Способ прогнозирования популяционных нарушений биотрансформации чужеродных веществ, обусловленных воздействием техногенных химических факторов среды обитания



 

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2497120:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" (ФБУН "ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения") (RU)

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ прогнозирования популяционных нарушений биотрансформации чужеродных веществ, обусловленных воздействием техногенных химических факторов среды обитания. Производят отбор группы одной этнической популяции, проживающей на территории воздействия вредных химических факторов, отбирают пробы буккального эпителия, осуществляют выделение ДНК, проводят генотипирование полиморфного варианта 9893A/G гена CYP1A1, 921А/С гена CPOX и G308A гена TNF-альфа, устанавливают одно из следующих состояний гена: гетерозиготное, нормальное гомозиготное или минорное гомозиготное, рассчитывают коэффициент распространенности минорных аллелей для изучаемых генов по формуле и прогнозируют популяционные нарушения. Изобретение позволяет точно и достоверно прогнозировать популяционные нарушения биотрансформации чужеродных веществ, обусловленных воздействием техногенных химических факторов среды обитания, и может быть использовано для профилактического обеспечения путей защиты и стабилизации генома этнической популяции в условиях возрастающего загрязнения окружающей среды. 2 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к области молекулярной биологии и генетики, и может быть использовано для профилактического обеспечения путей защиты и стабилизации генома этнической популяции в условиях возрастающего загрязнения окружающей среды.

Здоровье человека постоянно подвергается негативному воздействию химических мутагенов. В связи с этим, актуальной проблемой является разработка методов выявления (прогнозирования) адаптивности отдельной популяции к действию химических мутагенов (ксенобиотиков), связанной с полиморфизмом генов.

Вследствие генетической гетерогенности популяции человека в ней присутствуют индивиды, генетические особенности которых обуславливают повышенную чувствительность к действию мутагенов.

Изучение генов ферментов метаболизма ксенобиотиков на молекулярном уровне позволяет прогнозировать вероятность возникновения патологических эффектов, связанных с особенностями токсического действия анализируемого техногенного химического фактора среды обитания.

Биотрансформация (детоксикация) всех чужеродных веществ, в том числе вредных химических веществ, попадающих в организм через среду обитания, обеспечивается сложной метаболической системой, представленной многочисленными ферментами. Гены, контролирующие синтез соответствующих ферментов, объединены под общим названием «гены метаболизма».

Для поиска и идентификации ДНК-полиморфизма в настоящее время разработаны и широко применяются различные методы, число которых приближается к ста.

В зависимости от целей исследования все молекулярно-генетические методы можно подразделить на две группы: методы, направленные на поиск неизвестных мутаций (первичная идентификация), и анализ известных мутаций.

Методы, применяемые для первичной идентификации мутаций, то есть позволяющие скринировать на наличие ДНК-поломок достаточно протяженные фрагменты генов включают: метод анализа конформационного полиморфизма однонитевой дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК); денатурирующий градиентный гель-электрофорез; метод гетеродуплексного анализа; метод химического расщепления некомплементарных сайтов; метод тестирования «неполноценного» белка; метод масс-спектрометрии и метод биочипов.

Выявление мутаций этими известными методами должно обязательно подтверждаться результатами прямого секвенирования изучаемого ДНК-фрагмента гена. Таким образом, большинство перечисленных известных методов (за исключением масс-спектрометрии и биочипов) позволяет выявить только подозрительные на наличие точковых и других мутаций участки ДНК, и только метод секвенирования дает полную информацию о типе и характере нуклеотидных изменений. Зачастую первичный поиск нарушений в кодирующих областях гена проводят именно таким образом.

Одним из самых часто используемых молекулярных методов, позволяющих идентифицировать многие уже известные мутации, является полимеразная цепная реакция (ПЦР) (Патенты РФ №№2343480, 2324937, 2431149 и т.д.). Кроме того, этот метод лежит в основе других методов изучения генома. При этом чаще всего используют так называемое резонансное тушение флюоресценции в TaqMan системе, позволяющее контролировать кинетику ПЦР амплификации непосредственно в ходе реакции. Для детекции мутаций используют зонды, несущие на 5'- и 3'-концах соответственно различные флюорофоры (светители) и их «тушители», которые, находясь рядом, подавляют флюоресценцию. При этом зонды должны быть комплементарны последовательности амплифицируемой ДНК и отличаться лишь одним нуклеотидом, характерным для одного и другого аллеля. Зонд, содержащий на 3'-конце краситель FAM, полностью комплементарен аллелю 1 и при гибридизации дает устойчивый дуплекс. При гибридизации этого зонда с аллелем 2 будет происходить неполное спаривание нуклеотидов и возникает так называемый «мисматч». Соответственно зонд, имеющий метку VIC, полностью комплементарен аллелю 2, но при гибридизации с аллелем 1 не дает устойчивого дуплекса.

Непосредственно перед реакцией в ПЦР-смесь добавляют зонды, которые гибридизуются с комплементарными им последовательностями ДНК. В случае гетерозиготы по исследуемым аллелям гибридизуются оба зонда.

Достраивая комплементарную последовательность ДНК, TaqF-полимераза за счет своей экзонуклеазной активности разрушает только устойчивые дуплексы. При этом происходит отщепление соответствующего флюорофора, который переходит в раствор и, не находясь под влиянием «тушителя», дает свой флюоресцентный сигнал. В зависимости от сигнала свечения можно судить каким аллелем (аллелями) представлен данный образец ДНК. Интенсивность сигнала флюоресценции зависит от числа циклов ПЦР. Размер амплифицируемого фрагмента ДНК обычно не превышает 150 нуклеотидов, что серьезно ограничивает применение этого метода. Вместе с тем прохождение реакции ПЦР можно контролировать в реальном времени, что является его главным преимуществом. Для того, чтобы диагностировать наличие мутации, иногда достаточно провести менее 25 циклов амплификации.

