Рекомбинантная плазмида, рекомбинантный штамм, рекомбинантный белок вмр-2 и способ выделения рекомбинантного белка в димерной форме

Авторы патента:


Рекомбинантная плазмида, рекомбинантный штамм, рекомбинантный белок вмр-2 и способ выделения рекомбинантного белка в димерной форме
Рекомбинантная плазмида, рекомбинантный штамм, рекомбинантный белок вмр-2 и способ выделения рекомбинантного белка в димерной форме
Рекомбинантная плазмида, рекомбинантный штамм, рекомбинантный белок вмр-2 и способ выделения рекомбинантного белка в димерной форме
Рекомбинантная плазмида, рекомбинантный штамм, рекомбинантный белок вмр-2 и способ выделения рекомбинантного белка в димерной форме
Рекомбинантная плазмида, рекомбинантный штамм, рекомбинантный белок вмр-2 и способ выделения рекомбинантного белка в димерной форме
Рекомбинантная плазмида, рекомбинантный штамм, рекомбинантный белок вмр-2 и способ выделения рекомбинантного белка в димерной форме
Рекомбинантная плазмида, рекомбинантный штамм, рекомбинантный белок вмр-2 и способ выделения рекомбинантного белка в димерной форме

 


Владельцы патента RU 2499048:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России). (RU)
Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство промышленности и торговли Российской Федерации (Минпромторг России) (RU)

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой рекомбинантную плазмиду BMPRIA-CBD, штамм E.coli, трансформированный данной плазмидой. Изобретение относится также к рекомбинантному белку BMPRIA-CBD, с использованием которого получают белок BMP-2. Изобретение позволяет получить хроматографически чистые фракции биологически активной димерной формы белка BMP-2, которые могут быть использованы в качестве остеоиндуктивных компонентов костно-пластических материалов нового поколения. 4 н.п. ф-лы, 2 ил., 6 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и медицине и может быть использовано для получения обладающей биологической активностью димерной формы рекомбинантного костного морфогенетического белка ВМР-2, которая может применяться в качестве остеоиндуктивного компонента костнопластических материалов медицинского назначения: имплантатов, покрытий и др.

Одним из ключевых компонентов современных костнопластических материалов, обеспечивающих их высокую остеоиндуктивность, являются костные морфогенетические белки. На сегодняшний день известно около двадцати видов костных морфогенетических белков, которые играют важную роль в регуляции роста, дифференцировки и апоптоза клеток различных типов, включая остеобласты, хондробласты, нервные клетки, эпителиальные клетки и др. [Sakou T. Bone morphogenetic proteins: from basic studies to clinical approaches. Bone. 1998, Vol.22, P.591-603].

Ведущая роль в формировании и регенерации костной и хрящевой тканей принадлежит костным морфогенетическим белкам, обладающим выраженными остеоиндуктивными свойствами [Urist M.R., Strates B.S. Bone morphogenetic protein. J Dent Res. 1971, Vol.50, P.1392-1406; Urist M.R., Nogami H., Mikulski A. A bone morphogenetic polypeptide. Calcif Tissue Res. Suppl. 1976, P.81-87]. Среди всего многообразия костных морфогенетических белков ведущую роль в остеогенезе играют несколько факторов, в том числе BMP-2. В норме BMP-2 находится в костной ткани в комплексе с высокомолекулярными гликозоаминогликанами и высвобождается при повреждениях кости, что способствует миграции мезенхимальных клеток и их дифференцировке в остеобласты, а также стимулирует пролиферацию клеток. Основной функцией костного морфогенетического белка 2 является поддержание нормального остеогенеза в организме [Chen D., Zhao M., Mundy G.R. Bone morphogenetic proteins. Growth Factors. 2004, Vol.22, P.233-241; Bessa P.C., Casal M., Reis R.L. Bone morphogenetic proteins in tissue engineering: the road from the laboratory to the clinic, part I (basic concepts). J Tissue Eng Regen Med. 2008, Vol.2, P.1-13].

Нативный белок BMP-2 является гомодимером, который состоит из двух полипептидных цепей, соединенных S-S-связью остатков цистеина каждой субъединицы. Каждая мономерная единица в составе белка также имеет внутренние S-S-связи, образованные остатками цистеинов. Показано, что только в форме димера, стабилизированного S-S-связями, BMP-2 обладает биологической активностью и способен взаимодействовать с рецепторами остеогенных клеток - трансмембранными серин/треониновыми киназами, активируя пролиферацию и дифференцировку остеобластов [Reddi A.H. Morphogenesis and tissue engineering of bone and cartilage: inductive signals stem cells, and biomimetic biomaterials. Tissue Eng. 2000, Vol.6, P.351-359].

