Способ изотопного обогащения клеток e.coli


 


Владельцы патента RU 2499042:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Оренбургский государственный университет" (RU)

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для получения изотопно-меченых клеток микроорганизмов. Способ обогащения клеток E.coli изотопами магния предусматривает культивирование клеток E.coli в течение 10-16 ч при температуре 37°C в водном растворе, обогащенном изотопом магния 24Mg или 25Mg, или 26Mg. Водный раствор включает NH4Cl, глюкозу, Na2HPO4, KH2PO4, NaCl и MgSO4 при следующем содержании компонентов на 1 л дистиллированной воды: NH4Cl - 2 г, MgSO4 - 200-260 мг, глюкоза (сухая) - 8-10 г, Na2HPO4 - 11,9-12,1 г, KH2PO4 - 5,95-6,05 г, NaCl - 0,98-1,02 г. Изобретение обеспечивает эффективное замещение природного внутриклеточного магния клеток E.coli соответствующим изотопом. 5 табл.

 

Способ изотопного обогащения клеток E.coli относится к микробиологии, энзимологии для получения изотопно-меченых клеток микроорганизмов.

Известен способ изотопного обогащения (патент РФ №2399409, опубл. 20.09.10), содержащий стадию осуществления изотопного обмена между водным раствором, содержащим, по меньшей мере, два компонента, каждый из которых представлен формулой H2O-H2SiF6·nSiF4 (где n≥0), и газом, содержащим SiF4, для обогащения стабильного изотопа Si. Возможно, что SiF4 растворяют в водном растворе до состояния насыщения, а также, что водный раствор имеет азеотропный состав.

Недостатком данного способа является невозможность его использования для обогащения клеток E.coli, т.к. данный раствор не содержит питательных веществ для бактерий и не имеет pH=6.5-7.5, при котором растут и размножаются клетки.

Техническим результатом заявляемого способа изотопного обогащения клеток E.coli является эффективное замещение природного внутриклеточного магния соответствующим изотопом.

Задача решается тем, что в способе изотопного обогащения клеток E.coli, содержащего стадию изотопного обмена между клетками E.coli и водным раствором, отличающийся тем, что изотопный обмен между клетками E.coli и водным раствором осуществляют в течение 10-16 часов при температуре 37°C, причем в водный раствор, обогащенный по одному из изотопов магния 24Mg, 25Mg, 26Mg, входят NH4Cl, глюкоза, Na2HPO4, KH2PO4, NaCl и MgSO4, при следующем содержании на 1 л дистиллированной воды:

NH4Cl - 2 г;

MgSO4 - 200-260 мг;

глюкоза (сухая) - 8-10 г;

Na2HPO4 - 11,9-12,1 г;

KH2PO4 - 5,95-6,05 г;

NaCl - 0,98-1,02 г.

Способ изотопного обогащения клеток E.coli осуществляли следующим образом.

Музейный штамм Escherichia coli K12TG1 предварительно инкубировался в Lb-бульоне (производства Sigma Aldrich Co.), который содержит природный магний, в течение 24 часов при температуре 37°C. Далее трижды производился посев микроорганизмов исходной концентрации 105 KOE/мл в синтетическую питательную среду М9 - водный раствор с разной концентрацией 6 компонентов на 1 л дистиллированной воды.

Первый водный раствор:

NH4Cl - 2 г; MgSO4 - 200 мг; глюкоза (сухая) - 8 г; Na2HPO4 - 11,9 г; KH2PO4 - 5,95 г; NaCl - 0,98 г.

Второй водный раствор:

NH4Cl - 2 г; MgSO4 - 230 мг; глюкоза (сухая) - 9 г; Na2HPO4 - 12 г; KH2PO4 - 6 г; NaCl - 1 г.

Третий водный раствор:

NH4Cl - 2 г; MgSO4 - 260 мг; глюкоза (сухая) - 10 г; Na2HPO4 - 12, 1 г; KH2PO4 - 6,05 г; NaCl - 1,02 г.