Из уровня техники известен способ прогнозирования бесплодия у женщин - работниц нефтехимических производств (Патент РФ №2386133), который направлен на определение риска развития нарушений репродуктивной функции у работниц нефтехимического производства, подвергшихся комбинированному комплексному воздействию химических веществ. При этом, согласно способу, выделяют ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, проводят генотипирование полиморфизма A2455G и Т3801С гена CYP1A1 и -163С/А и -2467delT гена CYP1A2. При обнаружении гаплотипа CYP1A1*2A, генотипа *1А*1А полиморфных локусов -163С/А и -2467delT гена CYP1A2, гаплотипа CYP1A2*ID прогнозируют развитие бесплодия. При определении гаплотипа CYP1A2*1L прогнозируют устойчивость к формированию бесплодия у работниц.

Использование известного изобретения позволяет получить прогностические критерии развития бесплодия или устойчивости к нему на основе молекулярно-генетических маркеров у женщин-работниц нефтехимических производств.

Однако указанный известный способ является узконаправленным и позволяет устанавливать лишь генетический полиморфизм системы цитохрома р450. Этим способом невозможно идентифицировать полиморфизм генов ферментов 2-й фазы детоксикации, отвечающей за ферментные системы обеспечивающих конъюгацию гаптенов, а также полиморфизм генов, характеризующих иммунный ответ.

Также известен способ прогнозирования риска развития профессиональной бронхолегочной патологии (Заявка на патент РФ №2010134590), включающий забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами, определение нуклеотидной последовательности и на основании этого определение полиморфных вариантов гена матриксной металлопротеиназы 1 - полиморфизм 1607delG, причем при проведении полимеразной цепной реакции используют специфические праймеры MP1-F 138F BIOTIN - GCG ТСА AGA CTG АТА ТСТ ТАС ТСА ТАА АСА АТА и MP1-R 138R АСА TgT TAT gCC ACT TAg ATg Agg AAA, а после проведения полимеразной цепной реакции проводят реакцию пиросеквенирования в режиме реального времени с использованием специфического праймера MP1-S 138S gTA gTT AAA ТАА ТТА gAA Ag и детекцию нуклеотидной последовательности с помощью хемилюминисцентного сигнала, далее производят сравнение полученной нуклеотидной последовательности с референсными последовательностями и по полученной пирограмме определяют какой вариант полиморфизма 1607delG имеет место в нуклеотидной последовательности, причем при выявлении отсутствия инсерций/делеций гуанина прогнозируют риск развития профессиональной бронхолегочной патологии менее 20% при воздействии на организм вредных производственных факторов, при выявлении гиперсекреторного гетерозиготного варианта 1G мутации в нуклеотидной последовательности прогнозируют риск развития профессиональной бронхолегочной патологии (30÷50)% при воздействии на организм вредных производственных факторов, а при выявлении гиперсекреторного гомозиготного варианта 2G мутации в нуклеотидной последовательности прогнозируют риск развития профессиональной бронхолегочной патологии (60÷80)% при воздействии на организм вредных производственных факторов.

Однако указанный известный способ позволяет устанавливать лишь генетический полиморфизм генов 2-й фазы детоксикации. Этим способом невозможно идентифицировать полиморфизм генов 1-й фазы метаболизма, кодирующих ферментные системы процессов окисления гаптенов (прежде всего гидроксилирования), а также полиморфизм генов иммунного ответа.

Задачей создания заявляемого изобретения является разработка объективного способа прогнозирования популяционных нарушений биотрансформации чужеродных веществ, обусловленных воздействием вредных химических факторов среды обитания, с обеспечением доступности подобных исследований за счет использования традиционного оборудования.

Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в получении критериев оценки течения популяционных нарушений при воздействии вредных химических факторов среды обитания, позволяющих прогнозировать биотрансформацию под воздействием указанных факторов, с обеспечением точности и достоверности результатов.

Указанный технический результат достигается предлагаемым способом прогнозирования популяционных нарушений биотрансформации чужеродных веществ, обусловленных воздействием техногенных химических факторов среды обитания, согласно которому производят отбор группы одной этнической популяции, проживающей на территории воздействия вредных химических факторов, у исследуемого контингента отбирают пробы биологического материала, а именно буккального эпителия, осуществляют выделение из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты ДНК, далее на детектирующем амплификаторе с использованием полимеразной цепной реакции ПЦР проводят генотипирование полиморфизма - 9893A/G гена CYP1A1, 921А/С гена СРОХ и G308A гена TNF-альфа путем исследования аллельного состояния каждого из выбранных генов, устанавливают одно из следующих состояний гена: гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или минорное гомозиготное, рассчитывают распространенность минорного аллеля для каждого гена по формуле:

P = Ч m h o × 2 + Ч h e t 2 × N × 100 % , где

Р - распространенность минорного аллеля в исследуемой группе (%);

Чmho - число лиц с минорным гомозиготным генотипом;

Чhet - число лиц с гетерозиготным генотипом;

N - общее число лиц исследуемой группы одной этнической популяции; рассчитывают коэффициент распространенности минорных аллелей для изучаемых генов по формуле:

K p = P C Y P + P C P O X + P T N F 3 , где

Kp - коэффициент распространенности минорных аллелей в исследуемой группе (%);

P - распространенности минорных аллелей соответствующих генов в исследуемой группе (%);

и при превышении указанного коэффициента распространенности минорных аллелей более 10%, при одновременном превышении более, чем на 30% количества лиц в исследуемой группе, в крови которых присутствует в концентрации более, чем референтной, по меньшей мере, одно из приоритетных для среды обитания указанной территории, вредное химическое вещество, прогнозируют популяционные нарушения, связанные с биотрансформацией чужеродных веществ, обусловленных воздействием техногенных химических факторов среды обитания.

Указанный технический результат обеспечивается за счет следующего.

Для понимания существа вопроса ниже приведено пояснение действия вредных химических веществ среды обитания с учетом нуклеотидных изменений.