Выделение и очистка рекомбинантного белка BMP-2, получаемого методом бактериального синтеза в клетках E.coli, сопряжено с рядом сложностей, связанных с необходимостью удаления липополисахаридов, балластных белков, ДНК и РНК штаммов-продуцентов, а также получения белка в функционально активной димерной форме, т.е. отделения фракций, содержащих мономеры, тримеры и т.д. [Шарапова Н.Е., Котнова А.П., Галушкина З.М., Лаврова Н.В., Полетаева Н.Н., Тухватулин А.Э., Семихин А.С., Громов А.В., Соболева Л.А., Ершова А.С., Зайцев В.В., Сергиенко О.В., Лунин В.Г., Карягина А.С. Получение рекомбинантного костного морфогенетического белка 2 человека в клетках Escherichia coli и тестирование его биологической активности in vitro и in vivo. Молекулярная биология. 2010, №6, С.1036-1044].

Установлено, что различные BMP способны связываться с рецепторами двух типов: типа I и типа II. Наиболее хорошо изучены условия взаимодействия BMP с рецепторами типа I, к которым относятся такие рецепторы, как BMPRIA (ALK3), BMPRIB (ALK6), ActRIA (ALK2) и др., способные взаимодействовать с этими белками только в форме димера и образовывать с ними комплексы [Kirsch T., Nickel J., Sebald W. Isolation of recombinant BMP receptor IA ectodomain and its 2:1 complex with BMP-2. FEBS Letters. 2000, Vol.468, P.215-219]. В работе коллектива ten Dijke P. показано, что в присутствии рецептора типа II (DAF4) ВМР-4 (ближайший аналог ВМР-2) максимально эффективно взаимодействует с BMPRIA и BMPRIB, a BMP-7 - с ActRIA и BMPRIB, и гораздо слабее - с BMPRIA [ten Dijke P., Yamashita H., Sampath T.K., Reddi A.H., Estevez M., Riddle D.L., Ichijo H., Heldin C.H., Miyazono K. Identification of type I receptors for osteogenicprotein-1 and bone morphogenetic protein-4. J Biol Chem. 1994, Vol.269 (25), P.16985-16988].

В другой работе изучалось связывание BMP с иммобилизованными рецепторами [Heinecke K., Seher A., Schmitz W., Mueller T.D., Sebald W., Nickel J. Receptor oligomerization and beyond: a case study in bone morphogenetic proteins. BMC Biol. 2009, Vol.7, P.59]. Результаты свидетельствуют о том, что BMP-2 и ВМР-7 связываются с BMPRIA и BMPRIB, при этом BMPRIA эффективно связывает BMP-2 (KDkin=0,8).

Описанные свойства рецепторов могут быть использованы для выделения и очистки биологически активной димерной формы белка BMP-2.

В качестве ближайшего аналога может быть принято изобретение (патент №2408727 от 10.01.2011), в котором решена задача получения рекомбинантного белка ВМР-2 за счет его синтеза в бактериальных клетках в форме бифункционального белка Collbd-BMP2 с коллагенсвязывающим доменом, что позволяет иммобилизовать его на коллагенсодержащем носителе. Однако использование предлагаемого способа иммобилизации на коллагене для выделения белка затруднительно по двум причинам. Во-первых, при иммобилизации путем аффинного взаимодействия коллагенсвязывающего домена белка Collbd-BMP2 с коллагенсодержащим носителем будет происходить связывание всех форм белка: мономеров, димеров, тримеров и т.д., т.е., выделение биологически активной димерной формы таким образом невозможно. Во-вторых, следует отметить, что коллагенсодержащие носители довольно дороги.

Задачей, решаемой заявленной группой изобретений, является разработка эффективной технологии получения и очистки рекомбинантного белка BMP-2, обеспечивающей получение препарата белка в биологически активной форме димера высокой степени очистки.

Упомянутая задача решается за счет получения рекомбинантного белка BMPRIA, являющегося рецептором BMP-2, в частности, за счет введения в его состав целлюлозосвязывающего домена (CBD), а также за счет введения между функциональными доменами спейсерной последовательности для сохранения возможности каждого домена связываться со своим лигандом. Помимо этого, упомянутая задача решается за счет возможности одностадийной иммобилизации рекомбинантного белка BMPRIA с целлюлозосвязывающим доменом (CBD), на целлюлозосодержащей колонке, а также способности димерной формы BMP-2 связываться с рецептором BMPRIA.

