисахариды включают в себя, без ограничения, декстраны, глюканы, целлюлозы, крахмалы, гликогены, фруктаны, хитины и гепарины. Полисахариды обычно имеют молекулярную массу приблизительно от 5000 дальтон до 250000 дальтон, например, приблизительно от 8000 дальтон до 200000 дальтон, и/или приблизительно от 10 000 дальтон до 150000 дальтон, но можно использовать также полисахариды с более высокой и более низкой молекулярной массой.

Покрытие может также включать в себя один поверхностно-активный агент или комбинацию поверхностно-активных агентов. Поверхностно-активный агент можно выбрать из ряда известных анионогенных поверхностно-активных агентов, катионогенных поверхностно-активных агентов, цвиттерионных поверхностно-активных агентов, неионогенных поверхностно-активных агентов и поверхностно-активных биологических модификаторов. Подходящие поверхностно-активные агенты предусматривают поверхностно-активные агенты, ранее перечисленные в настоящем документе. Примеры поверхностно-активных агентов предусматривают, без ограничения, полоксамеры, фосфолипиды, фосфолипиды, конъюгированные с полиэтиленгликолем, и полисорбаты. Примеры комбинаций поверхностно-активных агентов предусматривают, без ограничения, полоксамеры и фосфолипиды, полоксамеры и фосфолипиды, конъюгированные с полиэтиленгликолем, и полоксамеры и полисорбаты. Альтернативно, покрытие может практически не содержать поверхностно-активных агентов (например, менее 2 массовых процентов поверхностно-активного агента, менее 1 массового процента поверхностно-активного агента или менее 0,5 массового процента поверхностно-активного агента).

Поглощение клетками частиц с покрытием

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу усиления поглощения клетками активного агента, содержащему контактирование клеток со множеством поверхностно-модифицированных частиц; указанные частицы содержат ядро частицы и покрытие, связанное с ядром частицы. Клетки могут представлять собой фагоцитарные клетки, слабофагоцитарные клетки или нефагоцитарные клетки. Ядро частицы содержит активный агент, покрытие содержит опсонин (например, антитело, имеющее изотип IgG, или комплементный белок, такой как C3b или С5), и поверхностно-модифицированная частица имеют средний размер приблизительно от 1 нм до 2000 нм. Поглощение активного агента клетками, таким образом, усиливается, по сравнению с поглощением активного агента при использовании частиц, которые не предусматривают упомянутого выше покрытия.

Поглощение клетками позволяет осуществлять доставку активного агента к тканям-мишеням, которые нуждаются в лечении, поскольку различные клеточные типы, способные к усиленному поглощению частиц с покрытием в соответствии с настоящим описанием, также перемещаются к пораженным или воспаленным тканям. Например, нейтрофилы преобладают на ранних стадиях инфекции или воспаления, с последующим преобладанием фагоцитов моноцитарного происхождения, которые покидают кровеносную систему и внедряются в инфицированную ткань. Фиксированные макрофаги (гистиоциты) в изобилии имеются в печени, нервной системе, легких, лимфатических узлах, костном мозге и некоторых других тканях. Ткани, которые наиболее сильно поражены бактериальными, вирусными или грибковыми патогенами и которые являются воспаленными, могут являться мишенями для доставки нагруженных лекарственными средствами клеток (например, гранулоцитов), имеющих склонность нацеливаться на указанные участки воспаления путем хемотаксиса. Так, путем усиления поглощения клетками, фармацевтический агент высвобождается из указанных клеток в области, в которой он является наиболее терапевтически необходимым. Так, доставка агента к ткани-мишени для лечения заболевания или расстройства облегчается клетками, нагруженными частицами с покрытием. Указанные заболевания и расстройства предусматривают, без ограничения, инфекционные заболевания или расстройства, воспалительные заболевания или расстройства, нейродегенеративные заболевания или расстройства и пролиферативные заболевания или расстройства.

Существует множество типов фагоцитарных клеток, которые способны поглощать частицы с покрытием. Указанные клетки содержат, без ограничения, макрофаги, моноциты, гранулоциты, агранулоциты и нейтрофилы. Настоящее изобретение также включает в себя слабофагоцитарные клетки и нефагоцитарные клетки. Так, другие подходящие клеточные типы содержат, без ограничения, Т-лимфоциты, В-лимфоциты, нулевые клетки, натуральные клетки-киллеры, лимфоциты, красные кровяные клетки, мышечные клетки, клетки костного мозга, стволовые клетки, сосудистые клетки, клетки тканей органов, нейрональные клетки, базофилы, эозинофилы, дендритные клетки и эндотелиальные клетки. Также другие клетки можно использовать для доставки фармацевтически активных соединений субъекту. Любой тип клеток можно использовать в настоящем изобретении, если он только способен поглощать частицу. Поглощение клетками частиц может включать в себя фагоцитоз или другие средства эндоцитоза или прикрепление/абсорбцию частицы на поверхности клеток. Частицы, связанные с клеточной поверхностью, также могут быть взяты внутрь клеток с помощью пиноцитоза, который представляет собой инвагинацию клеточной мембраны с образованием внутриклеточной капсулы вокруг частицы. При пиноцитозе («клеточном питье») поглощенная частица является относительно малой (например, 20 нм) (Watts et al., Endocytosis: what goes in and how?, Journal of Cell Science, 1992, том 103(1), страницы 1-8). Пиноцитоз наблюдается непрерывно почти во всех эукариотических клетках.

Как объяснялось в настоящем документе, частицы преимущественно предусматривают покрытие, которое облегчает поглощение клетками. В частности, покрытие может облегчать поглощение клетками, такими как моноциты, макрофаги и Т-лимфоциты, которые способны передвигаться с помощью известных механизмов, таких как хемотаксис, к месту воспаления, инфекции или опухоли, и, таким образом, доставлять частицы к конкретной ткани-мишени.

В одном аспекте изобретения контактирование клеток с поверхностно-модифицированной частицей (с получением клеток, нагруженных активным агентом) осуществляют ех vivo (т.е., вне организма млекопитающего). Альтернативно, или помимо этого, контактирование клеток с поверхностно-модифицированной частицей можно осуществлять in vivo (т.е., в организме млекопитающего). Количество поверхностно-модифицированных частиц, которое является эффективным для лечения заболевания или расстройства, используют во время этапа контактирования. Специалист понимает, что определенное количество частиц может захватываться клеточным типом, который не перемещается к ткани-мишени, представляющей интерес, или не высвобождается клеткой в ткани-мишени, представляющей интерес. Таким образом, специалист понимает, что количества введенных частиц можно оптимизировать с использованием обычных протоколов, при условии, что указанные количества находятся в пределах установленных протоколов введения.

Для введения ex vivo клетки можно выделять из организма млекопитающего с использованием клеточного сепаратора или устройства для афереза. Например, клеточный сепаратор CS-3000™ (Fenwal Inc., Lake Zurich, Ill.) или клеточный сепаратор ISOLEX™ (Baxter Healthcare Corp., Deerfield, Ill.) можно использовать для выделения различных клеток. Другие способы выделения клеток ex vivo, известные специалистам, можно использовать для получения клеток, пригодных для настоящего изобретения. Указанные способы предусматривают, без ограничения, аферез периферической крови, мобилизацию клеток костного мозга посредством, например, G-CSF, M-CSF или GM-CSF, или прямой забор клеток костного мозга посредством спинальной, стернальной, люмбальной пункции или пункции подвздошного гребня. Ex vivo клетки можно поддерживать в среде для культивирования клеток или в другой изолирующей системе, известной специалистам. Примерами указанных сред являются раствор Альсервера, среда Амеса, основная среда Игла, среды для культур клеток СНО (яичников китайских хомячков), среда Клика, модифицированная по способу Дюльбекко среда Игла, физиологический раствор с фосфатным буфером, декстроза или сахароза с фосфатным буфером, сбалансированный солевой раствор Ерла, среда для генной терапии 3, сбалансированный солевой раствор Гея, минимальная эссенциальная среда Глазго, сбалансированные солевые растворы Хенкса, гибридомные среды, модифицированные по способу Исков среды Дюльбекко, буфер Кребса-Хенселейта с сахарами, среда Лейбовица (L-15), среда М16, среда Мак-Коя, MCDB (бычья почка Madin-Darby), MDCK (собачья почка Madin-Darby), среда 199, NCTC, среда Хэма (например, питательная смесь F-10), модифицированная по способу Куна среда Хэма, RPMI и другие среды, как те, которые перечислены в Biochemicals & Reagents for Life Science Research, Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, Mo., США). Целью описанного культивирования может быть простое хранение без утраты клеток или клеточная пролиферация или рост, путем добавления подходящих факторов роста, цитокинов и питательных агентов, для усиления роста клеток. Указанный рост должен минимизировать количество временных интервалов, которые будут необходимы пациенту для подготовки к забору клеточных образцов.