Большинство ксенобиотиков, попадая в организм, не оказывают прямого биологического эффекта, а вначале подвергаются различным превращениям, так называемой биотрансформации, которая завершается их выведением из организма. Как правило, она представляет собой многоступенчатый, «каскадный» процесс, в котором одновременно или поочередно участвуют многие ферменты системы детоксикации. В наиболее типичном варианте биотрансформация ксенобиотиков представлена двухэтапным процессом, включающим в себя активацию (1 фаза), детоксикацию (2 фаза), а также процессами, ассоциированными с состоянием иммунной системы.

В заявляемом способе в качестве генов, характеризующих популяционные нарушения биотрансформации чужеродных веществ, предлагается использовать ген CYP1A1, ген СРОХ и ген TNF-альфа, а в качестве их полиморфизмов участки: 9893A/G гена CYP1A1, 921А/С гена СРОХ и G308A гена TNF-альфа. Исследования показали, что только при использовании указанных полиморфизмов обеспечивается достоверное и точное прогнозирование популяционных нарушений в условиях воздействия на популяцию техногенных химических факторов (ТХФ) среды обитания (под ТХФ понимаются факторы техногенного характера, формирующие химическое загрязнение окружающей среды вредными химическими веществами и оказывающие негативное влияние на здоровье). Ниже приведены сведения об участии указанных генов в процессах метаболизма техногенных химических соединений

В результате действия ферментов 1-й фазы происходит активация ксенобиотиков с образованием промежуточных электрофильных метаболитов (свободные радикалы, перекиси, активные кислород и азот). Фаза активации обеспечивается, главным образом, суперсемейством цитохрома Р-450 (CYP), а также многочисленным семейством нецитохромных окислителей (гидролазы, эстеразы, амидазы, дегидрогеназы и др.). Их основные функции заключаются в присоединении к молекуле ксенобиотика гидрофильных групп, благодаря чему происходит детоксикация десятков тысяч веществ.

Суперсемейство цитохромов Р-450 (CYP-450) отвечает за микросомальное окисление и представляет собой группу ферментов, имеющих множество изоформ (более 1000), которые не только осуществляют метаболизм лекарств, но и участвуют в синтезе стероидных гормонов, холестерина и других веществ. Изоферменты цитохромов на основании гомологии нуклеотидной и аминокислотной последовательностей подразделяют на семейства, которые, в свою очередь, делят на подсемейства. Каждый изофермент цитохрома Р-450 кодируется своим геном, которые локализуются на разных хромосомах.

Семейство Р-450 CYP1 метаболизирует сравнительно небольшую часть техногенных химических факторов, самые важные из которых представлены полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ). Особенно важная роль в этом принадлежит генам CYP1A1 и CYP1A2, локализованным на хромосоме 15.

CYP1A1 кодирует фермент арилуглеводородкарбоксилазу, который участвует в метаболизме эстрогенов, некоторых лекарственных средств и ПАУ - основных компонентов табачного дыма и продуктов сжигания органического топлива. Этот фермент контролирует начальный метаболизм ПАУ и ряда других органических соединений, приводящий к образованию канцерогенов (например, бенз(а)пирена). Участвует в биоактивации нитрозаминов.

2-я фаза (детоксикация) отвечает за перенос на активированные продукты 1-й фазы ацетильных, метальных, сульфгидрильных групп либо глутатиона, в результате чего образуются гидрофильные конъюгаты.

Ферменты 2-й фазы детоксикации обеспечивают эффективный перевод промежуточных электрофильных метаболитов в водорастворимые, нетоксические соединения, которые выводятся из организма. В процессе 2-й фазы происходит глюкуронирование (УДФ-глюкуронилтрансферазы), ацетилирование (N-ацетилтрансферазы), S-метилирование (тиопуринметилтрансфераза), сульфатирование (сульфотрансферазы), водная конъюгация (эпоксидгидролазы), конъюгация с глютатионом (глютатионтрансферазы), декарбоксилирование копропорфириногеноксидазой.

Ген СРОХ кодирует синтез фермента копропорфириногеноксидазы, который катализирует окислительное декарбоксилирование металлопорфиринов. Металлопорфирины являются макроциклическими комплексами металлов (Mn, Со, Fe, Hg) и гетероциклических органических соединений (пиррол) и отличаются от бесчисленного множества других групп макроциклических комплексов тем, что являются ароматическими макроциклами с уникальной сопряженной σ-системой. В этом сопряженном состоянии металлы проявляют свою биологическую активность. При нарушении синтеза металлопорфиринов, обусловленных дефектом гена, происходит накопление неактивных форм металлоорганических соединений в печени, селезенке, коже и вызывает развитие симптомов интоксикации - гипербилирубинемию, гемолитическую анемию, повышение чувствительности к солнечному свету, неврологические нарушения, злокачественные опухоли.

Исключительная роль в элиминации техногенных химических факторов принадлежит иммунной системе. Отсюда важность имеющих место в иммунной системе полиморфизмов.

Продукт гена TNF-альфа - фактор некроза опухоли альфа относится к цитокиновой системе и представляет собой клеточный медиатор макрофагов и лимфоцитов, играет важную роль в регуляции процессов дифференцировки, роста и метаболизма клеток, является медиатором воспалительных процессов, инициирует образование свободных радикалов и может способствовать развитию оксидативного стресса.

Роль TNF-альфа в развитии оксидативного стресса заключается в активации индуцибельной NO-синтетазы (NOS) - энзима, ответственного за синтез оксида азота, играющего важную роль в образовании и трансформации свободных радикалов.

Известно, по крайней мере, 8 полиморфных вариантов гена TNF-альфа. Полиморфизм промоторной области гена TNF-альфа G-308A ассоциирован с повышением продукции TNF-альфа и, таким образом, способствует повышению содержания NOS, что сопровождается увеличением концентрации свободных радикалов, которые имеют цитотоксические свойства и играют важную роль в иммуновоспалительных процессах и в развитии оксидативного стресса. Накопление свободных радикалов, в свою очередь, вызывает дегрануляцию тучных клеток. При этом высвобождается широкий спектр биологически активных веществ, обуславливающих гиперчувствительность и гиперреактивность.