Сущность изобретения заключается в том, что способ получения рекомбинантного белка BMP-2 включает следующие стадии:

- подготовка сорбента с иммобилизованным белком BMPRIA, куда входят следующие операции: получение рекомбинантной плазмиды pBMPRIA, выращивание клеток штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pBMPRIA], индукция синтеза белка BMPRIA-CBD, разрушение клеток и получение супернатанта, содержащего белок BMPRIA-CBD, иммобилизация белка BMPRIA-CBD и отмывание целлюлозосодержащего сорбента со связавшимся белком;

- заполнение хроматографической колонки подготовленным сорбентом;

- сорбция димерной формы рекомбинантного белка BMP-2;

- элюирование димерной формы сорбированного белка BMP-2;

- анализ собранной фракции методом электрофореза в неденатурирующих условиях по Лэммли;

и отличается тем, что рекомбинантная плазмида pBMPRIA-CBD размером 4408 п.н. обеспечивает экспрессию рекомбинантного белка BMPRIA-CBD, состоящего из сигнала L-аспарагиназы Е.coli, эктодомена рецептора BMPRIA человека, спейсера из остатков глицина и серина и целлюлозосвязывающего домена CBD, и содержит:

- искусственный бактериальный оперон химерных белков, включающий: промоторную область раннего промотора бактериофага Т5 (7-87 п.н.), обеспечивающую эффективную транскрипцию контролируемой мРНК; рекомбинантный ген, обеспечивающий экспрессию целевого химерного белка (сигнал L-аспарагиназы - рецептор BMPRIA - спейсер - целлюлозосвязывающий домен CBD) (117-1124 п.н.); нетранслируемую область терминации транскрипции бактериального оперона, обеспечивающую эффективное окончание транскрипции (1164-1258 п.н.);

- бактериальный оперон bla (3343-4203 п.н. комплементарной цепи), кодирующий белок бета-лактамазу, являющуюся селективным маркером для отбора клонов-трансформантов E.coli методом селекции на ампициллине;

- бактериальный участок инициации репликации типа ColEl, обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах E.coli (1630 п.н.).

Рекомбинантный белок BMPRIA-CBD состоит из сигнального пептида из L-аспарагиназы AspB E.coli, эктодомена рецептора BMPRIA человека, спейсера из остатков глицина и серина и целлюлозосвязывающего домена CBD, и одновременно обладает способностью BMPRIA связываться со своим лигандом ВМР-2 в форме димера, а также способностью CBD взаимодействовать с целлюлозосодержащим сорбентом.

Штамм Escherichia coli M15 [pREP4, p BMPRIA-CBD], полученный трансформацией штамма Escherichia coli M15/pREP4 плазмидой pBMPRIA-CBD, который является продуцентом рекомбинантного белка BMPRIA-CBD, состоящего из сигнала L-аспарагиназы AspB E.coli, эктодомена рецептора BMPRIA человека, спейсера из остатков глицина и серина и целлюлозосвязывающего домена CBD.

Техническим результатом заявленного изобретения является обеспечение получения хроматографически чистого белка BMP-2 в димерной форме высокой степени очистки, пригодного для использования в качестве компонентов костно-пластических материалов нового поколения.

Таким образом, технический результат достигается за счет того, что разработана технология выделения и очистки BMP-2, основанная на его специфическом взаимодействии с рецептором BMPRIA.

Также указанный технический результат достигается тем, что создана рекомбинантная плазмида pBMPRIA-CBD, кодирующая бифункциональный рекомбинантный белок BMPRIA-CBD, с одной стороны, содержащий аминокислотную последовательность рецептора BMPRIA, а с другой стороны - обладающий способностью связываться с целлюлозосодержащим сорбентом, благодаря наличию целлюлозосвязывающего домена CBD из Anaerocellum thermophillum.

Упомянутый технический результат достигается с помощью создания штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pBMPRIA-CBD], являющегося продуцентом рекомбинантного белка BMPRIA-CBD. При этом отсутствие в клетках E.coli белков, способных связываться с целлюлозой, служит гарантией того, что рекомбинантный белок BMPRIA-CBD является единственным белком штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pBMPRIA-CBD], прочно связывающимся с целлюлозосодержащим сорбентом.