После выделения клетки можно приводить в контакт с частицами с покрытием и инкубировать в течение короткого периода времени для поглощения клетками частиц. Концентрации частиц, используемые для процедуры ex vivo, будут варьировать в зависимости от нескольких факторов, включая, без ограничения, используемый клеточный тип, используемый активный агент, размер дисперсий малых частиц, заболевание, подлежащее лечению, и т.п. Обычно, однако, клеточные изоляты контактируют приблизительно с 1-300 мг/мл частиц по настоящему изобретению. Во время контактирования частиц с клетками частицы имеют концентрацию, превышающую термодинамическую растворимость насыщения, что позволяет частицам оставаться в форме частиц по время захвата и доставки млекопитающему. Клетки можно инкубировать с частицами в течение периода времени до 24 часов или более, для обеспечения достаточного захвата клетками частиц лекарственного средства.

Любой способ влияния на захват частиц активного агента клетками ex vivo можно использовать, с тем требованием, что способ не разрушает или каким-либо другим образом не делает клетки не пригодными для введения субъекту. Например, можно использовать сайт-специфичную доставку частиц с использованием молекулы биологического распознавания. См., например, патентную публикацию США № 2003/0092069, включенную в настоящий документ в качестве ссылки, которая описывает перенос генов в конкретные клетки или ткани посредством полой наночастицы. Другие способы нагрузки ex vivo клеток предусматривают электропорацию, сонопорацию и другие механические средства, которые разрушают клеточную мембрану (например, обработку ультразвуком) и делают возможной инсерцию твердых частиц в клетки. Ультразвук был успешно использован Zarnitsyn et al., Physical parameters influencing optimization og ultrasound-mediated DNA transfection, Ultrasound Med. Biol., 2004, том 30(4), страницы 527-538) для временного разрушения клеточных мембран и облегчения, таким образом, загрузки ДНК в жизнеспособные клетки. Другие механические процедуры хорошо известны специалистам и включены в настоящее описание в качестве его части. Химические способы временной дестабилизации клеточных мембран также хорошо известны. Реагенты для трансфекции содержат поверхностно-активные агенты и включают в себя реагент для трансфекции 293FECTIN™ и LIPOFECTAMINE™ от компании Invitrogen Corporation (Carlsbad, Calif.). Другим примером поверхностно-активного агента для переноса ДНК в клетки является реагент SAINT™ от компании Synvolux Therapeutics B. V. L. J. (Groningen, Нидерланды), на основе поверхностно-активного агента пиридиния.

Следующее описание частиц используется во всех вариантах осуществления настоящего изобретения, описанных в настоящем документе. Для минимально растворимых лекарственных средств можно использовать процедуру нагрузки клеток при условии, что клетки способны захватывать частицы активного агента с покрытием с более высокой скоростью, чем происходит конкурентный процесс растворения. Частицы должны иметь соответствующий размер, чтобы предусматривать захват клетками частиц с покрытием и доставлять их к ткани-мишени до полного растворения частиц. Поскольку клетки, о которых известно, что они перемещаются к ткани-мишени, представляющей интерес, способны захватывать частицы, активный агент в конечном итоге высвобождается из клеток поблизости от ткани-мишени. Помимо этого, концентрацию композиции активного агента следует поддерживать на уровне, превышающем растворимость насыщения композиции, таким образом, что частица способна сохранять кристаллическое состояние во время захвата.

Следующее описание частиц также используется во всех вариантах осуществления настоящего изобретения, описанных в настоящем документе. Введение поверхностно-модифицированных частиц можно осуществлять с использованием различных методик, известных специалистам для введения частиц. Введение включает в себя введение поверхностно-модифицированных частиц млекопитающему. Подходящие способы введения поверхностно-модифицированных частиц предусматривают, без ограничения, введение частиц внутривенно, интраартериально, внутримышечно, подкожно, внутрикожно, внутрисуставно, интратекально, эпидурально, интрацеребрально, трансбуккально, ректально, местно, чрескожно, перорально, интраназально, пульмонарным путем, интраперитонеально и/или внутриглазным путем. Этап введения можно осуществлять болюсной инъекцией, прерывистой инфузией или непрерывной инфузией. Количество и способ доставки поверхностно-модифицированных частиц могут определить опытные клиницисты. Различные факторы будут влиять на количество и способ доставки, включая, без ограничения, тип используемых клеток (для способов введения ex vivo), пол, массу тела и возраст субъекта, подвергаемого лечению, тип и степень развития заболевания или расстройства, подвергаемого лечению, активный агент, который планируется ввести, и т.п. Обычно, активный агент может вводиться в пределах доз от 1 пг соединения на кг массы тела до 1000 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 100 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 50 мг/кг и от 1 мг/кг до 20 мг/кг, в виде суточных доз или в виде эквивалентных доз в течение более длительных или более коротких интервалов времени, например, через день, дважды в неделю, один раз в неделю или два или три раза в день.

Различные заболевания или расстройства можно лечить способами по настоящему изобретению, включая, без ограничения, инфекционные заболевания или расстройства, воспалительные заболевания или расстройства, нейродегенеративные заболевания или расстройства и пролиферативные заболевания или расстройства. С указанной точки зрения, симптомы указанных заболеваний или расстройств можно облегчать с использованием настоящих способов.

Термин «инфекционное заболевание или расстройство», используемый в настоящем документе, относится к состоянию, вызванному патогенными микроорганизмами, такими как бактерии, вирусы, паразиты или грибы. Инфекционные заболевания или расстройства, на которые могут оказать благоприятное действие описанные способы, предусматривают, без ограничения, вирусные инфекции (включая ретровирусные инфекции), такие как тропическая лихорадка, энтеровирусные инфекции, ВИЧ, гепатит В, гепатит С и грипп; грибковые инфекции, паразитарные инфекции, такие как Африканский трипаносомоз и малярия, и бактериальные инфекции, такие как холера, менингит и туберкулез.

Термин «воспалительное заболевание или расстройство», используемый в настоящем документе, относится к состоянию, которое характеризуется покраснением, жаром, отеком и болью (т.е., воспалением), при котором обычно наблюдается повреждение или деструкция ткани. Воспалительные заболевания или расстройства весьма заметно связаны с притоком лейкоцитов и/или хемотаксисом лейкоцитов. Воспалительные состояния могут возникать в результате инфицирования патогенными организмами или вирусами и в результате неинфекционных событий, включая, без ограничения, травму или реперфузию после инфаркта миокарда или инсульта, иммунные реакции на чужеродные антигены и аутоиммунные реакции. Соответственно, воспалительные состояния, поддающиеся лечению способами и соединениями по настоящему изобретению, включают в себя состояния, связанные с реакциями специфической защитной системы, состояния, связанные с реакциями неспецифической защитной системы и состояния, связанные с активацией клеток воспаления.

Термин «специфическая защитная система», используемый в настоящем документе, относится к компоненту иммунной системы, которая реагирует в присутствии специфических антигенов. Примеры воспалительных состояний, возникающих в результате ответа специфической защитной системы, включают в себя, без ограничения, классическую реакцию на чужеродные антигены, аутоиммунные заболевания и реакцию гиперчувствительности замедленного типа, опосредуемую В-клетками и/или Т-клетками (т.е., В-лимфоцитами и/или Т-лимфоцитами). Хронические воспалительные заболевания, отторжение твердых трансплантированных тканей и органов, включая, без ограничения, почку и трансплантат костного мозга и болезнь «трансплантат против хозяина» (GVHD) представляют собой дополнительные примеры воспалительных состояний, возникающих в результате ответа специфической защитной системы.