Таким образом, выбор в качестве информационного критерия полиморфизмов - 9893A/G гена CYP1A1, 921А/С гена СРОХ и G308A гена TNF-альфа обеспечивает адекватный прогноз популяционных нарушений биотрансформации чужеродных веществ, обусловленных воздействием техногенных химических факторов, а их идентификация является комплексным критерием ключевых дефектов метаболизма техногенных соединений, ассоциированных с несостоятельностью иммунной системы,

Использование других полиморфизмов указанных генов не позволит точно оценить вероятность популяционных нарушений, потому что другие локусы исследуемых генов имеют цитируемый полиморфизм принципиально отличный от 10%-го. В этом случае наблюдаемый полиморфизм будет либо типичным вариантом нормы, либо не совместимым с функцией гена вариантом мутации.

Благодаря использованию в предлагаемом способе в качестве исследуемого материала пробы биологического материала - буккального эпителия, обеспечивается простота и надежность исследований, а также получение нужной информативности.

Использование для определения заявленных полиморфизмов генов полимеразной цепной реакции (далее ПЦР), осуществляемой с помощью детектирующего амплификатора, обеспечивает точность и специфичность диагностики, поскольку предполагает четкую идентификацию последовательности нуклеотидов ДНК и их комбинаций.

Благодаря в последующем установлению одного из следующих состояний гена: гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или минорное гомозиготное, обеспечивается идентификация степени функциональности гена, соответствия его здоровому (дикому) аллельному варианту.

Расчет распространенности минорного аллеля для каждого гена по заявленной формуле позволяет установить приоритетность вклада каждого из них в формирование популяционных нарушений биотрансформации чужеродных веществ.

А последующий расчет коэффициента распространенности минорных аллелей в исследуемой группе позволяет количественно охарактеризовать величину негативных полиморфизмов

Использование показателя превышения расчетного коэффициента распространенности минорных аллелей более, чем 10%, позволяет прогнозировать популяционные нарушения, связанные с биотрансформацией чужеродных веществ, обусловленных воздействием вредных химических факторов среды обитания. Показатель 10% обусловлен наличием устойчивого аллельного популяционного фона, который может сдвигаться под воздействием стрессовой техногенной нагрузки как в отношении аллельности каждого из анализируемых генов, так и их комбинации.

Использование, наряду с вышеуказанным, в качестве дополнительного прогнозного критерия - превышение более, чем на 30% количества лиц в исследуемой группе, в крови которых присутствует в концентрации более, чем референтной, по меньшей мере, одно из приоритетных для среды обитания указанной территории, вредное химическое вещество, который обусловлен тем, что наличие нарушенного аллельного фона по анализируемым полиморфизмам не получит негативной реализации для здоровья без критической распространенности в популяции «носительства» в крови более, чем референтных концентраций техногенных химических факторов.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

1. Выбирают территорию экологического риска, характеризующуюся наличием техногенных химических факторов - химических токсикантов, обусловленных экологической средой обитания. Исследования были проведены на территории г. Чусовой, характеризующейся наличием предприятия металлургической промышленности; на территории г.Перми, характеризующейся наличием предприятия химической промышленности; на территории Пермского района Пермского края, характеризующейся наличием предприятия нефтеорганического синтеза.

2. На указанной территории производят отбор группы лиц одной этнической популяции. Затем производят отбор пробы крови у обследуемого человека, в которой определяют содержание вредных химических веществ (контаминантов), приоритетных для территории среды проживания человека. При этом определение вредных веществ в крови проводят по МУК 4.1.2102-4.1.2116-06 «Определение вредных веществ в биологических средах» (Москва, 2008) и по МУК 4.1.763-4.1.779-99 «Определение химических соединений в биологических средах» (Москва, 2000) и устанавливают, имеется ли превышение концентрации этого контаминанта в пробе крови над его референтным уровнем.

Также производят отбор пробы в виде мазка со слизистой оболочки щеки (буккальный эпителий), причем забор осуществляют сухими стерильными зондами с ватными тампонами вращательными движениями без травматизации после предварительного полоскания полости рта водой.

После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную пробирку типа «Эппендорф» с 500 мкл транспортной среды (стерильный 0,9%-ный раствор NaCl). Конец зонда отламывают или отрезают, с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть крышку пробирки. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.

3. Далее производят выделение ДНК из пробы. Для этого пробы в количестве 100 мкл лизируют 300 мкл лизирующего раствора, представляющего собой 0,5%-ный раствор саркозила и протеиназы К (20 мг/мл) в ацетатном буфере (pH 7,5). Затем добавляют сорбент (каолин) и последовательными процедурами промывки отмывают фосфатно-солевым буфером (pH 7,2) пробы от белков и смесью изопропиловый спирт:ацетон от липидов. Нуклеиновые кислоты остаются при этом на сорбенте. Далее адсорбированные на сорбенте ДНК из пробы экстрагируют ТЕ-буфером, представляющим собой смесь 10 мМ трис-HCl и 1 мМ ЭДТА (pH 8,0). Экстракт подвергают центрифугированию. После центрифугирования пробирки надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК.

4. Полученный материал готов к постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полимеразную цепную реакцию проводят на детектирующем амплификаторе с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием готовых наборов праймеров и зондов производства Applied Biosystems, в котором в качестве праймеров использовались участки ДНК гена цитохрома Р-450 -CYP1A1 (9893A/G), гена фермента копропорфириногеноксидазы СРОХ (921А/С) и гена фактора некроза опухолей TNF-альфа (G308A). Каждый раз используется два праймера, каждый из которых комплементарен лишь одному аллельному варианту выбранного участка гена. Эти участки выбраны из базы данных однонуклеотидных замен (SNP) и имеют соответствующее международное обозначение. Для CYP1A1 был выбран участок - rs4646521, для СРОХ - rs1131857, для TNF - rs1800629.