Таким образом, технический результат достигается за счет создания:

во-первых, рекомбинантной плазмиды pBMPRIA-CBD с последовательностью SEQ ID NO:1 размером 4408 п.н., обеспечивающей экспрессию рекомбинантного белка BMPRIA-CBD, состоящего из сигнала L-аспарагиназы Е.coli, эктодомена рецептора BMPRIA человека, спейсера из остатков глицина и серина и целлюлозосвязывающего домена CBD, и состоящей из следующих структурных элементов:

- искусственный бактериальный оперон химерных белков, включающий: промоторную область раннего промотора бактериофага Т5 (7-87 п.н.), обеспечивающую эффективную транскрипцию контролируемой мРНК; рекомбинантный ген, обеспечивающий экспрессию целевого химерного белка (сигнал L-аспарагиназы - рецептор BMPRIA - спейсер - целлюлозосвязывающий домен CBD) (117-1124 п.н.); нетранслируемую область терминации транскрипции бактериального оперона, обеспечивающую эффективное окончание транскрипции (1164-1258 п.н.);

- бактериальный оперон bla (3343-4203 п.н. комплементарной цепи), кодирующий белок бета-лактамазу, являющуюся селективным маркером для отбора клонов-трансформантов E.coli методом селекции на ампициллине;

- бактериальный участок инициации репликации типа ColEl, обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах Е.coli (1630 п.н.).

Во-вторых, рекомбинантного штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pBMPRIA-CBD], полученного трансформацией штамма Escherichia coli M15/pREP4 плазмидой по п.1, продуцента рекомбинантного белка BMPRIA-CBD, состоящего из сигнала L-аспарагиназы AspB E.coli, эктодомена рецептора BMPRIA человека, спейсера из остатков глицина и серина и целлюлозосвязывающего домена CBD.

В-третьих, рекомбинантного белка BMPRIA-CBD для выделения рекомбинантного белка BMP-2 в димерной форме из раствора, и состоящего из сигнального пептида из L-аспарагиназы AspB E.coli с последовательностью SEQ ID NO:2, эктодомена рецептора BMPRIA человека с последовательностью SEQ ID NO:3, спейсера из остатков глицина и серина с последовательностью SEQ ID NO:4 и целлюлозосвязывающего домена CBD с последовательностью SEQ ID NO:5, и одновременно обладает способностью BMPRIA связываться со своим лигандом ВМР-2 в форме димера, а также способностью CBD взаимодействовать с целлюлозосодержащим сорбентом.

В-четвертых, за счет способа выделения димерной формы рекомбинантного белка BMP-2, включающего следующие стадии:

- подготовка сорбента с иммобилизованным белком BMPRIA-CBD, включающая: получение рекомбинантной плазмиды pBMPRIA-CBD, выращивание клеток штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pBMPRIA- CBD], индукция синтеза белка BMPRIA-CBD, разрушение клеток и получение супернатанта, содержащего белок BMPRIA-CBD, иммобилизация белка BMPRIA-CBD и отмывание целлюлозосодержащего сорбента со связавшимся белком;

- заполнение хроматографической колонки подготовленным сорбентом и раствором рекомбинантного белка BMP-2;

- сорбция димерной формы рекомбинантного белка BMP-2;

- элюирование димерной формы сорбированного белка BMP-2;

- анализ собранной фракции методом электрофореза в неденатурирующих условиях.

Штамм E.coli M15 [pREP4], содержащий плазмиду pBMPRIA-CBD, - продуцент рекомбинантного белка BMPRIA-CBD и штамм E.coli M15 [pREP4], содержащий плазмиду pBMPRIB-CBD, - продуцент рекомбинантного белка BMPRIB-CBD характеризуются следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидные, неподвижные, грамотрицательные. При рассеве на чашке с 1,5% LB-агаром рост в виде отдельных колоний, иногда в R-форме с неровными краями. Хорошо растет на плотных и жидких питательных средах (LB-бульон, LB-arap, МПА, МПБ).

Физиолого-биохимические признаки. Клетки растут в пределах +4-42°C при оптимуме pH 6,8-7,5. Штаммы разлагают глюкозу, маннит с образованием кислоты, не разлагают сахарозу, арабинозу, галактозу, сбраживают мальтозу, ксилозу, сорбит, рамнозу. Существенным при использовании данных штаммов является их чувствительность к налидиксовой кислоте (25 мг/мл), стрептомицину (20 мг/мл) и рифампицину (25 мг/мл). