Штамм микромицета aspergillus oryzae - продуцент протеолитических и амилолитических ферментов для использования в пищевой промышленности

Авторы патента:

 


Владельцы патента RU 2499039:

Общество с ограниченной ответственностью "СОСТРА" (RU)

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Aspergillus oryzae RCAM01135 - продуцент протеолитических и амилолитических ферментов - обладает способностью продуцировать протеолитические и амилолитические ферменты. Депонирован в ГНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM01135. Может быть использован при получении различных пищевых продуктов (ферментированных приправ, добавок, напитков). Изобретение позволяет повысить скорость роста и интенсивность спорообразования. 4 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению штамма - продуцента протеолитических и амилолитических ферментов, и может быть применено для гидролиза растительных и животных субстратов в пищевой промышленности, бродильных производствах, сельском хозяйстве.

Известно, что мицелиальный гриб Aspergillus oryzae имеет широкое применение в пищевой промышленности, так как не обладает патогенными свойствами. Биосинтез протеаз и амилаз, характерный для представителей Aspergillus oryzae, используется, например, при изготовлении некоторых пищевых продуктов (ферментированных приправ, ферментированных напитков), когда требуется гидролиз белков и углеводов (RU 2361914, 2009, RU 2187947, 2002).

Известен штамм Aspergillus oryzae ВКПМ F-369, обладающий способностью продуцировать комплекс протеаз, проявляющих максимальную активность в кислой и слабокислой зоне pH, α-амилазу. Однако основным недостатком этого штамма является отсутствие синтеза сопутствующих гидролаз, а также длительный период роста и развития микромицета; штамм интенсивно продуцирует α-амилазу и протеазу на жидких средах лишь на четвертые - пятые сутки (SU 1440922, 1988).

Известен штамм Aspergillus oryzae ВКПМ F-683, продуцирующий комплекс кислых и слабокислых протеаз, α-амилазы и сопутствующих ксиланаз, глюканаз и цитаз. Известно, что при глубинном культивировании данный штамм продуцирует целый комплекс высокоактивных ферментов. Получаемые ферментные комплексы применяются в пищевой промышленности.

Однако применение штамма является ограниченным из-за недостаточно высокой скорости роста и особых требований к питательным средам, так как он растет на средах с содержанием сухих веществ не более 18% (RU 2070921, 1996).

Задача изобретения состоит в получении штамма Aspergillus oryzae, продуцирующего протеазы и α-амилазу, обладающего высокой скоростью роста, преимущественно при твердофазном культивировании.

В качестве изобретения предлагается новый штамм микромицета Aspergillus oryzae 37-53, полученный методом многоступенчатой селекции и мутагенеза, депонированный в ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM) под регистрационным номером RCAM01135. Штамм является продуцентом протеаз и α-амилазы, обладает высокой скоростью роста, преимущественно при твердофазном культивировании, и интенсивным спорообразованием.

Техническим результатом изобретения является более высокая скорость роста предлагаемого штамма Aspergillus oryzae RCAM01135.

В частности, на средах с соевым шротом максимумы протелитической и амилолитической активностей проявляются на третьи сутки культивирования, и интенсивность спорообразования была самой высокой также на третьи сутки. Это позволяет рассматривать заявленный штамм как перспективное средство для использования в пищевой промышленности для переработки сельскохозяйственного сырья, например сои, с целью получения различных пищевых вкусоароматических добавок, в бродильном производстве, хлебопекарной промышленности.

Штамм Aspergillus oryzae RCAM01135 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки:

а) характер роста (опушение, край колонии). Колонии пушистые, округлой формы, края ровные, мицелий белый, спорообразующий, цвет колонии от оливкового до темно-зеленого. Вегетативный мицелий септированный, хорошо разветвленный с крупными вздутиями, толщина гиф 6-12 мкм; конидии формируются экзогенно, поверхность конидии гладкая, форма округлая, диаметр спор 5-6 мкм; образует конидиальные головки с одноярусными стеригмами;

б) размер колонии (при определенном времени инкубации). На 3 сутки роста на сусло-агаре диаметр колонии 50×51 мм;

в) воздушный мицелий (наличие, цвет, особенности спороношения). С обильным спороношением темно-зеленого цвета. По краю колонии белый пушистый мицелий 3 мм;

г) цвет субстратного мицелия. Белый;

д) цвет обратной стороны колонии. Светло-коричневый;

е) другие признаки (пигмент, экссудат и т.д.). Пигменты не выделяются, экссудат отсутствует;

ж) изменения культуры по мере старения. Цвет колонии с возрастом темнеет, становится буро-зеленым;

з) поведение на других средах. На среде Чапека с глюкозой: на 3 сутки роста цвет колонии - зеленый, поверхность гладкая; диаметр колонии 32×34 мм.