Термин «неспецифическая защитная система», используемый в настоящем документе, относится к воспалительным состояниям, которые опосредуются лейкоцитами, не имеющими иммунологической памяти (например, гранулоцитами, включая, без ограничения, нейтрофилы, эозинофилы и базофилы, тучными клетками, моноцитами, макрофагами). Примеры воспалительных состояний, возникающих, по крайней мере, частично, в результате ответа неспецифической защитной системы, предусматривают, без ограничения, (острый) респираторный дистресс-синдром взрослых (ARDS), синдромы полиорганного повреждения, реперфузионное повреждение, острый гломерулонефрит, реактивный артрит, дерматит с компонентами острого воспаления, острый гнойный менингит, другие воспалительные состояния центральной нервной системы, включая, без ограничения, инсульт, термическое повреждение, воспалительное заболевание кишечника, синдромы, связанные с трансфузией гранулоцитов, и цитокин-индуцированную токсичность.

Терапевтические способы по настоящему изобретению предусматривают способы улучшения состояний, связанных с активацией клеток воспаления. «Активация клеток воспаления» относится к индукции раздражителем (включая, без ограничения, цитокины, антигены и аутоантитела) пролиферативного клеточного ответа, выработке растворимых медиаторов (включая, без ограничения, цитокины, кислородные радикалы, ферменты, простаноиды и вазоактивные амины) или экспрессии на клеточной поверхности новых или увеличенного количества медиаторов (включая, без ограничения, главные антигены гистосовместимости и молекулы клеточной адгезии) в клетках воспаления (включая, без ограничения, моноциты, макрофаги, Т-лимфоциты, В-лимфоциты, гранулоциты (полиморфноядерные лейкоциты, включая нейтрофилы, базофилы и эозинофилы), тучные клетки, дендритные клетки, клетки Лангерганса и эндотелиальные клетки). Специалистам будет понятно, что активация одного или комбинации указанных фенотипов в указанных клетках может вносить свой вклад в инициацию, сохранение или обострение воспалительного состояния.

Другие заболевания или расстройства, которые можно успешно лечить, включают в себя заболевания или состояния, характеризующиеся воспалением или инфекцией, включая, без ограничения, ревматоидный артрит, болезнь Грейвза, астенический бульбарный паралич, тиреоидит, диабет, воспалительное заболевание кишечника, аутоиммунный оофорит, системную красную волчанку и синдром Шенгрена.

Примеры нейродегенеративных заболеваний или расстройств, которые можно успешно лечить, включают в себя, без ограничения, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз, энцефаломиелит, энцефалит (включая ВИЧ-энцефалит), болезнь Хантингтона, боковой амиотрофический склероз (известный также как болезнь Lou Gehrig), фронтотемпоральную деменцию, прионные заболевания, болезнь Крейтцфельда-Якоба и адренолейкодистрофию. Другие нейродегенеративные заболевания или расстройства, которые можно успешно лечить, включают в себя болезнь Пика, фронтотемпоральную долевую дегенерацию, прогрессирующую афазию и семантическую деменцию. Прионные заболевания, известные также как трансмиссивные спонгиоформные энцефалопатии (TSE), включают в себя болезнь Крейтцфельда-Якоба, новый вариант болезни Крейтцфельда-Якоба, синдром Герстманна-Штраусслера-Шейнкера, фатальная семейная бессонница и куру. Нейродегенеративные заболевания или расстройства также могут представлять собой болезнь Александера, болезнь Альпера, атаксия телеангиэктазия, болезнь Баттена (также известную как болезнь Шпильмейера-Фогта-Шегрена-Баттена), болезнь Канавана, синдром Кокейна, кортикобазальную дегенерацию, ВИЧ-ассоциированную деменцию, болезнь Кеннеди, болезнь Краббе, деменция Lewy body, болезнь Мачадо-Джозефа (спиномозжечковую атаксию 3 типа), множественную системную атрофию, нейробореллиоз, болезнь Пелизо-Мерцбахера, первичный латеральный склероз, болезнь Рефсома, болезнь Сэндхоффа, болезнь Шильдера, шизофрению, спиномозжечковую атаксию, спинальную мышечную атрофию, болезнь Стила-Ричардсона-Ольжевски и сухотку спинного мозга.

Пролиферативные заболевания или состояния, для лечения которых могут быть благоприятными описанные способы, включают в себя, без ограничения, рак толстого кишечника, рак почки, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, рак шейки матки, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак головного мозга, саркому, меланому, лейкоз, острый лимфолейкоз, острый миелолейкоз, хронический лимфолейкоз, хронический миелолейкоз, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, миелому и глиобластому. Тиреоидит включает в себя тиреоидит Хашимото, подострый тиреоидит (также известный как тиреоидит Квервена), бессимптомный тиреоидит (также известный как безболезненный тиреоидит), послеродовой тиреоидит, лекарственный тиреоидит, радиационный тиреоидит и острый гнойный тиреоидит.

Описание можно лучше понять с помощью следующих примеров, которые не предназначаются для ограничения, но лишь перечисляют служащие примерами варианты осуществления настоящего изобретения в соответствии с описанием.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Изготовление суперпарамагнитных частиц оксида железа (SPIO) с покрытием из IgG

Перйодат натрия, цианборогидрид натрия, неокупроин, ацетат аммония, аскорбиновую кислоту и перманганат калия приобретали у компании Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. Мышиные и человеческие фрагменты IgG F(ab')₂ и Fc приобретали у компании Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA. Крысиный IgG2a анти-MsCD16/CD32 (FcgRIII/FcgRII)(2.4G2), крысиный IgG2a анти-тринитрофенольный (TNP) изотипный контроль, IgG1 анти-Hu CD16 (FcgRIII)(3G8), IgG1 анти-Hu CD32 (FcgRII) (3D3), IgG1 анти-TNP (107.3) приобретали у компании BD Biosciences, San Jose, CA. IgG1 анти-HU CD64 (FcgR1)(10.1) приобретали у компании eBioscience, San Diego, CA. Карбоновую кислоту Alexa Fluor® 488, сукцинимидиловый эфир и гидроксиламин Alexa Fluor® 488 приобретали у компании Invitrogen. Ferumoxides (Feridex IV®, Bayer Healthcare Pharmaceuticals, Wayne, NJ) представляет собой суперпарамагнитную частицу оксида железа (SPIO) со средним гидродинамическим размером 150 нм и концентрацией железа 11,2 мг/мл.

Наночастицы (NP) SPIO концентрировали с использованием центрифужного фильтровального устройства Microcon YM-30 (Millipore, Billerica, MA) и подвергали диализу с использованием ацетатного буфера (0,1 М, рН 5,5) в течение ночи при 4°С. Декстран Т-10, окружающий железное ядро SPIO, окисляли взаимодействием с 10 мМ метаперйодата натрия в темноте в течение 1 часа при комнатной температуре. Для удаления избытка реагента окисленную SPIO подвергали диализу с использованием физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS) в течение ночи при 4°С. Человеческий IgG (Baxter Healthcare Corporation, Westlake Village, CA) или мышиный IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) добавляли к суспензии окисленных NP в PBS с 50 мМ цианборогидридом в 1 М NaOH, в конечных концентрациях 2 мг/кг IgG и 10 мг/кг SPIO. Инкубацию осуществляли в течение ночи при осторожном перемешивании при комнатной температуре, и реакцию гасили добавлением 50 мМ Tris-HCl. Свободный IgG удаляли из NP с использованием колонки с сефарозой CL-4B. Хроматография реакций конъюгатов NP с использованием сефарозы CL-4B показала, что NP элюировались между 20 мл и 25 мл, а свободный IgG - между 45 мл и 60 мл (фиг. 1).

Размер частиц определяли с использованием динамического рассеяния света. Присутствие IgG, ковалентно связанного с NP, и количество свободного IgG определяли с помощью микроанализа с использованием бихинной кислоты (ВСА) (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Выход связывания оценивали приблизительно в 50%.

При изготовлении параллельных препаратов гидроксиламин Alexa Fluor® 488, мышиный IgG и фрагменты мышиного и человеческого IgG F(ab')₂ взаимодействовали с альдегидом SPIO при комнатной температуре в буфере PBS для получения контрольных реагентов для исследований блокирования и синтеза комбинированных препаратов SPIO, конъюгированных с антителом и флюоресцентной меткой. Для флюоресцентных нанокомпозиций сукцинимидиловый эфир карбоновой кислоты Alexa Fluor® 488 конъюгировали с IgG SPIO в карбонат-бикарбонатном буфере в течение 2 ч. Свободную краску отделяли от конъюгатов с использованием колонок PD-10.

Стабильность IgG-SPIO изучали при 4°С в определенных временных точках в течение одного месяца, путем измерения размера и индекса полидисперсности (фиг. 2). Немедленно после конъюгирования IgG-SPIO имели размеры 175 нм и индекс полидисперсности приблизительно 0,2. В течение первых двух недель никаких значительных изменений гидродинамического диаметра и распределения по размерам не отмечалось. Однако, через 30 дней после конъюгирования IgG-SPIO увеличились до 270 нм, а индекс полидисперсности приблизился к 0,3, что предполагает ограниченную агрегацию NP.

Пример 2

Выделение и культивирование моноцитов, полученных из моноцитов макрофагов (MDM) и полученных из костного мозга макрофагов (ВММ)

Человеческие моноциты получали лейкоферезом от серонегативных по ВИЧ-1 и гепатиту доноров и очищали противоточной центрифужной сепарацией. Получали должным образом окрашенные цитоспины и чистоту клеток исследовали с использованием иммунологического мечения анти-CD68 (клон КР-1). Для получения макрофагов из моноцитов (MDM) отделенные центрифугированием моноциты культивировали до семи дней в концентрации 2×106 клеток/мл при 37°С в увлажненной атмосфере в модифицированной по способу Дюльбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10% инактивированной нагреванием объединенной человеческой сыворотки, 1% глутамина, 50 мкг/мл гентамицина, 10 мкг/мл ципрофлоксацина и 1000 ЕД/мл рекомбинантного человеческого макрофагального колониестимулирующего фактора (MCSF), безвозмездно предоставленного компанией Wyeth Inc., Cambridge, MA. Самцов мышей BALB/c (Charles River Laboratory, Inc., MA) в возрасте 4-5 недель использовали в качестве доноров полученных из костного мозга макрофагов (ВММ). Удаляли бедренную кость, извлекали костный мозг, клетки диссоциировали с получением суспензий единичных клеток и культивировали в течение 10 дней с добавлением 1000 ЕД/мл MCSF (Wyeth Inc.). Культивируемые BMM оказались на 98% CD11b+, по результатам проточного цитометрического анализа на проточном цитометре FACS Calibur (BD Biosciences).

Пример 3

Поглощение моноцитами и макрофагами SPIO с покрытием

Человеческие моноциты или MDM переносили на 8-луночные предметные стекла (0,5×10⁶ клеток на лунку). SPIO добавляли до конечной концентрации железа 0,5 мг/мл и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. После трех промываний клетки фиксировали 4% параформальдегидом в течение 30 минут при комнатной температуре. Для исследований блокирования Fc человеческий фрагмент IgG Fc или антитела против рецепторов Fc (клоны 3G8, 3D3 и 10.1) (10 мкг/мл) добавляли к культурам MDM, инкубировали при 37°С в течение 20 минут, с последующим инкубированием SPIO, IgG-SPIO или F(ab')₂-SPIO до конечной концентрации железа 0,5 мг/мл в течение 0,5, 1, 2 и 4 часов. Клетки только со средами и с анти-TNP изотипным контролем, 107.3 служили контролями. Для мышиных BMM процедура была идентична процедуре для человеческих клеток, но в качестве блокаторов Fc использовали мышиный фрагмент IgG Fc и IgG FcgRIII/FcgRII. После двух промываний PBS клетки изучали с использованием флюоресцентной микроскопии.

Содержание железа оценивали феррозином (см. ниже). Присутствие железа наблюдали с использованием окрашивания прусским синим с 5% ферроцианидом калия и 5% хлористоводородной кислотой. После трех промываний клетки контрастно окрашивали ядерным быстрым красным. Высокая аккумуляция железа наблюдалась с IgG-SPIO, в то время как поглощение нативных SPIO человеческими моноцитами было ограниченным. Жизнеспособность моноцитов и MDM оценивали с использованием анализа живой/мертвый (Axxora, LLC, San Diego, CA). Меченные железом моноциты инкубировали со смесью 0,5 мкМ гомодимера-1 этидия с 1 мкМ кальцеина АМ при 37°С в увлажненной атмосфере в течение 25 минут. Клетки промывали три раза, фиксировали 4% параформальдегидом в течение 30 минут при комнатной температуре и изучали с использованием флюоресцентной микроскопии. Аккумуляция кальцеина-АМ и расщепление цитозольной эстеразой метят живые клетки зеленым, и гомодимер-1 этидия метит ядра мертвых клеток красным. Жизнеспособность человеческих моноцитов постоянно превышала 90%. Жизнеспособность клеток подтверждали исключением трипанового синего, при котором меченные железом человеческие моноциты инкубировали с трипановым синим в течение 15 минут и промывали три раза. Большинство меченных железом моноцитов исключали трипановый синий, подтверждая, что интернализация IgG-SPIO не вызывает токсического эффекта. Немеченные клетки и человеческие моноциты, убитые 70% раствором метанола, служили контролями.

Трансмиссионную электронную микроскопию (ТЕМ) использовали для изучения мест локализации SPIO в человеческих моноцитах. Для проведения ТЕМ человеческие моноциты и MDM культивировали на покровных стеклах с покрытием из поли-d-лизина Thermanox (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY), инкубировали с SPIO в течение 1 часа при 37°С и промывали три раза физиологическим раствором с фосфатным буфером. Их фиксировали в 2% глутаровом альдегиде, 2% параформальдегиде, 0,5% акролеине в 0,1 М фосфатном буфере Соренсена с рН 7,2, а затем проявляли после фиксирования в 1% растворе тетроксида осмия в воде в течение 30 минут. После промывания человеческие моноциты дегидратировали в течение 5 минут на каждом этапе в ступенчатых сериях растворов этанола и инфильтрировали аралдитовыми средами для заливки путем пропускания через ступенчатые серии раствором этанол/аралдит. Покровные стекла заливали культуральной стороной вниз в чистые аралдитовые диски, помещали на ночь в печь при 65°С для полимеризации и удаляли погружением в жидкий азот. Колонии моноцитов и MDM вырезали и монтировали en face для изготовления ультратонких срезов. Срезы помещали на медные сетки 200 меш и сетки окрашивали 1% уранилацетатом и цитратом свинца Рейнольда. Клетки изучали с использованием ТЕМ Philips LS410 при 80 кв. Аккумуляцию хроматина наблюдали на периферии ядра человеческих моноцитов. IgG-SPIO захватывались клетками внутрь эндоцитических пузырьков размерами, достигавшими 0,7-1 мкм. Распределение IgG-SPIO было интрацитоплазматическим с предпочтительной локализацией NP на складках малых мембран. Как количества, так и размеры нагруженных железом пузырьков возрастали в композициях IgG-SPIO.

Содержание железа оценивали с использованием колориметрического феррозинового анализа. Для проведения указанного анализа продублированные серии человеческих моноцитов и MDM культивировали на 24-ячеечных чашках (1×10⁶ клеток на ячейку). SPIO инкубировали до конечной концентрации 0,5 мг/мл в течение 0,5, 1, 2, 4 и 8 часов при 4°С и 37°С. Меченные железом клетки промывали три раза PBS и лизировали с использованием 50 мМ NaOH в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере. Аликвоты клеточных лизатов смешивали в равных объемах с 10 мМ хлористоводородной кислотой (HCl), чтобы растворить SPIO. Реагент, высвобождающий железо, смесь 1,4 М HCl и 4,5% (масс./об.) KMnO₄ в дистиллированной воде, добавляли к лизатам, и смеси инкубировали в течение 2 часов при 60°С. Реагенты для феррозинового анализа изготавливали на дистиллированной воде из 6 мМ феррозина, 2,5 М ацетата аммония, 1 М аскорбиновой кислоты и 6,5 мМ неокупроина, предварительно растворенного в метаноле. Образцы переносили в 96-луночный планшет и считывали при 540 нм. Стандарты железа изготавливали при тех же условиях реакции, с использованием маточного раствора железа с концентрацией 0,2 мг/мл (Ricca Chemical Company, Arlington, TX). Концентрации железа нормализовали по концентрациям белка, по результатам микро ВСА анализа (Pierce Biotechnology).

