Мoдифицированные протеазы

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой выделенный модифицированный полинуклеотид, кодирующий модифицированную полноразмерную протеазу. При этом часть указанного модифицированного полинуклеотида, которая кодирует про-участок указанной полноразмерной протеазы, содержит мутацию, кодирующую замену в одном аминокислотном положении, выбранном из положений, эквивалентных аминокислотным положениям 28-108 и 109 SEQ ID NO:5, 13 или 244, где указанный полинуклеотид имеет нуклеотидную последовательность, идентичную, по меньшей мере, приблизительно на 95% полинуклеотидной последовательности SEQ ID NО:4, 12 или 243 с учетом вырожденности генетического кода, где указанная модифицированная полноразмерная протеаза представляет собой сериновую протеазу, где указанная модифицированная полноразмерная протеаза представляет собой щелочную сериновую протеазу, полученную из предшественника щелочной сериновой протеазы дикого типа, где указанный предшественник щелочной сериновой протеазы представляет собой щелочную сериновую протеазу В. clausii или В. lentus, и где указанная модифицированная полноразмерная протеаза имеет повышенную активность продукции по сравнению с полипептидом указанного предшественника. Изобретение позволяет расширить арсенал высокоэффективных протеаз. 5 н. и 11 з.п. ф-лы, 9 ил., 2 табл., 4 пр.

 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

1. Выделенный модифицированный полинуклеотид, кодирующий модифицированную полноразмерную протеазу, где часть указанного модифицированного полинуклеотида, которая кодирует проучасток указанной полноразмерной протеазы, содержит мутацию, кодирующую замену в одном аминокислотном положении, выбранном из положений, эквивалентных аминокислотным положениям 28-108 и 109 SEQ ID NO:5, 13 или 244,
где указанный полинуклеотид имеет нуклеотидную последовательность, идентичную, по меньшей мере, приблизительно на 95% полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO:4, 12 или 243 с учетом вырожденности генетического кода,
где указанная модифицированная полноразмерная протеаза представляет собой сериновую протеазу,
где указанная модифицированная полноразмерная протеаза представляет собой щелочную сериновую протеазу, полученную из предшественника щелочной сериновой протеазы дикого типа,
где указанный предшественник щелочной сериновой протеазы представляет собой щелочную сериновую протеазу В. clausii или В. Lentus, и
где указанная модифицированная полноразмерная протеаза имеет повышенную активность продукции по сравнению с полипептидом указанного предшественника.

2. Выделенный модифицированный полинуклеотид по п.1, где полинуклеотид, кодирующий протеазу-предшественника, имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO:1, 9 или 240.

3. Выделенный модифицированный полинуклеотид по п.1, где указанная часть указанного модифицированного полинуклеотида, которая кодирует проучасток, содержит мутацию, кодирующую замену, по меньшей мере, в одном аминокислотном положении, выбранном из Е33, Е43, А44, Е47, V49, Е57, А59, Е63, Е70, Е74, Е84 и Е88 SEQ ID NO:5, 13 или 244.

4. Выделенный модифицированный полинуклеотид по п.3, где указанная замена Е33 выбрана из E33D, E33I, E33S, E33N, Е33К, Е33Н, E33Q и E33R.

5. Выделенный модифицированный полинуклеотид по п.3, где указанная замена Е57 выбрана из E57F, E57W, Е57К, E57R, E57D, Е57М, Е57С, E57Q, E57S, Е57Н, E57N и E57G.