По исследованиям морфологических признаков культуры проведена идентификация штамма в соответствии с определителем мицелиальных грибов (Билай В.И., Коваль Э.С. Аспергиллы. Определитель. - Киев: Наук. Думка, 1988, - 204 с.).

Физиолого-биохимические признаки

Отношение к кислороду - аэроб. Оптимальная температура роста - 28-30°C. Максимальная температура - 50°C. Минимальная температура - 18°C. Оптимальное значение pH для роста гриба - 5,5. Рост гриба отмечается в диапазоне pH от 2,5 до 10,0.

В качестве источника углерода гриб использует крахмал, глюкозу, сахарозу, ксилозу, мальтозу, маннит, глицерин и лактозу. Ассимилирует нитраты, аммонийный и аминный азот, белки. Штамм не патогенный. В режиме глубинного и твердофазного культивирования была установлена способность к синтезу ферментов амилолитического и протеолитического действия.

Штамм хранится на агаризованном солодовом сусле 8% CB; pH среды - естественный; температура хранения +20-25°C.

Пример 1

Глубинное и твердофазное культивировстие штамма Aspergillus oryzae RCAM01135

Глубинное культивирование штамма Aspergillus oryzae 37-53 осуществляли на различных комплексных естественных средах, составленных с учетом физиологических потребностей продуцента. При конструировании питательных сред принимали во внимание то обстоятельство, что для синтеза протеаз и α-амилазы благоприятны крахмал, белки, поэтому основными компонентами среды являлось зерновое сырье. В качестве источника фосфорного питания для микромицета применяли фосфорнокислый калий. Таким образом, для глубинного культивирования штамма Aspergillus oryzae RCAM01135 были использованы питательные среды следующего состава, %:

1. Ячменная мука - 3,0, пшеничные отруби - 3,0, крахмал - 2,0, KH2PO4 - 1,5;

2. Пшеничная мука - 6,0, пшеничные отруби - 2,0, KH2PO4 - 1,5%;

3. Соевая мука - 6,0, ячменная мука - 5,0, KH2PO4 - 1,5;

4. Соевая мука - 6,0, пшеничные отруби - 2,0, KH2PO4 - 1,5;

Культивирование штамма Aspergillus oryzae RCAM01135 осуществляли в колбах Эрленмейера объемом 750 см3, содержащих 50 см3 стерильной питательной среды, на круговой качалке с числом оборотов 220 об/мин при температуре 30°C. Полученные результаты представлены в табл.1.

Таблица 1
Глубинное культивирование гриба Asp.oryzae RCAM01135 на натуральных питательных средах
№ среды Сутки Рост (густота, цвет КЖ) pH РСВ, % Ферм, акт-сть, ед./см3
ПС АС
1 1 ++бежевая каша 4,74 4,0 - -
2 +хаки (желтоватая) каша 4,8 2,8 1,5 0,64
3 +хаки (желтоватая) жижа 5,36 2,2 1,8 0,82
2 1 ++++бежевая каша 5,09 3,0 - -
2 ++хаки (желтоватая) каша 5,42 2,0 1,3 0,93
3 ++хаки светлая жижа 5,6 2,2 1,5 1,10
3 1 +++++очень густая бежевая каша 5,69 5,0 - -
2 темная бежевая каша 7,6 5,0 0,05 0,35
3 ++++хаки темная каша 8,46 5,4 0,03 0,56
4 1 +++++густая бежевая каша 7,10 5,0 - -
2 темная бежевая каша 8,33 4,9 0,06 0,35
3 +++хаки темная каша 8,73 5,4 0,02 0,12

Как видно из таблицы 1, селекционированный штамм Aspergillus oryzae RCAM01135 на питательных средах, содержащих ячменную или пшеничную муку, а также пшеничные отруби (среды №1 и 2), проявлял способность к синтезу протеаз и α-амилазы: общая протеолитическая активность на 3-и сутки культивирования составила 1,5-1,8 ед. ПС/см3, амилолитическая 0,82-1,10 ед. АС/см3. На средах, в состав которых входила соеваая мука (среды №3 и 4), уровень активности синтезируемых ферментов снижался в 2-3 раза.

Твердофазное культивирование штамма Aspergillus oryzae RCAM01135 осуществляли на пшеничных отрубях с влажностью 52,4% и на соевом шроте с влажностью 51,8% при температуре 30°C в стационарных условиях. Полученные результаты представлены в табл.2.