Ковалентное присоединение человеческого IgG ускоряло поглощение SPIO, по результатам колориметрических исследований (фиг. 3). Спустя 1 час содержание железа в клетках, ~0,2 мкг железа/мкг белка, достигало половины максимальной величины. В противоположность IgG-SPIO, зависимость интернализации SPIO от времени была линейной до 8 часов инкубации, с увеличением содержания железа приблизительно с ~0,03 до 0,06 мкг железа/мкг белка между 4 и 8 часами. Для большинства изученных отрезков времени содержание NP было приблизительно на порядок выше, чем в клетках, на которые воздействовали NP без покрытия.

Измерения релаксивности T₂ меченных железом человеческих моноцитов также осуществляли с использованием анализа МРТ образцов каждого отрезка времени в трех повторностях. МРТ использовали для обнаружения метки моноцитов и для того, чтобы убедиться, что процесс связывания не изменил магнитных свойств NP. Меченные SPIO клеточные фантомы изготавливали в виде 100 мкл 0,5×10⁶ клеток/мл, суспендированных в 100 мкл 2% агарозы в пластиковых пробирках объемом 200 мкл. В соответствии с результатами колориметрического феррозинового анализа, поглощение железа резко улучшалось, когда человеческие моноциты подвергались воздействию IgG-SPIO (фиг. 4). Максимальные уровни SPIO достигались после 4-часовой инкубации. Несмотря на этап окисления, релаксационные свойства IgG-SPIO сохранялись.

Пример 4

Поглощение частиц клетками

Для того, чтобы проверить влияние размеров и декстранового покрытия на поглощение клетками, SPIO, покрытые декстраном 100 кДа, размерами от 62 до 394 нм инкубировали с человеческими моноцитами в течение 1 часа при 37°С (фиг. 5А). Большее поглощение железа было выявлено у наиболее крупных NP с той же молекулярной массой декстрана. SPIO, покрытые декстраном 10 кДа (Feridex®), захватывались моноцитами на более высоком уровне, чем другие NP, покрытые декстраном 100 кДа. После 1-часовго окисления SPIO конъюгировали с различными концентрациями IgG (0,5, 1, 2 и 4 мг/мл), и каждый конъюгатный комплекс IgG-SPIO инкубировали с человеческими моноцитами в течение 0,5 и 1 часа при 37°С. Поглощение клетками IgG-SPIO, изготовленных с различными концентрациями IgG, не отличалось резко после инкубации с моноцитами в течение 0,5 и 1 часа (фиг. 5В). Указанные результаты предполагают, что или клеточная поверхность была насыщена SPIO, или что интернализация не зависит от плотности лиганда. Нековалентное присоединение IgG не вызывало усиленного поглощения в указанных специфических экспериментах (фиг. 5С). Тем не менее, пространственный барьер, образованный декстрановым покрытием железного ядра NP, смог предотвратить абсорбцию IgG. Поглощение IgG-SPIO частично ингибировалось, когда инкубацию осуществляли при 4°С (фиг. 5D). Затем сравнивали поглощение IgG-SPIO моноцитами и MDM и установили, что оно было практически равным для обоих типов клеток (фиг. 5Е). Результаты подтверждают идею о том, что сходные механизмы поглощения железа действовали в обоих клеточных типах. Для того, чтобы изучить механизм интернализации, IgG-SPIO и свободный IgG в концентрации 1 мг/мл инкубировали совместно с человеческими моноцитами (фиг. 5F). Не было выявлено значимой разницы после блокирования свободным IgG рецепторов Fc моноцитов. Указанные результаты предполагают, что механизм проникновения IgG-SPIO в клетку не зависит от рецепторов Fc. Для проверки указанной возможности человеческий сывороточный альбумин (HAS) ковалентно присоединяли к SPIO с использованием процедуры окисления/восстановления, идентичной процедуре, которая использовалась для конъюгации IgG. Подобно IgG, HAS достоверно увеличивал поглощение SPIO (фиг. 5G). Для того, чтобы подтвердить наблюдение, что поглощение частиц не зависит от рецептора Fc, заявители провели исследования по блокированию. Регрессионный анализ внутриклеточного поглощения железа IgG-SPIO и F(ab')₂-SPIO клетками MDM в течение 4 часов совместного культивирования не показал различий в кинетике поглощения (Р=0,271), что указывает на то, что присутствие части IgG Fc не дает значимых преимуществ для кинетики поглощения IgG-SPIO. Подобно этому, не наблюдалось различий в кинетике поглощения IgG-SPIO после обработки MDM человеческими фрагментами Fc, антителами против рецепторов-γ Fc (CD16/CD32/CD64) или изотипным контрольным антителом по сравнению с MDM, не подвергавшимися воздействию (Р=0,624). Кроме того, результаты, полученные с использованием человеческих MDM, были подтверждены на мышиных BMM, при использовании которых не наблюдалось различий в кинетике поглощения мышиных IgG-SPIO клетками BMM, обработанных мышиными фрагментами Fc, крысиными антимышиными рецепторами-γ Fc (CD16/CD32) или крысиным изотипным контрольным антителом, по сравнению с BMM, не подвергавшимися воздействию (Р=0,988). Указанные результаты подтвердили гипотезу о том, что интернализация IgG-SPIO не опосредуется рецепторами Fc. Несмотря на то, что интернализация HSA-SPIO была сходной с IgG-SPIO, содержание железа в человеческих моноцитах было выше в моноцитах, инкубированных с IgG-SPIO, чем с HSA-SPIO. Для того, чтобы проверить последнюю возможность, измерения физико-химических свойств SPIO, включая дзета-потенциал и размеры наночастиц, осуществляли в буфере HEPES при рН 7,4. Модификации HAS SPIO не влияли на их размер (фиг. 5Н). Помимо этого, дзета-потенциал NP не изменялся значимым образом после присоединения лиганда; таким образом, SPIO оставались отрицательно заряженными.

Пример 5

Визуализация распределения SPIO и IgG-SPIO в тканях мышей посредством МРТ

Самцов мышей BALB/c (Charles River Laboratory, Inc., MA) в возрасте 5-8 недель использовали во всех экспериментах. Животных помещали в стерильные микроизоляторные клетки и содержали в соответствии с этическим руководством по уходу за лабораторными животными университета медицинского центра Небраски и Национального института здоровья. Мышам инъецировали SPIO или IgG-SPIO в концентрации 12,5 мкг/0,2 мл на животное или 62,5 мкг/0,2 мл на животное внутривенно в хвостовую вену. Рекомендованная доза для взрослого человека или подростка составляет 560 мкг/кг. Две группы по 3-5 животных использовали для анализов in vivo. Группы, получавшие SPIO и IgG-SPIO, подвергали визуализации до инъекции, непрерывно в течение 4 часов после инъекции и снова через 24 часа. Мышам инъецировали в течение 24 часов следующий препарат конъюгированных SPIO.

Аккумуляция частиц SPIO в ткани вызывает увеличение магнитной спин-спиновой релаксивности (R2) тканевой воды, которая зависит от поля. Измерения спин-спиновой релаксивности с использованием двух систем 7T МРТ (Bruker 21 cm Biospec/16 cm Pharmascan systems operating Paravision 4.0) продемонстрировали в SPIO-меченных клеточных фантомах, что релаксивность прямо связана с плотностью клеток. Измерения релаксивности могут отследить клеточное поглощение и использовались для отслеживания миграции клеток в печень, почку и селезенку после инъекции. Слоевые мульти-эхо CPMG фазоциклированные Т2 картированные МРТ томограммы высокого разрешения мышиного тела были получены с использованием 25-мм спирали объема клетки для птиц, покрывающей область от шеи до бедер с приобретенными параметрами времени эхо-задержки (ТЕ) = 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 мсек, времени повтора (TR) = 4650 мсек, количества средних (NA)=4, поля зрения = 40×40 мм с разрешением 256×128 (воксел-размер = 156×312 мкм), реконструкция до 256×256, 50 перемежающихся непрерывных срезов 1 мм толщины, общее время приобретения = 39 минут. Интенсивность сигнала нормализовали до внешнего стандарта, принимая во внимание дрейф сигнала с течением времени. Аккумуляцию SPIO определяли по изменениям R2 (1/T2) в пределах выбранных областей, представляющих интерес. После инъекции SPIO или IgG-SPIO получали карты Т₂ каждые 40 минут в течение 4 часов и спустя 24 часа. Интенсивности областей, представляющих интерес, в селезенке, печени и почке от однородных эхо-сигналов (точно рефокусированные в CPMG фазоциклированные эхо-последовательности) соответствовали экспоненциальному затуханию с минимумом для соответствия уровню помех в изображениях. Качество данных мониторировали Т₂ определением внешних стандартов в каждом ряде изображений.