5. Проводят реакцию амплификации, это достигается тем, что для исследования аллельного состояния каждого гена у отдельного человека готовят свою реакционную смесь. В пробирку вносят 0,1 мкл готовой смеси праймеров и зондов для выбранного гена. В эту же пробирку добавляют остальные компоненты необходимые для осуществления ПЦР: нуклеотиды (дезоксинуклеозидтрифосфаты: по 10 мМ дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), буфера (100 мМ трис-HCl-буфера, 500 мМ КСl, 40 мМ MgCl2) и Tag F-полимеразы. Вносят пробу в количестве 10 мкл. Таким образом, общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Пробирка плотно закрывается пробкой и устанавливается в амлификатор.

6. При проведении ПЦР амплификацию и детекцию проводят на детектирующем амплификаторе CFX96 фирмы Bio-Rad.

Используется универсальная программа амплификации, подобранная производителем реактивов. Она включает в себя несколько этапов: 1 этап -активация TaqF-полимеразы (режим «горячего старта») продолжается 15 мин при 95°C; 2 этап - установочные циклы амплификации без измерения флуоресценции (5 циклов); 3 этап - рабочие циклы амплификации с измерением флюоресценции (40 циклов).

Каждый цикл амплификации включает в себя денатурацию ДНК (5 с при 95°C), отжиг праймеров (20 с при 60°C) и саму реакцию полимеризации ДНК (15 с при 72°C).

Регистрация сигнала флюоресценции, возникающего при накоплении продуктов амплификации участков ДНК, проводится в режиме «реального времени» после стадии отжига праймеров для выбранных генов по каналу VIC - для детекции одного из аллельных вариантов генов, и по каналу FAM - для альтернативного варианта.

Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флюоресценции с установленной на заданном уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (N) в соответствующей графе в таблице результатов, отображаемой в программном обеспечении для амплификатора CFX96.

По соотношению пороговых циклов, полученных по двум каналам детекции, определяют состояние гена в исследуемом участке ДНК (метод аллельной дискриминации). Возможных вариантов состояния гена было два: гомозиготное - в случае, когда одно из значений порогового цикла не определяется (ниже пороговой линии) и гетерозиготное - в случае, когда получено два значения пороговых циклов и по этим каналам получены параболические кривые флюоресценции. В зависимости от того, накопление какого продукта амплификации происходит в реакции, устанавливается гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или минорное состояние гена.

При проведении массовых исследований регистрируются частоты аллельных вариантов изучаемых генов и частоты состояний генов (генотипов) в соответствии с таблицей 1.

Таблица 1
Аллельные состояния анализируемых генов
состояние гена (генотип) нормальный аллель минорный аллель
CYP1A1-GG
Нормальное СРОХ-АА отсутствует
гомозиготное TNF-GG
CYP1A1-G CYP1A1-А
Гетерозиготное СРОХ-А СРОХ-С
TNF-G TNF-A
CYP1A1-AA
Минорное гомозиготное отсутствует СРОХ-СС
TNF-AA

Примечание: В таблице приведены варианты аллельных состояний анализируемых генов (гетерозиготное и гомозиготное). Для каждого варианта генов приведены сочетания нуклеотидов, характерные для нормальных и минорных комбинаций.

Частоты аллелей используются в дальнейшем для расчета их распространенности в популяциях по формуле:

P = Ч m h o × 2 + Ч h e t 2 × N × 100 % , где

P - распространенность минорного аллеля в исследуемой группе (%);

Чmho - число лиц с минорным гомозиготным генотипом;

Чhet - число лиц с гетерозиготным генотипом;

N - число наблюдений в популяции.

Далее рассчитывают коэффициент распространенности минорных аллелей для выбранных генов по формуле:

K p = P C Y P + P C P O X + P T N F 3 , где

Kp - коэффициент распространенности минорных аллелей в исследуемой группе (%);

P - распространенности минорных аллелей соответствующих генов в исследуемой группе (%).

7. Для прогнозирования популяционных нарушений биотрансформации чужеродных веществ, обусловленных воздействием техногенных химических факторов среды обитания, сравнивают установленный коэффициент распространенности минорных аллелей в исследуемой группе с величиной 10% и при превышении указанного коэффициента более этой величины и одновременно при превышении более, чем на 30% количества лиц в исследуемой группе, в крови которых присутствует в концентрации более чем референтной, по меньшей мере, одно из приоритетных для среды обитания указанной территории, вредное химическое вещество, прогнозируют указанные популяционные нарушения.

Предлагаемый способ был испытан в клинических условиях.

Для апробации предлагаемого способа были исследованы 188 ребенка европеоидной расы (возраст 3-7 лет), проживающие на территории Пермского Прикамья в условиях внешнесредовой экспозиции следующих приоритетных для конкретных городских территорий проживания указанных детей вредных химических веществ: метанол, фенол, формальдегид, бенз(а)пирен, свинец.

Для доказательства достоверности предлагаемого способа была исследована контрольная популяция детей (возраст 3 - 7 лет) в количестве 33 человек, проживающих в сельской местности, в которой отсутствовали вышеуказанные вредные химические соединения.

Ниже в таблице 2 приведены результаты, полученные при реализации предлагаемого способа, на территориях, для которых характерны в качестве приоритетных вышеуказанные вредные химические соединения.