Первые три вещества, NH4Cl, глюкоза (сухая) и MgSO4, входят в питательный раствор, необходимый для поддержания жизнеспособности клеточной культуры и ее роста, требуемого для накопления изотопно-обогащенной магнием клеточной биомассы. Последние три вещества, Na2HPO4, KH2PO4 и NaCl, являются буферным раствором, который поддерживает pH=6.5-7.5 среды. Два раствора готовятся отдельно, стерилизуют в автоклаве 25 минут при давлении 1,5-2 атм. После автоклавирования растворы сливаются; pH контролируют до и после стерилизации. Изотопы магния добавляют в среду в виде сульфата магния MgSO4, концентрация которого составляет 2.2 мМ/л. Характеристики существующих в природе стабильных изотопов магния и их природное содержание приведены в таблице 1.

Таблица 1
Изотоп Магнитный момент (µв) Природное содержание, %
24Mg 0 79
25Mg 0.85 10
26Mg 0 11

Для приготовления сульфатов использовались изотопно-чистые оксиды 24MgO, 25MgO и 26MgO производства ФГУП «Электрохимприбор» с рекордно высоким изотопным обогащением 99.8, 98.8 и 97.7 атомных процентов, соответственно. Паспортные данные оксидов изотопов магния приведены в таблицах 2-3.

Таблица 2
Содержание изотопа магния, ат.%
Изотоп для 24MgO для 26MgO для 25MgO
24Mg 99,88±0,02 97,70±0,20 99,37±0,08
25Mg 0,07 1,98 0,33
26Mg 0,05 0,20 0,30
Таблица 3
Содержание примесей, вес.%
Элемент для 24MgO для 26MgO для 25MgO
K <0,005 <ПО 0,017
Na 0,002 <ПО 0,004
Ca <0,005 0,008 0,34
Fe <0,005 0,019 0,048
Al 0,0011 0,0008 0,031
Si <0,005 <ПО <0,005
Cr - <ПО 0,0030
Ni 0,0001 <0,0002 <0,0001
Cu 0,0029 0,0021 0,0004
Mn 0,0032 0,0021 0,059
Pb <ПО* <ПО 0,0015
Lu <ПО <ПО 0,0003
Pt <ПО 0,0031 0,0002
B <ПО 0,008 0,0026
Ti <ПО <ПО 0,0015
Co <ПО <ПО 0,0011
Sr <ПО <ПО 0,0002
Ba <ПО 0,0003 0,0002
La <ПО <ПО 0,0003
Eu <ПО <ПО 0,0002
Zn 0,0006 0,0005 0,0009
Ru <ПО 0,0001 <ПО
Cd <ПО 0,0001 <ПО
P <0,005 <ПО <ПО

Контроль соотношения изотопов магния, содержащихся в питательной среде М9, осуществлялся с помощью масс-спектрометрического анализа. Соотношение изотопов магния для сред М9 в % приведено в таблице 4.

Таблица 4
Изотоп Среда М9 с 24Mg Среда М9 с 25Mg Среда М9 с 26Mg
24Mg 99,7 1,4 4,5
25Mg 0,12 98,1 0,61
26Mg 0,13 0,5 94,9

В подготовленные таким образом водные растворы производили посев микроорганизмов с начальной концентрацией 105 КОЕ/мл (колониеобразующих единиц на 1 мл раствора). После этого образцы выдерживали в термостате при температуре 37°C в течение 10, 13 и 16 часов. Контроль накопления клеточной биомассы осуществлялся с помощью стандартных методов измерения оптической плотности суспензии микроорганизмов и измерения колониеобразующих единиц. При достижении бактериями плотности популяции 108-109 КОЕ/мл или 0,6-0.7 отн. ед. оптической плотности клеточная биомасса осаждалась методом центрифугирования на 15 тыс. об. в течение 15 минут. После производился двукратный отмыв клеточной биомассы бактерий E.coli дистиллированной водой с повторным центрифугированием.

Полученная таким образом клеточная биомасса исследовалась на содержание изотопов магния масс-спектральным (PlasmaQuad 2, VG Elemental, Англия) и атомно-эмиссионным методами (ICAP-61, Thermo Jarrell Ash, США). Клеточная биомасса предварительно подвергалась лиофильной сушке и автоклавному разложению. Данные по соотношению изотопов магния в клетках E.coli после цикла культивирования на изотопных средах М9 приведены в таблице 5.