Изменение релаксивности (R₂=1/T₂) измеряли в селезенке (фиг. 6А и 7В), печени (фиг. 6С и 6D) и почке (фиг. 6E и 6F) после инъекции SPIO или IgG-SPIO в хвостовую вену мыши. Инъекции 12,5 мкг (фиг. 6А, 6С и 6Е) (n=6) и 62,5 мкг (фиг. 6В, 6D и 6F) (n=5) показывают более высокое поглощение в циркулирующих моноцитах с покрытием из IgG при более низкой концентрации, через 0,5 ч после инъекции и в последующие отрезки времени (p<0,05, двусторонние повторные измерения ANOVA на предмет влияния времени и типа SPIO для селезенки и печени). При более высокой дозе 62,5 мкг не наблюдалось никаких различий во всех временных точках в поглощении SPIO по сравнению с IgG-SPIO.

Пример 6

Гистологические оценки

Селезенки и печени собирали через 4 и 24 часа после введения SPIO или IgG-SPIO. Немедленно после МРТ ткани фиксировали реперфузией 4% параформальдегидом, проявляли после фиксации в течение 24 часов, заливали в парафин и нарезали на срезы толщиной 5 мкм для гистологического анализа. Для осуществления окрашивания прусским синим срезы депарафинизировали, регидратировали и подвергали взаимодействию в течение 30 минут в 2% ферроцианиде калия и 3,7% хлористоводородной кислоте для визуализации частиц трехвалентного железа с помощью прусского синего. Окрашенные срезы промывали и подвергали контрастному окрашиванию ядерным быстрым красным для получения гистологического клеточного распределения. Изображения получали с использованием цифровой камеры Optronics (Buffalo Grove, IL) с использованием компьютерной программы MagnaFire 2.0 (Goleta, CA) и обрабатывали с использованием компьютерной программы Adobe® Photoshop 7.0. Утрату сигнала от аккумуляции SPIO наблюдали в изображениях через 0,5 часа и 24 часов.

Поглощение SPIO наблюдалось в циркулирующих в крови моноцитах и тканевых макрофагах по результатам анализа образцов тканей селезенки и печени животных, которым инъецировали нанокомпозиции Alexa Fluor® 488 гидроксиламина IgG-SPIO, с последующими тестами МРТ.

Пример 7

Изготовление частиц паклитаксела с покрытием из IgG

Частицы кристаллического паклитаксела изготавливали осаждением лекарственного средства из смешивающегося с водой органического растворителя в водный раствор, содержавший поверхностно-активные агенты, с последующим этапом гомогенизации с использованием пистонного гомогенизатора. Поверхностно-активные агенты, которые использовались для предотвращения агрегации частиц, использовались в различных комбинациях, для получения наносуспензионных композиций РТХ-1, РТХ-2 и РТХ-3. Во все наносуспензии паклитаксела добавляли 10 мМ фосфатный буфер до получения рН 7,8-7,9. Средний размер частиц паклитаксела составлял от 150 до 300 нм, по результатам измерения с использованием рассеяния лазерного света (Horiba LA-920, относительный показатель преломления = 116A001I). Дзета-потенциал частиц паклитаксела измеряли с использованием 10 мМ буфера HEPES рН 7,4 в качестве разбавителя (Malvern Nano ZS). Величины дзета-потенциала суспензий паклитаксела до нанесения покрытия из IgG представлены в таблице 1.

Таблица 1
Композиция	Компоненты	Дзета-потенциал наносуспензий паклитаксела (РТХ), рН 7,4 (мВ)
РТХ-1	Полоксамер 188 дезоксихолат	-30,5
РТХ-2	Полоксамер 188 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-[фосфо-rac-(1-глицерин)] (DMPG)	-40,3
РТХ-3	Полоксамер 188 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин метоксиполиэтиленгликоль (DSPE-MPEG2000)	-22,7

Частицы паклитаксела с покрытием из человеческого IgG изготавливали инкубированием наносуспензий паклитаксела с растворами IgG при различных массовых соотношениях IgG:паклитаксел при комнатной температуре. Растворы IgG изготавливали разбавлением коммерчески доступного продукта (GAMMAGARD LIQUID 10%, Baxter Healthcare) 0,25 М глициновым буфером рН 5 до конечных концентраций IgG 50, 25, 10, 5 и 2,5 мг/мл. Для подтверждения того, что изменения дзета-потенциала, наблюдавшиеся после инкубации с IgG, происходят в результате абсорбции IgG, а не благодаря высокой ионной силе буферного раствора IgG, осуществляли также инкубирование только в глициновом буфере (без IgG).

Абсорбцию IgG изучали измерением дзета-потенциала смесей наносуспензий IgG. Измерения осуществляли при рН 5 и 7,4, с использованием 10 мМ глицинового буфера и 10 мМ буфера HEPES, соответственно, в качестве разбавителей. Использовали модель Smoluchowsky для расчета дзета-потенциалов по измеренной электрофоретической подвижности.

Фиг. 7 показывает результаты экспериментов по абсорбции композиций паклитаксела. Данные показывают, что для всех трех композиций на дзета-потенциал оказывало выраженное влияние присутствие IgG (линии проведены только для удобства глаза). При рН 5 IgG имеет результирующий положительный заряд (изоэлектрическая точка = 6,9-7,3), в то время как частицы лекарственного средства заряжены отрицательно. Все три суспензии показывают дзета-потенциал, близкий к нулю, при измерении при рН 7,4, незначительно выше изоэлектрической точки IgG. При указанной величине рН дзета-потенциал все еще значительно отличается от величин для частиц без покрытия, что указывает на то, что IgG все еще абсорбирован на поверхности.

Влияние абсорбции IgG на физическую стабильность суспензии определяли наблюдением под микроскопом при увеличении в 400 раз. Для некоторых наносуспензионных композиций инкубирование с IgG приводило к агрегации частиц лекарственного средства. В отношении указанных композиций была предложена гипотеза о том, что абсорбция IgG приводит к таким уровням поверхностного заряда на частицах, которые являются недостаточными для обеспечения электростатической стабилизации суспензии.

Пример 8

Изготовление частиц ритонавира с покрытием из IgG

Частицы кристаллического ритонавира изготавливали гомогенизацией кристаллов лекарственного средства в присутствии водного раствора, содержавшего DSPE-MPEG (2000) с добавлением 10 мМ фосфатного буфера до получения рН 7,7. Средний размер частиц составлял приблизительно 0,5 микрон, по результатам измерения с использованием рассеяния лазерного света (Horiba LA-920, относительный показатель преломления = 120A010I). Дзета-потенциал указанной суспензии составлял -49,8 мВ с использованием 1 мМ буфера HEPES рН 7,4 в качестве разбавителя (Malvern Nano ZS, модель Smoluchowsky).

Частицы ритонавира с покрытием из человеческого IgG изготавливали инкубированием суспензий ритонавира с растворами IgG. Массовое соотношение IgG: ритонавир изменяли разбавлением раствора IgG глициновым буфером, как описано в примере 7, или изменением объемного отношения суспензии ритонавира к неразбавленному (100 мг/мл) раствору IgG.