Таблица 2
Данные, полученные при реализации предлагаемого способа
Ген Состояние гена и Контрольная Исследуемая
аллеля популяция, популяция,
%/(число лиц) %/(число лиц)
N=33 N=188
А/А* 0%(0) 4%(8)
CYP1A1 A/G** 12%(4) 19%(36)
-9893A/G G/G*** 88%(29) 77%(144)
G**** 92% 86%
A***** 8% 14%
СРОХ С/С* 0%(0) 0%(0)
921А/С А/С** 24%(8) 18%(34)
А/А*** 76%(25) 82%(154)
A**** 88% 91,1%
C***** 12% 8,9%
А/А* 0%(0) 3%(5)
TNF -альфа A/G** 6%(2) 22%(41)
G308A G/G*** 94%(31) 75%(142)
G**** 97% 86%
A***** 3% 14%
Процент детей, Метанол, % 28,5%↑N 54,29%↑N
имеющих в крови Фенол, % 21,4%↑N 73,27%↑N
превышение нормы Формальдегид, % 20,1%↑N 78,57%↑N
по содержанию чужеродных Бенз(а)пирен, % 0 52,17%↑N
химических веществ Свинец, % 19,4%↑N 81,3%
Примечание
* - минорная гомозигота,
** - гетерозиготна
*** - нормальная гомозигота
**** - нормальный аллель
***** - минорный аллель
↑N - превышение нормы (референтной концентрации)
Норма (N) для метанола 0,369±0,117 мг/дм3; для фенола 0,01±0,007 мг/дм3; для формальдегида 0,005±0,0014 мг/дм3; для бенз(а)пирена - 0; для свинца - 0,129±0,021 мг/дм3.

Пример расчета частоты минорных аллелей и коэффициента их распространенности в исследуемой и контрольной группах (данные из таблицы 2):

K p = P C Y P + P C P O X + P T N F 3 = 14 + 8.9 + 14 3 = 12,3 (для исследуемой группы)

K p = P C Y P + P C P O X + P T N F 3 = 8 + 12 + 3 3 = 7.6 (для контрольной группы)

Данные, приведенные в таблице 2, показывают следующее.

Распространенность минорной гомозиготы по гену CYP1A1 (-9893A/G) в исследуемой и контрольной группах составила 4% и 0%, соответственно, а распространенность минорного аллеля A в них составила 14% и 8%.

CYP1A1 характеризуется преимущественно монооксигеназной активностью, которая индуцируется полициклическими ароматическими углеводородами, и он участвуя в промежуточном обмене многих эндогенных метаболитов, кроме того, осуществляет активацию бенз(а)пирена. Высокая активность этого фермента ассоциирована с заменой нуклеотида и сопровождается повышенным риском онкозаболеваний при воздействии ПАУ.

Распространенность минорной гомозиготы по гену СРОХ 921А/С в исследуемой и контрольной группах составила 5% и 0%, соответственно, а распространенность минорного аллеля A в них составила 8,9% и 12%. Измененный полиморфизм СРОХ 921А/С характеризуется повышением чувствительности к гаптенам и развитием симптомов интоксикации при следовых количествах ксенобиотиков.

Распространенность минорных гомозигот по гену TNF-альфа в исследуемой и контрольной группах составила 3% и 0%, соответственно, а распространенность минорного аллеля A в них составила 14% и 3%. У гомозиготных носителей аллеля A (замена G308A в гене TNF-альфа) не происходило адекватного иммунного ответа на антиген. Индивиды с носительством минорного аллеля в промоторной области гена TNF-альфа были ассоциированы с нарушениями дифференцировки клеток, аутоиммунными, инфекционными заболеваниями.

Таким образом, несмотря на соответствие нормальному (не превышает 10%) распределению минорного аллеля СРОХ 921А/С, суммарный полиморфизм генов, участвующих в формировании мажорного полиморфизма, не обеспечивает адекватную адаптацию к внешнесредовой химической нагрузке.

Таким образом, изучение исключительно суммарного полиморфизма генов по ключевым по отношению к детоксикации приоритетных техногенных химических факторов с детекцией распространенности контаминации ими биосред позволит получить достоверную информацию об их опасности для организма.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет точно и достоверно прогнозировать популяционные нарушения биотрансформации чужеродных веществ, обусловленных воздействием техногенных химических факторов среды обитания, что позволит своевременно проводить профилактические мероприятия по обеспечению путей защиты и стабилизации генома этнической популяции, оптимизировать с точки зрения обеспечения безопасности жизнедеятельности жизненный и профессиональный маршрут.

Способ прогнозирования популяционных нарушений биотрансформации чужеродных веществ, обусловленных воздействием техногенных химических факторов среды обитания, характеризующийся тем, что производят отбор группы одной этнической популяции, проживающей на территории воздействия вредных химических факторов, у исследуемого контингента отбирают пробы биологического материала, а именно буккального эпителия, осуществляют выделение из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), далее на детектирующем амплификаторе с использованием полимеразной цепной реакции ПЦР проводят генотипирование полиморфизма - 9893A/G гена CYP1A1, 921А/С гена СРОХ и G308A гена TNF-альфа путем исследования аллельного состояния каждого из выбранных генов, устанавливают одно из следующих состояний гена: гетерозиготное или нормальное гомозиготное, или минорное гомозиготное, рассчитывают распространенность минорного аллеля для каждого гена по формуле:
P = Ч m h o 2 + Ч h e t 2 N 100 % ,
где P - распространенность минорного аллеля в исследуемой группе, %;
Чmho - число лиц с минорным гомозиготным генотипом;
Чhet - число лиц с гетерозиготным генотипом;
N - общее число лиц исследуемой группы одной этнической популяции;
рассчитывают коэффициент распространенности минорных аллелей для изучаемых генов по формуле:
К р = P C Y P + P C P O X + P T N F 3 ,
где Kp - коэффициент распространенности минорных аллелей в исследуемой группе, %;
P - распространенности минорных аллелей соответствующих генов в исследуемой группе, %;
и при превышении указанного коэффициента распространенности минорных аллелей более 10%, при одновременном превышении более чем на 30% количества лиц в исследуемой группе, в крови которых присутствует в концентрации более чем референтной, по меньшей мере, одно из приоритетных для среды обитания указанной территории вредное химическое вещество, прогнозируют популяционные нарушения, связанные с биотрансформацией чужеродных веществ, обусловленных воздействием техногенных химических факторов среды обитания.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для выбора тактики лечения деструктивной формы острого панкреатита. В сыворотке крови определяют концентрацию прокальцитонина (ПКТ) с помощью количественного иммуноферментного анализа.