6. Выделенный модифицированный полинуклеотид по п.1, где указанная мутация, кодирующая замену, по меньшей мере, в одном аминокислотном положении, выбранном из положений, эквивалентных аминокислотным положениям 28-108 и 109 SEQ ID NO:5, 13 или 244, кодирует замену, выбранную из группы, состоящей из: A28Q, А28Т, Е29Т, E29Y, E29V, E29Q, Е29К, Е29М, Е29Р, E29N, E29S, E29G, Е29А, E30Q, Е30К, Е30М, Е30А, E30G, E30R, E30S, Е30Н, E30N, Е30Т, A31R, A31G, A31S, А31К, А31Р, E33R, E33Q, E33G, Е33Н, E33N, E33S, E33D, E33I, Е33К, Е33М, K34R, N40V, N40K, N40E, N40Q, N40H, N40Y, N40T, N40A, N40L, N40W, N40F, N40R, Е41А, E41S, E41N, Е41Т, Е41Н, E41R, Q42M, Q42R, Q42P, Q42W, E43S, E43R, E43D, Е43Н, Е43А, A44D, A44Q, А44Е, A44S, V45L, V45A, V45C, S46H, S46R, S46T, S46A, S46Q, S46Y, S46W, E47D, E47R, Е47К, E47Q, Е47Н, F48W, V49G, Е50Н, Q51M, Q51R, V52L, V52W, Е53А, Е53К, E53R, Е53Н, A54L, A54S, D56G, D56S, D56K, D56R, E57N, Е57Н, E57S, E57G, E57Q, Е57С, Е57М, E57D, E57R, Е57К, E57W, E57F, V58R, V58Y, V58H, V58M, V58K, V58C, V58L, V58A, V58F, A59R, A59Y, A59V, A59I, A59F, A59W, А59М, A59L, А59Н, I60L, L61M, L61T, L61A, L61I, L61V, L61G, L61P, L61D, S62V, S62W, S62M, S62P, S62N, S62H, S62Q, S62D, S62G, S62I, S62A, S62L, S62C, S62R, S62T, Е63А, E63G, E63D, E63R, Е63Т, E63Q, Е63С, Е63К, .Е63Н, E63I, E63S, Е64Т, E64R, E64S, Е64А, Е65М, E65R, E65Q, Е65А, E65V, E65Y, E66S, Е66А, Е66Т, Е66Р, E66R, E66Y, Е66К, E66G, E66V, Е66М, E66Q, V67I, Е68К, E68Q, I69V, Е70Т, E70R, E70N, E70S, E70V, L71V, L71I, E74Q, E74R, E74V, Е74К, Е74А, E74I, F75Y, Е76К, E76S, Е76Т, Е76Н, E76N, E76D, T77N, Т77Н, I78T, S82L, S82Q, S82V, V83N, V83Y, E84L, Е84К, E84V, Е84М, E84S, Е84А, E84G, Е84Т, E84R, E84F, E84Q, L85F, S86R, S86D, S86K, S86N, S86A, Е88Р, E88D, D89K, D89H, D91E, D91P, D91A, D91T, D91N, D91K, D91W, D91R, D91F, A92R, А92К, А92Т, А92М, A92V, A92Q, A92I, A92L, A92S, Е94А, Е94М, Е94Т, E94R, E94S, E94L, L95E, L95R, L95K, L95S, L95C, L95A, L95T, L95D, L95G, L95V, L95H, D96Y, D96H, D96C, D96S, D96L, D96E, D96I, D96W, D96Y, A98R, A98K, A98D, A98L, S100A, E103T, E103P, E104P, A106F, A106K, A106V, A106L, A106M, E107Q, E107P, T109Y, T109E, T109G, T109N, T109S, T109M, T109R, T109Q и T109W.

7. Выделенный модифицированный полинуклеотид по п.6, где указанная мутация кодирует, по меньшей мере, одну замену указанных положений SEQ ID NO:13.

8. Вектор экспрессии, содержащий модифицированный полинуклеотид по п.1.

9. Клетка-хозяин, способная экспрессировать экзогенный генетический материал, трансформированная вектором по п.8,
где необязательно указанная клетка-хозяин представляет собой микроорганизм,
и где необязательно указанная клетка-хозяин представляет собой микроорганизм, выбранный из группы, состоящей из Bacillus sp., Streptomyces sp., Escherichia sp.H Aspergillus sp.

10. Клетка-хозяин по п.9, где указанная клетка-хозяин представляет собой клетку В. subtilis.

11. Протеаза, продуцируемая клеткой-хозяином по п.9.

12. Способ получения гетерологичной протеазы в микроорганизме, включающий стадии:
(a) культивирования клетки-хозяина Bacillus в пригодных условиях, где клетка-хозяин Bacillus содержит модифицированный полинуклеотид по п.1, кодирующий модифицированную протеазу; и
(b) позволения микроорганизму продуцировать указанную протеазу,
где необязательно указанную гетерологичную протеазу, продуцируемую указанным хозяином Bacillus, выделяют.