Измерения дзета-потенциала осуществляли при рН 5 и 7,4, с использованием 10 мМ глицинового буфера и 1 мМ буфера HEPES, соответственно, в качестве разбавителей. Измеряли рН разбавленных образцов в буфере рН 7,4, чтобы подтвердить, что добавление смеси суспензия/IgG существенно не изменяет рН буфера. Данные по дзета-потенциалу, полученные в результате двух подходов к покрытию из IgG, как было установлено, вполне соответствовали друг другу (фиг. 8). Агрегацию частиц ритонавира с покрытием из IgG оценивали в соответствии с процедурой, описанной в примере 7. При наблюдении под микроскопом агрегация не была выявлена при всех массовых соотношениях IgG:ритонавир.

Пример 9

Изготовление частиц индинавира с покрытием из IgG

Частицы кристаллического индинавира изготавливали гомогенизацией кристаллов лекарственного средства в присутствии водного раствора, содержавшего полоксамер 188 и 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин метоксиполиэтиленгликоль (DSPE-MPEG2000), с добавлением 10 мМ буфера HEPES до получения рН 7,8. Средний размер частиц составлял приблизительно 0,9 микрон, по результатам измерения с использованием рассеяния лазерного света (Horiba LA-920, относительный показатель преломления = 108A000I).

Частицы индинавира с покрытием из человеческого IgG изготавливали инкубированием суспензии индинавира с неразбавленным GAMMAGARD LIQUID 10% (Baxter Healthcare). Процедура включала в себя объединение 0,5 мл 2,22% (масс./об.) суспензии индинавира (эквивалентно 11,1 мг лекарственного средства) с 0,33 мл 10% раствора IgG, с достижением массового соотношения IgG:индинавир 3:1.

Параллельно изготавливали частицы индинавира с покрытием из мышиного IgG инкубированием суспензии индинавира с мышиным IgG (Sigma). Лиофилизированный мышиный IgG (10 мг) разводили 1 мл 0,9% раствором хлорида натрия. 0,15 мл суспензии индинавира затем переносили во флакон для достижения массового соотношения IgG:индинавир 3:1. Наблюдение под микроскопом при увеличении в 400 раз показало, что частицы не агрегировали в присутствии как человеческого, так и мышиного IgG.

Дзета-потенциал измеряли с использованием 1 мМ буфера HEPES рН 7,4 в качестве разбавителя (Malvern Nano ZS, модель Smoluchowsky). Результаты представлены в таблице 2. Значительное уменьшение отрицательного поверхностного заряда для суспензий, инкубированных с растворами IgG, является показателем абсорбции IgG на поверхности частиц.

Таблица 2
Композиция	Дзета-потенциал суспензии индинавира (IDV), рН 7,4 (мВ)
Суспензия IDV	-45,4
Суспензия IDV + человеческий IgG	-1,78
Суспензия IDV + мышиный IgG	-6,96

Пример 10

Изготовление частиц целекоксиба с покрытием из IgG

Частицы кристаллического целекоксиба изготавливали осаждением из органического растворителя с последующей гомогенизацией (СХВ-2) или прямой гомогенизацией кристаллов лекарственного средства (СХВ-1, СХВ-3). Частицы изготавливали с использованием водных растворов, содержавших поверхностно-активные агенты, с добавлением 10 мМ фосфатного буфера до получения рН 7,5-7,8. Частицы целекоксиба с покрытием из человеческого IgG изготавливали с использованием 10% раствора IgG, согласно процедуре, описанной в примере 7.

Компоненты композиций, объемно-массовые измерения средних размеров частиц и измерения дзета-потенциала для суспензий целекоксиба представлены в таблице 3. Размер частиц измеряли с использованием рассеяния лазерного света (Horiba LA-920, относительный показатель преломления = 119A001I). Дзета-потенциал измеряли с использованием 10 мМ (СХВ-1, СХВ-2) или 1 мМ (СХВ-3) буфера HEPES рН 7,4 в качестве разбавителя (Malvern Nano ZS, модель Smoluchowsky). Уменьшение отрицательного поверхностного заряда для суспензий, инкубированных с раствором IgG, является показателем абсорбции IgG на поверхности частиц.

Таблица 3
Композиция	Компоненты	Дзета-потенциал наносу-спензий целекок-сиба без покрытия, рН 7,4 (мВ)	Дзета-потенциал наносу-спензий целекок-сиба с покрытием из IgG, рН 7,4 (мВ)	Средний размер частиц (нм)
СХВ-1	Липоид Е80 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-[фосфо-rac-(1-глицерин)] (DMPG)	-69,9	-0,663	1220
СХВ-2	Полоксамер 188 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин метоксиполиэти-ленгликоль (DSPE-MPEG2000)	-21,7	-4,87	315
СХВ-3	Полоксамер 188 Полисорбат 80	-20,6	-8,18	988

Пример 11

Поглощение частиц паклитаксела с покрытием из IgG

Частицы паклитаксела с флюоресцентной меткой изготавливали с использованием 0,5 г паклитаксела и 400 мкг паклитаксела, меченного Oregon зеленым (от компании Invitrogen). На частицы паклитаксела с флюоресцентной меткой (размер приблизительно от 160 нм до 170 нм) наносили покрытие посредством добавления 0,2 мл 10% раствора иммуноглобулина для внутривенного введения (IVIG) к 0,1 мл суспензии паклитаксела. На частицы паклитаксела с флюоресцентной меткой также наносили покрытие из протамина посредством добавления 0,8 мл раствора протамина с концентрацией 25 мг/мл к 0,1 мл суспензии паклитаксела.

Кинетика поглощения наносуспензий паклитаксела показана на фиг. 9 и фиг. 10 (результаты представлены как процентные доли клеток, положительных по паклитакселу, после поглощения наносуспензией и MFI связанных с клетками/интернализированных частиц). Покрытие из IgG улучшало поглощение частиц по сравнению с необработанными частицами.

Фиг. 11 показывает поглощение моноцитами наносуспензий паклитаксела с покрытием из IgG после 1, 2 или 6 дней культивирования. Результаты показывают, что чем дольше культивируются клетки, тем больше они чувствительны к IgG.

В то время как конкретные варианты осуществления настоящего изобретения проиллюстрированы и описаны, многочисленные модификации возможны без отступления от идеи изобретения, а объем защиты ограничивается только объемом прилагающейся формулы изобретения.

1. Фармацевтическая суспензия, содержащая поверхностно-модифицированную частицу; указанная поверхностно-модифицированная частица содержит ядро частицы и покрытие, связанное с ядром частицы; указанное покрытие абсорбировано на поверхности ядра частицы, в которых ядро частицы содержит терапевтический агент, покрытие содержит опсонин, поверхностно-модифицированная частица имеет средний размер приблизительно от 1 до 2000 нм, и указанный опсонин выбран из белков или пептидов, которые связываются с частицами или клетками таким образом, что повышается подверженность указанных частиц или клеток фагоцитозу, где pH суспензии находится ниже изоэлектрической точки опсонина.

2. Суспензия по п.1, в которой опсонин представляет собой антитело или комплементный белок.

3. Суспензия по п.2, в которой опсонин выбран из группы, состоящей из антитела, имеющего изотип IgG, комплементного белка C3b и комплементного белка C5.

4. Суспензия по п.3, в которой покрытие дополнительно содержит поверхностно-активный агент.

5. Суспензия по п.4, в которой поверхностно-активный агент выбран из группы, состоящей из анионогенных поверхностно-активных агентов, катионогенных поверхностно-активных агентов, цвиттерионных поверхностно-активных агентов, неионогенных поверхностно-активных агентов, поверхностно-активных биологических модификаторов и их комбинаций.

6. Суспензия по п.4, в которой поверхностно-активный агент содержит по меньшей мере один из полоксамера и фосфолипида.