Таблица 2
Поверхностное культивирование гриба A.oryzae RCAM01135 на различных средах
Среда для культивирова
ния
Характеристика роста гриба, сутки Ферментативная активность, ед./г
2 4 7 ПС АС
Отруби Белый мицелий, начало спорообразования, цвет спор зеленый Обильное спорообразование, споры пылят, цвет зеленый с оливковым оттенком Без изменений 43,5 9,0
Соевый шрот 1 2 3 41,0 12,0
Белый мицелий Обильное спорообразование, цвет спор зеленый с оливковым оттенком Обильное спорообразование, споры оливкового цвета

Результаты глубинного и твердофазного культивирования подтверждают биосинтетическую способность селекционированного штамма Aspergillus oryzae RCAM01135 по отношению к протеолитическим и амилолитическим ферментам, что характерно грибам рода Aspergillus вида oryzae.

Таким образом, полученный штамм хорошо развивается на жидких и твердых питательных средах, синтезирует ферменты протеолитического и амилолитического действия и идентифицирован как мицелиальный гриб Aspergillus oryzae.

Пример 2

Культивирование штамма Aspergillus oryzae RCAM01135 на средах с соевым шротом

Наработку экспериментальных образцов селекционированной культуры Aspergillus oryzae RCAM01135 осуществляли на среде с соевым шротом и на соевом шроте с добавлением 10% перловки с разной влажностью в течение 3-х суток при 30°C (табл.3).

Таблица 3
Биохимическая характеристика экспериментальных образцов гриба A.oryzae RCAM01135
Среда для культивирова
ния
Влажность поверхн. культуры, % Биохимические показатели гриба
Белок по Кьельдалю, % а.с.в. Белок по Лоури, мг/г а.с.в. n h 2 +
мг%/г а.с.в.
Соевый шрот 58,7 43,0 35,0 317,0
Соевый шрот +10% перловки 51,3 41,0 52,8 309,7
62,4 44,3 58,3 322,5

Экспериментальные образцы гриба A.oryzae RCAM01135 были получены в результате ускоренного роста микромицета при поверхностном культивировании на соевом шроте, обогащены белком, аминным азотом и могут быть использованы для дальнейшей переработки в производстве продуктов ферментации сои.

Селекционированный штамм Aspergillus oryzae RCAM01135 и наработанные экспериментальные образцы гриба A.oryzae RCAM01135 были исследованы в Испытательной лаборатории технохимического контроля и арбитражных методов анализа ГНУ ВНИИПБТ Россельхоакадемии.

Результаты испытаний по идентификации ГМИ показали, что в чистой культуре микромицета Aspergillus oryzae RCAM01135 трансгенные последовательности отсутствуют (протокол испытаний от 23 марта 2012 г.).

При анализе тяжелых металлов в экспериментальных образцах гриба A. oryzae RCAM01135 было установлено, что их содержание не превышает предельно допустимых концентраций (протокол от 18 апреля 2012 г.). В таблице 4 приведены результаты анализа по содержанию тяжелых металлов в субстрате - соевом шроте и в поверхностной культуре гриба A.oryzae RCAM01135. Аналогичные результаты получены во всех исследуемых экспериментальных образцах.

Таблица 4
Содержание тяжелых металлов в поверхностной культуре гриба A.oryzae RCAM01135
Анализируемый объект Содержание тяжелых металлов, мг/кг
Свинец Pb Мышьяк As Кадмий Cd Ртуть Hg
Соевый шрот 0,0052 0,0034 0,0027 0,0009
(ПДК для сои)1 (1СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов») 0,5 0,3 0,1 0,02
Поверхностная культура гриба A.oryzae 37-53 0,0065 0,0047 0,0029 0,0014

Штамм микромицета Aspergillus oryzae, депонированный в ГНУ ВНИИСХМ (Ведомственная коллекция полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения - RCAM) под регистрационным номером RCAM01135, - продуцент протеолитических и амилолитических ферментов для использования в пищевой промышленности.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295 - продуцент биологически активных веществ, обладающих антиоксидантной активностью, депонирован в коллекции культур микроводорослей Института физиологии растений им.

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и касается штамма бактериофага Escherichia coli ECD4. Штамм бактериофага Escherichia coli ECD4 выделен из фекалий бройлерных кур на культуре бактерий штамма Escherichia coli О104:Н4 RKI№112027 и депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером Рh63.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности биодеградации органических соединений с помощью микроорганизмов. Предложен способ биодеградации дротаверина гидрохлорида (спазмолитик НОШПА).

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к новому, высокоэффективному способу получения такролимуса (FK-506) методом микробиологического синтеза. Способ предусматривает приготовление инокулята клеток Streptomyces sp.