Изобретение относится к медицине и предназначено для повышения проницаемости мембран гладкомышечных клеток тонкого кишечника. Проводят обработку клеток в одной пробе пороформирующим гемолизином HlyII из Bacillus cereus в концентрации 3-5 мкг/мл.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ дифференциальной диагностики тяжелой бронхиальной астмы, включающий определение вентиляционной функции легких и исследование мононуклеаров, выделенных из венозной крови больного, с последующим расчетом индекса, характеризующего воспалительный процесс.
Изобретение относится к медицине, а именно к инфектологии, и может быть использовано для прогнозирования развития периваскулярных нарушений у больных гриппом. Сущность способа: у больных гриппом определяют возрастную группу, срок наблюдения и значение ристомицин-агрегации тромбоцитов в сыворотке крови в секундах.
Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, может быть использовано для прогнозирования развития «тлеющей» формы хронического лимфолейкоза. Сущность способа: проводят генотипирование полиморфного локуса - 248G>A гена Bcl-2 ассоциированного X белка (ВАХ - 248G>A).

Настоящее изобретение относится к медицине, в частности к медицинским, химико-токсикологическим исследованиям, и описывает способ подготовки пробы для газохроматографического определения тиодигликолевой кислоты в моче, включающий дериватизацию, извлечение тиодигликолевой кислоты из пробы этилацетатом, где дериватизацию тиодигликолевой кислоты проводят метанолом в присутствии концентрированной серной кислоты при температуре 80°C в течение 15 минут, а извлечение тиодигликолевой кислоты из пробы проводят этилацетатом путем жидкостно-жидкостной микроэкстракции в течение 5 минут, при этом все операции выполняют в одной емкости.
Изобретение относится к области медицины. Предложен способ определения инфицированности пациента вирусом клещевого энцефалита, основанный на обнаружении РНК вируса методом РТ - ПЦР.
Изобретение относится к медицине и предназначено для прогнозирования ответа на проводимую химиотерапию хронического лимфолейкоза. Проводят генотипирование полиморфного локуса 9360Т гена фактора роста эндотелия сосудов.

Настоящее изобретение относится к способу прогнозирования клинического течения лимфопролиферативных заболеваний кожи. Заявленный способ включает проведение гистологических исследований биоптатов пораженной кожи, исследование сыворотки периферической крови, определение пола, возраста, социально-профессиональной принадлежности, а также факторов, способствующих заболеванию, оценку прогностических коэффициентов каждого из указанных факторов и суммирование полученных значений.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ прогнозирования отслойки хориона и плаценты на ранних сроках беременности.
Изобретение относится к медицине и касается способа лабораторной диагностики развития инфекции у больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) в состоянии индуцированной нейтропении. Сущность способа состоит в том, что у больных в крови определяют количество С-реактивного белка (СРБ), и при отсутствии клинических проявлений инфекции и уровне СРБ<11 мг/л делают вывод об отсутствии инфекции, а>11 мг/л - диагностируют инфекционный процесс независимо от наличия лихорадки и/или очагов инфекции. Использование заявленного способа позволяет провести более точную и раннюю диагностику инфекционных осложнений, а также более четкий контроль эффективности антимикробной терапии у пациентов с ОЛЛ в состоянии нейтропении. 1 табл., 2 пр.
Настоящее изобретение относится к медицине и описывает способ определения содержания в тканях сердечно-сосудистой системы Ti, Al, включающий помещение образца ткани в емкость с добавлением азотной кислоты и выдержкой в течение 3 час при 75°С, последующее приливание перекиси водорода с выдержкой в течение 2 часов при той же температуре, добавление новой порции азотной кислоты с выдержкой 2 часа при температуре 110°С, добавление плавиковой кислоты и выдерживание в течение 18 часов при 20°С с последующим нагревом в течение 6 часов при 75°С и помещением в микроволновую печь, выпариванием и выполнением измерений методикой масс-спектроскопии с индуктивно связанной плазмой, при следующем соотношении компонентов, мас.%: НNО3 35, Н2О2 5, HF 13,3, деионизированная вода - остальное. 1 пр., 1 таб.

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и касается способа прогнозирования возникновения рецидивов при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ). Сущность способа состоит в том, что проводят гистологическое исследование фрагментов ткани удаленного легкого с главным, промежуточным или сегментарным бронхами, находящимися на расстоянии 4-5 см от опухоли, в респираторном эпителии бронхов определяют варианты дисрегенераторных изменений: базальноклеточную гиперплазию (БКГ), плоскоклеточную метаплазию (ПМ) и при наличии в смежном с опухолью эпителии бронхов сочетания базальноклеточной гиперплазии с плоскоклеточной метаплазией (БКГ+ПМ+) прогнозируют риск развития рецидива немелкоклеточного рака легкого. Использование заявленного способа позволяет повысить точность и информативность прогнозирования возникновения рецидивов при НМРЛ. 1 табл., 4 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для выявления высокого риска развития нарушения толерантности к глюкозе на фоне приема метопролола у больных стабильной стенокардией напряжения. Для этого до начала лечения метопрололом больному в один и тот же день проводят 2 теста с физической нагрузкой до достижения пороговой мощности нагрузки по одинаковому протоколу, исходно и через 2 часа после приема разовой дозы метопролола 50 мг. Если при выявлении при 2-й нагрузке по сравнению с 1-й нагрузкой увеличения на 120 секунд и более интервала времени от начала нагрузки до появления приступа стенокардии и/или снижения на электрокардиограмме сегмента ST ишемического типа глубиной не менее 1 мм, риск развития нарушения толерантности к глюкозе считают высоким. В таком случае через 4-5 недель регулярного приема метопролола проводят тест на толерантность к глюкозе. При выявлении нарушения толерантности к глюкозе лечение метопрололом прекращают. Если при 2-й нагрузке по сравнению с 1-й нагрузкой интервал времени до появления приступа стенокардии и/или снижения на электрокардиограмме сегмента ST ишемического типа глубиной не менее 1 мм увеличивается менее чем на 120 секунд, риск развития нарушения толерантности к глюкозе считают незначительным. В таком случае лечение метопрололом продолжают без дополнительного проведения теста на толерантность к глюкозе. Способ обеспечивает профилактику нарушений углеводного обмена у заявленной группы больных на фоне приема метопролола и возможность своевременной коррекции терапии за счет выявления компенсаторного увеличения использования глюкозы в условиях инсулинорезистентности и сниженной доступности свободных жирных кислот для обеспечения энергетических потребностей миокарда. 4 пр.