13. Способ по п.12, где указанная модифицированная протеаза содержит мутацию, соответствующую аминокислотной замене, выбранной из E33D, E33I, E33S, E33N, Е33К, Е33Н, E33Q, E33R, E57F, E57W, Е57К, E57R, E57D, Е57М, Е57С, E57Q, E57S, Е57Н, E57N и E57G.

14. Способ по п.12, где указанная клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из В. licheniformis, В. lentus, В. subtilis, В. amyloliquefaciens, В. brevis, В. stearothermophilus,, В. clausii, В. alkalophilus, В. halodurans, В. coagulans, В. circulans, В. pumilus и В. Thuringiensis,
где необязательно указанная гетерологичная протеаза представляет собой протеазу В. clausii или В. lentus.

15. Способ по п.12, где указанная гетерологичная протеаза обладает отношением продукции, равным, по меньшей мере, 1.

16. Способ по п.12, где указанная модифицированная протеаза содержит мутацию, соответствующую аминокислотной замене, выбранной из группы, состоящей из: A28Q, А28Т, Е29Т, E29Y, E29V, E29Q, Е29К, Е29М, Е29Р, E29N, E29S, E29G, E29A, E30Q, Е30К, Е30М, Е30А, E30G, E30R, E30S, Е30Н, E30N, Е30Т, A31R, A31G, A31S, А31К, А31Р, E33R, E33Q, E33G, Е33Н, E33N, E33S, E33D, E33I, Е33К, Е33М, K34R, N40V, N40K, N40E, N40Q, N40H, N40Y, N40T, N40A, N40L, N40W, N40F, N40R, Е41А, E41S, E41N, Е41Т, Е41Н, E41R, Q42M, Q42R, Q42P, Q42W, E43S, E43R, E43D, Е43Н, Е43А, A44D, A44Q, А44Е, A44S, V45L, V45A, V45C, S46H, S46R, S46T, S46A, S46Q, S46Y, S46W, E47D, E47R, Е47К, E47Q, Е47Н, F48W, V49G, Е50Н, Q51M, Q51R, V52L, V52W, Е53А, Е53К, E53R, Е53Н, A54L, A54S, D56G, D56S, D56K, D56R, E57N, Е57Н, E57S, E57G, E57Q, Е57С, Е57М, E57D, E57R, Е57К, E57W, E57F, V58R, V58Y, V58H, V58M, V58K, V58C, V58L, V58A, V58F, A59R, A59Y, A59V, A59I, A59F, A59W, А59М, A59L, А59Н, I60L, L61M, L61T, L61A, L61I, L61V, L61G, L61P, L61D, S62V, S62W, S62M, S62P, S62N, S62H, S62Q, S62D, S62G, S62I, S62A, S62L, S62C, S62R/S62T, E63A, E63G, E63D, E63R, E63T, E63Q, E63C, E63K, E63H, E63I, E63S, E64T, E64R, E64S, E64A, E65M, E65R, E65Q, E65A, E65V, E65Y, E66S, E66A, E66T, E66P, E66R, E66Y, E66K, E66G, E66V, E66M, E66Q, V67I, E68K, E68Q, I69V, E70T, E70R, E70N, E70S, E70V, L71V, L71I, E74Q, E74R, E74V, E74K, E74A, E74I, F75Y, E76K, E76S, E76T, E76JH, E76N, E76D, T77N, T77H, I78T, S82L, S82Q, S82V, V83N, V83Y, E84L, E84K, E84V, E84M, E84S, E84A, E84G, E84T, E84R, E84F, E84Q, L85F, S86R, S86D, S86K, S86N, S86A, E88P, E88D, D89K, D89H, D91E, D91P, D91A, D91T, D91N, D91K, D91W, D91R, D91F, A92R, A92K, A92T, A92M, A92V, A92Q, A92I, A92L, A92S, E94A, E94M, E94T, E94R, E94S, E94L, L95E, L95R, L95K, L95S, L95C, L95A, L95T, L95D, L95G, L95V, L95H, D96Y, D96H, D96C, D96S, D96L, D96E, D96I, D96W, D96V, A98R, A98K, A98D, A98L, S100A, E103T, E103P, E104P, A106F, A106K, A106V, A106L, A106M, E107Q, E107P, T109Y, T109E, T109G, T109N, T109S, T109M, T109R, T109Q и T109W,
и где необязательно указанная мутация кодирует, по меньшей мере, одну замену указанных положений SEQ ID NO:13.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии. .
Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий, устойчивого к стрептомицину продуценту щелочной внеклеточной рибонуклеазы.

Изобретение относится к области энзимологии и белковой инженерии и может быть использовано в различных отраслях народного хозяйства, которые производят продукцию, содержащую добавки фермента с протеолитической активностью.

Изобретение относится к области генной и белковой инженерии и может быть использовано при создании новых моющих средств и очищающих составов. .

Изобретение относится к неприродным вариантам карбонилгидролаз, имеющим измененные протеолитическую активность, стабильность, субстратную специфичность, pH-профиль и/или физико-химические свойства по сравнению с предшественником карбонилгидролазы, из аминокислотной последовательности которого получают аминокислотную последовательность того или иного варианта.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, к производству ферментов и касается нового штамма бактерий, продуцирующего внеклеточную протеинаду с тромболитическим действием.

Изобретение относится к аналитической химии ферментов и представляет собой способ количественного определения каталитически активных молекул сериновых протеиназ бацилл.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа мытья посуды. Охарактеризованный способ заключается в обеспечении композиции для мытья посуды и посуды, нуждающейся в очистке, приведении указанной посуды в контакт с указанной композицией для мытья посуды при условиях, эффективно обеспечивающих очистку указанной посуды, где указанная композиция для мытья посуды содержит модифицированный субтилизин, где указанный модифицированный субтилизин, по меньшей мере, на 70% гомологичен последовательности AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR и содержит (i) замену G116V и, по меньшей мере, одну дополнительную мутацию или (ii) замену S126R. Представленное изобретение позволяет удалять белковые загрязнения на посуде с высокой эффективностью, является безопасным для потребителей и окружающей среды. 5 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 ил., 6 пр.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен вариант термолизина, обладающий повышенной эффективностью по сравнению с термолизином дикого типа. При этом указанный вариант термолизина содержит замену, выбранную из T006G, F063P, T006H, S065K, T006I, S065Y, T006K, Y075G, T006M, Y075M, T006N, Y075T, T006P, Q128H, T006Q, Q128I, T006R, Q128L, T006V, Q128M, T006W, Q128V, T006Y, Q128Y, V007F, Y151D, V007H, Y151E, V007K, Y151H, V007L, Y151K, V007M, Y151M, V007P, Y151N, V007Q, Y151Q, V007R, Y151R, V007T, Y151T, V007Y, Y151V, T049G, T049H, I156M, T049I, I156R, T049K, I156T, T049L, I156W, T049N, G196R, T049P, Q273I, T049Q, Q273P, T049W, Q273Y, A058I, T278K, A058P, T278M, A058R, T278P, F063I, N280K, F063L, N280R. Термолизин получают трансформацией Bacillus sp. экспрессионным вектором, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариант термолизина, и культивированием трансформированной клетки-хозяина в условиях, подходящих для продуцирования указанного термолизина. Данный фермент используют в составе чистящей композиции для очистки поверхностей или изделий. Изобретения обеспечивают получение варианта термолизина с повышенной эффективностью. 4 н. и 51 з.п. ф-лы, 9 ил., 3 табл., 8 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой варианты субтилизина, сохраняющие его активность. Изобретение относится также к чистящей композиции, содержащей вариант субтилизина, и к способу очистки поверхности и/или изделия, включающего ткань, с помощью указанной композиции. Изобретение позволяет получить эффективные в очистке варианты субтилизина. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 6 ил., 13 табл., 8 пр.

Настоящее изобретение относится к биохимии и представляет собой детергентную композицию, которая включает вариант субтилизина, имеющий аминокислотную последовательность, которая приведена в SEQ ID NO 1, и по меньшей мере один дополнительный ингредиент, выбранный из: i) средств для отбеливания, которые выбраны из перкарбонатов, персульфатов и органических надкислот, ii) аминокарбоксилатов, или iii) сульфированных полимеров, или iv) фосфорорганических кислот или их солей и их смесей. Изобретение также относится к способу удаления или уменьшения загрязнений белковоподобных веществ с поверхностей, имеющих подобные загрязнения, с использованием указанной композиции. Указанная композиция дает хорошие результаты при удалении загрязнений белковоподобных веществ, даже в составах с щелочными значениями рН. 2 н. и 18 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой выделенный вариант субтилизина Bacillus. Изобретение относится также к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей вариант субтилизина, вектору экспрессии, содержащему нуклеиновую кислоту, клетке-хозяину, способной экспрессировать вариант субтилизина, а также к чистящей композиции, содержащей вариант субтилизина и способу очистки. Изобретение позволяет получать вариант субтилизина с улучшенными моющими свойствами. 7 н. и 8 з.п. ф-лы, 17 табл., 17 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой вариант субтилизина для применения в очистке, представляющий собой последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 5. Изобретение относится также к чистящей композиции, включающей эффективное количество варианта субтилизина, к способу чистки, включающему обеспечение предмета для чистки, и композиции, включающей вариант субтилизина, указанный в SEQ ID NO: 5, и приведение в контакт указанного предмета и указанной композиции. Изобретение позволяет получить эффективный вариант субтилизина с высокой моющей способностью. 3 н. и 11 з.п. ф-лы, 19 табл., 14 пр.

Изобретение относится к области микробиологии и касается применения штамма Bacillus cereus ГИСК №279 в качестве продуцента ингибитора цитокина ФНО-α. Штамм выделен из испражнений пациента с дисбактериозом кишечника и депонирован в Коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича под регистрационным номером 279. Изобретение может быть использовано для продуцирования ингибитора цитокина ФНО-α. 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области биохимии. Представлено применение модифицированной протеазы в качестве средства для повышения стабильности при хранении амилазы в жидком моющем или чистящем средстве, включающем амилазу и протеазу. Изобретение обеспечивает пониженную дезактивацию амилазы посредством вышеуказанной протеазы, тем самым, позволяя сохранить высокую амилолитическую активность в указанном моющем или чистящем средстве даже после 8 недель хранения. 6 з.п. ф-лы, 3 табл., 1 пр.

Изобретение относится к биохимии. Конкретно к потребительским товарам, содержащим протеазы для холодной воды, и способам получения и применения таких товаров. Описан способ обработки и/или очистки поверхности, предпочтительно поверхности ткани. Вводят в контакт указанную поверхность с составом в водном промывном растворе, при этом указанный состав содержит вспомогательный материал и вариант протеазы. Затем промывают и/или высушивают поверхность, при этом предпочтительно температура водного промывного раствора составляет 5-30°С. Указанный вариант протеазы представляет собой вариант родительской протеазы, с последовательностью указанной родительской протеазы на, по меньшей мере, 90% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Аминокислотные положения указанного варианта протеазы пронумерованы в соответствии с нумерацией соответствующих аминокислотных положений в аминокислотной последовательности Bacillus amyloliquefaciens субтилизина BPN′, показанной в SEQ ID NO: 2. Указанный вариант протеазы содержит мутацию T022R. Изобретение обеспечивает улучшенную очистку, белизну и/или свежесть. 1 н. и 8 з.п. ф-лы, 4 ил., 13 табл., 43 пр.

Изобретение относится к области биохимии. Представлено применение модифицированной протеазы в качестве средства для повышения стабильности при хранении целлюлазы в жидком моющем или чистящем средстве, включающем целлюлазу и протеазу. Изобретение обеспечивает пониженную дезактивацию целлюлазы посредством вышеуказанной протеазы, тем самым позволяя сохранить высокую целлюлолитическую остаточную активность в указанном моющем или чистящем средстве даже после 8 недель хранения. 7 з.п. ф-лы, 2 табл., 1 пр.
Наверх