7. Суспензия по любому из пп.1-6, в которой терапевтический агент выбран из группы, состоящей из анальгетиков, анестетиков, аналептиков, адренергических агентов, адреноблокаторов, адренолитиков, адренокортикоидов, адреномиметиков, антихолинергических агентов, антихолинэстеразных агентов, противосудорожных агентов, алкилирующих агентов, алкалоидов, аллостерических ингибиторов, анаболических стероидов, анорексиантов, антацидов, агентов против диареи, антидотов, антифолатов, жаропонижающих агентов, противоревматических агентов, психотерапевтических агентов, нейроблокирующих агентов, противовоспалительных агентов, противоглистных агентов, антибиотиков, антикоагулянтов, антидепрессантов, противоэпилептических агентов, противогрибковых агентов, антиинфекционных агентов, противопаразитарных агентов, антигистаминных агентов, антимускариновых агентов, антимикобактериальных агентов, антинеопластических агентов, антипротозойных агентов, противовирусных агентов, анксиолитических седативных агентов, бета-адреноблокаторов, кортикостероидов, агентов, подавляющих кашель, дофаминергических агентов, гемостатиков, гематологических агентов, снотворных, иммунологических агентов, мускариновых агентов, парасимпатомиметиков, простагландинов, радиофармацевтических агентов, седативных агентов, стимуляторов, симпатомиметиков, витаминов, ксантинов, факторов роста, гормонов, антиприонных агентов и их комбинаций.

8. Суспензия по любому из пп.1-6, в которой терапевтический агент представляет собой антинеопластический агент, выбранный из группы, состоящей из пакситаксела, производных пакситаксела, алкалоидов, антиметаболитов, ингибиторов ферментов, алкилирующих агентов и их комбинаций.

9. Суспензия по любому из пп.1-6, в которой терапевтический агент представляет собой ингибитор протеаз.

10. Суспензия по п.9, в которой ингибитор протеаз выбран из группы, состоящей из индинавира, ритонавира, саквинавира, нелфинавира и их комбинаций.

11. Суспензия по любому из пп.1-6, в которой терапевтический агент представляет собой нуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы.

12. Суспензия по п.11, в которой нуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы выбран из группы, состоящей из зидовудина, диданозина, ставудина, зальцитабина, ламивудина и их комбинаций.

13. Суспензия по любому из пп.1-6, в которой терапевтический агент представляет собой ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы.

14. Суспензия по п.13, в которой ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы выбран из группы, состоящей из эфавиренца, невирапина, делавирадина и их комбинаций.

15. Суспензия по любому из пп.1-6, в которой терапевтический агент представляет собой противовоспалительный агент.

16. Суспензия по п.15, в которой противовоспалительный агент выбран из группы, состоящей из нестероидных противовоспалительных лекарственных средств, неселективных ингибиторов циклооксигеназы (COX), ингибиторов COX-1, ингибиторов COX-2, ингибиторов липоксигеназы, кортикостероидов, антиоксидантов, ингибиторов фактора некроза опухолей (TNF) и их комбинаций.

17. Суспензия по любому из пп.1-6, в которой терапевтический агент выбран из группы, состоящей из целекоксиба, рофекоксиба, вальдекоксиба, парекоксиба, лумиракоксиба, эторикоксиба и их комбинаций.

18. Суспензия по любому из пп.1-6, в которой терапевтический агент представляет собой биологический агент.

19. Суспензия по п.18, в которой биологический агент выбран из группы, состоящей из белков, полипептидов, углеводов, полинуклеотидов, нуклеиновых кислот и комплексов, конъюгатов и их комбинаций.

20. Фармацевтическая композиция, содержащая суспензию по любому из пп.1-19.

21. Композиция по п.20, в которой суспензия содержит терапевтический агент, который представляет собой фармацевтическое соединение.

22. Способ усиления поглощения клетками активного агента, предусматривающий:
контактирование клеток с поверхностно-модифицированными частицами в условиях, достаточных для усиления поглощения клетками поверхностно-модифицированных частиц; указанные поверхностно-модифицированные частицы содержат ядро частицы и покрытие, связанное с ядром частицы; указанное покрытие абсорбировано на поверхности ядра частицы, в котором ядро частицы содержит активный агент, покрытие содержит опсонин; указанное покрытие абсорбировано на поверхности ядра частицы путем контактирования ядра частицы с раствором, содержащим опсонин, в котором рН раствора находится ниже изоэлектрической точки опсонина, поверхностно-модифицированная частица имеет средний размер приблизительно от 1 до 2000 нм, и указанный опсонин выбран из белков или пептидов, которые связываются с частицами или клетками таким образом, что повышается подверженность указанных частиц или клеток фагоцитозу.

23. Способ по п.22, в котором клетки представляют собой фагоцитарные клетки.

24. Способ по п.23, в котором клетки представляют собой фагоцитарные клетки, выбранные из группы, состоящей из макрофагов, моноцитов, гранулоцитов, агранулоцитов, нейтрофилов и их комбинаций.

25. Способ по любому из пп.22-24, в котором указанное контактирование осуществляют ex vivo.

26. Применение поверхностно-модифицированных частиц для изготовления лекарственного средства для лечения инфекционных заболеваний или расстройств, воспалительных заболеваний или расстройств, нейродегенеративных заболеваний или расстройств или пролиферативных заболеваний или расстройств; указанные поверхностно-модифицированные частицы содержат ядро частицы и покрытие, связанное с ядром частицы; указанное покрытие абсорбировано на поверхности ядра частицы, в котором ядро частицы содержит терапевтический агент, покрытие содержит опсонин; указанное покрытие абсорбировано на поверхности ядра частицы путем контактирования ядра частицы с раствором, содержащим опсонин, в котором pH раствора находится ниже изоэлектрической точки опсонина, поверхностно-модифицированная частица имеет средний размер приблизительно от 1 до 2000 нм, и указанный опсонин выбран из белков или пептидов, которые связываются с частицами или клетками таким образом, что повышается подверженность указанных частиц или клеток фагоцитозу.

27. Применение по п.26, в котором поверхностно-модифицированные частицы являются подходящими для введения внутривенно, интраартериально, внутримышечно, подкожно, внутрикожно, внутрисуставно, интратекально, эпидурально, интрацеребрально, интраперитонеально, внутриглазным путем или с помощью их комбинаций.

28. Применение по п.26, в котором нейродегенеративное заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, рассеянного склероза, энцефаломиелита, энцефалита, болезни Хантингтона, бокового амиотрофического склероза, фронтотемпоральной деменции, прионных заболеваний, болезни Крейтцфельда-Якоба и адренолейкодистрофии.

29. Применение по п.26, в котором воспалительное заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из ревматоидного артрита, болезни Грейвза, астенического бульбарного паралича, тиреоидита, диабета, воспалительного заболевания кишечника, аутоиммунного оофорита, системной красной волчанки и синдрома Шенгрена.

30. Применение по п.26, в котором пролиферативное заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из рака толстого кишечника, рака почки, немелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, рака шейки матки, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака головного мозга, саркомы, меланомы, лейкоза, острого лимфолейкоза, острого миелолейкоза, хронического лимфолейкоза, хронического миелолейкоза, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, миеломы и глиобластомы.

31. Применение по п.27, в котором нейродегенеративное заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, рассеянного склероза, энцефаломиелита, энцефалита, болезни Хантингтона, бокового амиотрофического склероза, фронтотемпоральной деменции, прионных заболеваний, болезни Крейтцфельда-Якоба и адренолейкодистрофии.

32. Применение по п.27, в котором воспалительное заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из ревматоидного артрита, болезни Грейвза, астенического бульбарного паралича, тиреоидита, диабета, воспалительного заболевания кишечника, аутоиммунного оофорита, системной красной волчанки и синдрома Шенгрена.

33. Применение по п.27, в котором пролиферативное заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из рака толстого кишечника, рака почки, немелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, рака шейки матки, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака головного мозга, саркомы, меланомы, лейкоза, острого лимфолейкоза, острого миелолейкоза, хронического лимфолейкоза, хронического миелолейкоза, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, миеломы и глиобластомы.

34. Применение по любому из пп.26-33, в котором терапевтический агент представляет собой фармацевтическое соединение.

35. Способ изготовления поверхностно-модифицированной частицы, содержащей ядро частицы и покрытие, содержащее опсонин, связанное с ядром частицы; указанное покрытие абсорбировано на поверхности ядра частицы, где способ предусматривает:
контактирование ядра частицы с раствором, содержащим опсонин, в котором pH раствора находится ниже изоэлектрической точки опсонина, ядро частицы содержит терапевтический агент, поверхностно-модифицированная частица имеет средний размер приблизительно от 1 до 2000 нм, и опсонин выбран из белков или пептидов, которые связываются с частицами или клетками таким образом, что повышается подверженность указанных частиц или клеток фагоцитозу.