Изобретение применяют для оценки влияния цитомегаловирусной инфекции на содержание метгемоглобина в эритроцитах периферической крови беременной на третьем триместре гестации. Сущность способа: в периферической крови беременных с цитомегаловирусной инфекцией на третьем триместре гестации определяют количество эритроцитов, окрашенных 0,1% раствором метиленового синего, выполняющего роль переносчика электронов, и содержание метгемоглобина в эритроцитах. Если при титре антител к цитомегаловирусу 1:1600 будет наблюдаться увеличение числа окрашенных эритроцитов до 12,0±0,9%, а увеличение метгемоглобина до 1,5±0,42%, то оценивают нарушение восстановления метгемоглобина и угрозу насыщения гемоглобина эритроцитов кислородом. 2 ил.

Изобретение относится к медицине и касается способа персонифицированного подбора антиагрегантых препаратов больным, нуждающимся в подобном лечении, включающего забор крови больного, получение богатой тромбоцитами плазмы с помощью центрифугирования крови, разделение ее на пробы и введение в них антиагрегантных препаратов, имеющих различные механизмы антиагрегационного действия на тромбоциты с последующей инкубацией проб плазмы с препаратами при температуре 36,5-37,5°C и с индуктором агрегации тромбоцитов. Изобретение обеспечивает повышение точности подбора антиагрегантных препаратов больным, нуждающимся в подобном лечении. 2 пр., 5 ил.

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной диагностике. Предложен способ определения чувствительности опухоли легкого к терапии ингибиторами тирозинкиназ у пациентов с раком легкого в цитологическом опухолевом материале методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени при помощи праймеров для выявления 8 делеций в 19 экзоне гена EGFR и замены L858R гена EGFR в 21 экзоне. При выявлении любой из этих мутаций определяют чувствительность опухоли легкого к терапии ингибиторами тирозинкиназ как положительную и назначают терапию гефитинибом или эрлотинибом. Способ обладает высокой информативностью и чувствительностью, прост в исполнении и интерпретации результата. 2 ил., 2 табл., 1 пр.

Изобретение относится к медицине, в частности к педиатрии, а именно к способу дифференциальной диагностики гнойных и серозных менингитов у детей. Способ состоит в определении показателей микробицидной активности нейтрофильных лейкоцитов: ферментов миелопероксидазы, цитохромоксидазы, кислой фосфатазы в ликворе больных гнойным и серозным менингитами с помощью спектрофотометрического анализа. При значениях миелопероксидазы в пределах 0,18-0,2 усл.ед. диагностируют гнойный менингит, а при значениях 0,059-0,061 усл.ед. - серозный менингит. Показатель активности цитохромоксидазы в пределах 0,49-0,57 усл.ед. свидетельствует о гнойном менингите, в пределах 0,186-0,174 усл.ед. - о серозном менингите. Показатель активности кислой фосфатазы в ликворе в пределах 0,14-0,18 усл.ед. следует расценивать как гнойный менингит, а в пределах 0,069-0,071 усл.ед. - как серозный менингит. Использование заявленного способа позволяет повысить точность диагностики гнойных и серозных менингитов у детей. 1 табл., 2 пр.
Изобретение относится к области биохимии и микробиологии и может быть использовано для определения липолитической активности в субклеточных фракциях бактерий. Сущность способа состоит в том, что среда, содержит агарозу или агар (500 мг), неионный детергент (50 мкл), хлористый кальций (12,5 мг), 0,05 М Трис-HCl буфер pH 8,3 (до 100 мл), причем после застывания среды в ней делают лунки, в которые вносят исследуемый образец в объеме 10-50 мкл на одну лунку, затем среду с исследуемым образцом инкубируют при 37°C в течение 12 часов и визуально определяют наличие или отсутствие липолитической активности в исследуемом образце. При наличии липолитической активности наблюдают матовые ореолы вокруг лунки, при отсутствии липолитической активности среда вокруг лунки остается прозрачной. Использование заявленного способа позволяет просто, доступно и экономично определить липолитическую активность субклеточных фракций бактерий. 3 з.п. ф-лы, 6 пр.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ оценки индивидуальной чувствительности генома человека к воздействию повышенных доз излучений радона и продуктов его распада. В буккальных эпителиоцитах определяют предрасполагающие и протективные генотипы: маркер Arg399Gln гена XRCC1 - предрасполагающий генотип Arg/Gln, протективный генотип Arg/Arg; маркер Arg194Trp гена XRCC1 - предрасполагающий генотип Arg/Trp; маркер Glu185Gln гена NBS1 - предрасполагающий генотип Glu/Gln, протективный генотип Glu/Glu; маркер Ser326Cys гена hOGG1 - предрасполагающий генотип Ser/Cys; маркер Asp1853Asn гена ATM - предрасполагающий генотип Asp/Asp, протективный генотип Asp/Asn; маркер Asp1104His гена XPG - протективный генотип His/His. При преобладании предрасполагающих генотипов или равном количестве предрасполагающих и протективных генотипов делают заключение о высокой индивидуальной чувствительности к действию повышенных доз радона и о прогнозировании накопления микроядер и протрузий. При количественном преобладании протективных генотипов делают заключение о высокой индивидуальной устойчивости к воздействию радона и о прогнозировании устойчивости к накоплению микроядер и протрузий. Предложенный способ позволяет проводить оценку генетически детерминированной предрасположенности к формированию повышенного уровня микроядер и протрузий еще до воздействия радиационного фактора. 1 з.п. ф-лы, 5 табл., 2 пр.
Наверх