Плазмида для экспрессии в клетках бактерии рода escherichia неактивного предшественника мутеина [c112s] легкой цепи энтерокиназы человека, бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент предшественника рекомбинантного мутеина [c112s] легкой цепи энтерокиназы человека, предшественник рекомбинантного мутеина [c112s] легкой цепи энтерокиназы человека, способ получения рекомбинантного мутеина [c112s] легкой цепи энтерокиназы человека, рекомбинантный мутеин [c112s] легкой цепи энтерокиназы человека // 2495934
Изобретение относится к биотехнологии и предоставляет способ получения рекомбинантного мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, трансформированной экспрессионной плазмидой, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий неактивный предшественник мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека, включающий последовательность, кодирующую отщепляемый N-концевой пептид, включающий гексагистидиновый кластер и последовательность узнавания энтерокиназы, и слитую с ним в рамке последовательность, кодирующую предшественник мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека с неотщепляемым С-концевым гексагистидиновым кластером под контролем промотора, функционирующего в бактериальной клетке.

Плазмида для экспрессии в клетках бактерии рода escherichia предшественника рекомбинантного фрагмента тканевого активатора плазминогена (тап) человека (ретеплазы), бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент предшественника рекомбинантного фрагмента тап человека (ретеплазы) или [-1]метионил-фрагмент тап человека (ретеплазы), предшественник рекомбинантного фрагмента тап человека (ретеплазы), способ получения предшественника рекомбинантного фрагмента тап человека (ретеплазы) // 2495933
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения предшественника рекомбинантного фрагмента тканевого активатора плазминогена (ТАП) человека (ретеплазы) с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, трансформированной экспрессионной плазмидой, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий предшественник рекомбинантного фрагмента тканевого активатора плазминогена (ТАП) человека (ретеплазы), включающий последовательность, кодирующую отщепляемый N-концевой пептид, включающий декагистидиновый кластер и слитую в рамке последовательность узнавания энтерокиназы, или фрагмент ДНК, кодирующий [-1]метионил-фрагмента ТАП человека (ретеплазы), под контролем промотора, функционирующего в указанной бактериальной клетке.
Проводят ферментацию питательной среды на основе гидролизатов кукурузного крахмала актиномицетом. Проводят ультрафильтрацию полученного фильтрата культуральной жидкости с активностью 4250±250 ИЕ/см3 через мембраны с отсечением 5 кДа.
Изобретение относится к биотехнологии, сельскому хозяйству и зоотехнии и может быть использовано для промышленного выращивания бройлеров высокопродуктивных кроссов.
Изобретение относится к области медицинской микробиологии, а именно к способу молекулярно-генетического типирования штаммов Bordetella pertussis. Способ включает выделение ДНК из штаммов B.pertussis, проведение полимеразной цепной реакции с одновременным введением специфических праймеров PF-PR для получения ампликонов фрагмента промотора коклюшного токсина ptxP, рестрикции полученных ампликонов эндонуклеазами KpnI и MluI и электрофорезу продуктов рестрикции в агарозном геле.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к штамму Bacillus subtilis 8A. Штамм депонирован под номером RCAM 00876 в коллекции ГНУ ВНИСХМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ.

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии. Представлена протеаза, обладающая усовершенствованной молокосвертывающей активностью, содержащая аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 80% идентичую SEQ ID NO: 3, где указанная протеаза имеет, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из: (а) замены глутамина, соответствующего глутамину в положении 265 в SEQ ID NO:3, на кислую аминокислоту; и (b) замены глутамина, соответствующего глутамину в положении 266 в SEQ ID NO:3, на кислую аминокислоту.

Изобретение относится к медико-биологической области биотехнологии. .
Изобретение относится к биотехнологии и может быть применено в пищевой промышленности. .

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается использования базидиальных грибов рода Coprinus в качестве молокосвертывающих ферментов при производстве сыра с применением ферментов микробного происхождения.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к новым способам получения ферментного препарата лакказы. .

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к созданию на основе коллагеназы микробного происхождения субстанции для лекарственных средств. .

Изобретение относится к биотехнологии и касается обработки кожевенно-мехового сырья с помощью нового комплексного ферментного препарата. .

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к получению штамма - продуцента комплекса гидролитических ферментов, в состав которого входят кислые и слабокислые протеазы, - амилаза, а также сопутствующие ферменты, такие как экзо -- глюканаза, цитаза, ксиланаза, и может быть применено в микробиологической промышленности при получении ферментных препаратов для гидролиза растительных, животных и микробных субстратов в пищевой промышленности, бродильных производствах, сельском хозяйстве, при получении аминокислотных смесей, ферментолизатов дрожжей и других биологически активных веществ.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения из крахмалосодержащего сырья лимонной кислоты и кислотоустойчивых ферментов: -амилазы и глюкоамилазы, которые используются в хлебопечении, пивоварении, крахмалопаточной промышленности, медицине, т.е.
Наверх