Таблица 5
Изотоп Исход-ная куль тура Выдержка в термоста-те, час. Клетки, выращенные на среде М9 с 24Mg Клетки, выращенные на среде М9 с 25Mg Клетки, выращенные на среде М9 с 26Mg
1-й водный р-р 2-й водный р-р 3-й водный р-р 1-й водный р-р 2-й водный р-р 3-й водный р-р 1-й водный р-р 2-й водный р-р 3-й водный р-р
24Mg 87,8 10 90,8 94,5 95,1 5,9 6,3 6,1 12,5 9,8 9,8
13 91,1 99,5 99,4 6,0 6,6 6,5 10,4 10,0 9,9
16 93,5 99,5 99,5 6,2 6,6 6,5 9,7 10,0 10,0
25Mg 5,9 10 6,2 3,5 3,4 90,2 91,9 91,3 2,1 3,3 3,7
13 5,8 0,23 0,22 91,9 92,5 92,1 2,0 1,6 2,6
16 4,7 0,24 0,23 92,3 92,5 92,4 2,2 1,6 1,7
26Mg 6,3 10 3,0 2,0 1,4 3,9 1,8 2,6 85,4 86,9 86,5
13 3,1 0,23 1,5 2,1 0,87 1,4 87,6 88,4 87,5
16 1,8 0,22 0,22 1,5 0,87 1,1 88,1 88,4 88,3
* Погрешность определения от 1.2% отн. для 95%; до 15% для 0.5%

После 10-16 часов культивирования на магний-изотопных средах, в течение которых происходил изотопный обмен между клетками и водным раствором, бактерии были обогащены по соответствующему изотопу магния до 99,5 по сравнению с исходной бактериальной культурой, выращенной на питательном бульоне Lb, как видно из второго столбца данных таблицы 5. Цикл культивирования бактерий на питательных средах М9, содержащих изотопы магния, приводит к практически полному замещению внутриклеточного магния на конкретный изотоп.

Используемый способ изотопного обогащения микроорганизмов в присутствии магнитного и немагнитных изотопов магния оказался уникальным и применяется впервые. Данный способ может использоваться для получения изотопно-меченых клеток микроорганизмов, который найдет свое применение в различных исследовательских работах в микробиологии, энзимологии. Кроме того, он может использоваться в различных медицинских и биотехнологических приложениях как простой и нетрудоемкий способ получения изотопно-обогащенных биомолекул (АТФ, ДНК и т.д.), клеточных подструктур и самих клеток. Немаловажно, что подобные выделенные молекулы и клеточные подструктуры нерадиоактивны, так как для изотопного обогащения используются только стабильные изотопы. Данный способ может быть модифицирован для других стабильных изотопов жизненно важных химических элементов, а также для других микроорганизмов.

Таким образом, по сравнению с прототипом, заявляемый способ изотопного обогащения клеток E.coli позволяет эффективно проводить до 90% изотопный обмен между природным магнием, изначально содержащимся в клетках, и изотопом магния из водного раствора.

Способ обогащения клеток E.coli изотопами магния, предусматривающий культивирование клеток E.coli в течение 10-16 ч при температуре 37°C в водном растворе, обогащенном изотопом магния 24Mg, или 25Mg, или 26Mg, включающем NH4Cl, глюкозу, Na2HPO4, KH2PO4, NaCl и MgSO4, при следующем содержании компонентов на 1 л дистиллированной воды:

NH4Cl 2 г
MgSO4 200-260 мг
глюкоза (сухая) 8-10 г
Na2HPO4 11,9-12,1 г
KH4PO4 5,95-6,05 г
NaCl 0,98-1,02 г



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к микробиологии и медицине и может быть использовано в фармацевтической промышленности. .

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к способам получения биологически активной субстанции с регенеринстимулирующим действием из эмбрионально-яичной массы для приготовления противоожоговой пластины и противоожоговым пластинам на его основе, и может быть использовано для повышения регенеративной способности тканей организма при ожогах, трофических язвах, пролежнях и других нарушениях целостности тканей.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в молочной промышленности. .

Изобретение относится к области микробных стартовых культур. .
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения эмбрионального стимулятора роста микроорганизмов, и может быть использовано как составная часть питательной среды при выращивании различных видов микроорганизмов.

Изобретение относится к медицинской микологии и клинической микробиологии. .

Изобретение относится к получению ферментированного молочного продукта. Способ получения ферментированного продукта включает инокулирование молока бактериями, ферментацию молока и упаковывание готового продукта.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве пищевых и кормовых добавок для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности биодеградации органических соединений с помощью микроорганизмов. Предложен способ биодеградации дротаверина гидрохлорида (спазмолитик НОШПА).
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу приготовления бактериального препарата ацидофильных культур, и может быть использовано при получении молочнокислых микроорганизмов при производстве биологически активной пищевой добавки для профилактики дисбактериозов, дисфункции кишечника у детей и взрослых, а также у сельскохозяйственных животных.
Изобретение относится к мелиорации почв и может быть использовано при рекультивации почв, загрязненных нефтью. Для снижения токсичности почв и затрат на мелиорацию используют 3 вида глин различного химического состава с добавлением мелассы и биопрепарата Линекс в следующих соотношениях, масс.%: глина диалбекулит - 38-40; глина ирлит 1 - 28-32; глина ирлит 7 - 16-20; меласса - 8-12; биопрепарат Линекс - 2-4.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к новому, высокоэффективному способу получения такролимуса (FK-506) методом микробиологического синтеза. Способ предусматривает приготовление инокулята клеток Streptomyces sp.
Изобретение относится к синбиотическому препарату, содержащему N-ацетил-лактозамин и/или олигосахарид, включающий N-ацетил-лактозамин, и пробиотический штамм Lactobacillus sp.Олигосахарид, содержащий N-ацетил-лактозамин, представляет собой лакто-N-тетраозу или лакто-N-неотетраозу.
Изобретение относится к области медицинской микробиологии, а именно к способу молекулярно-генетического типирования штаммов Bordetella pertussis. Способ включает выделение ДНК из штаммов B.pertussis, проведение полимеразной цепной реакции с одновременным введением специфических праймеров PF-PR для получения ампликонов фрагмента промотора коклюшного токсина ptxP, рестрикции полученных ампликонов эндонуклеазами KpnI и MluI и электрофорезу продуктов рестрикции в агарозном геле.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к штамму Bacillus subtilis 8A. Штамм депонирован под номером RCAM 00876 в коллекции ГНУ ВНИСХМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ.
Изобретение относится к пищевому продукту с длительным сроком хранения и к применению пробиотических спор и/или покоящихся клеток в качестве пробиотического ингредиента в указанном продукте.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам приготовления биологически активных кормовых добавок для животных, птицы, рыбы. Готовят жидкую культуру штамма Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-1959 - продуцента лизина глубинным способом и жидкие культуры штаммов Bacillus subtilis ВКПМ В-8130, Bacillus subtilis ВКПМ В-2984, Bacillus subtilis ВКПМ В-4099 и Bacillus licheniformis ВКПМ В-4162. К жидкой культуре штамма Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-1959 в количестве 30 л добавляют 35 л смеси, состоящей из жидких культур Bacillus subtilis ВКПМ В-8130, Bacillus subtilis ВКПМ В-2984 и Bacillus subtilis ВКПМ В-4099, взятых в соотношении 6:6:1, соответственно. Общую смесь жидких культур наносят на предварительно подготовленный носитель - стерильный свекловичный жом, обработанный целлюлолитическим ферментом и обогащенный ферментолизатом дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Перемешивают, выдерживают, проводят твердофазную ферментацию в заданных условиях ограниченного доступа кислорода. Добавляют 65 л жидкой культуры Bacillus licheniformis ВКПМ В-4162, содержащей не менее 5,6×108 КОЕ/г. Смесь перемешивают и высушивают до влажности 8-10%. Добавляют сухие порошки травы эхинацеи пурпурной и плодов расторопши пятнистой, соответственно, из расчета 20-50 г на 1 кг конечного продукта. Полученную смесь перемешивают и подвергают дроблению до получения однородной массы. Изобретение позволяет повысить качество кормов. 3 табл., 1 пр.
Наверх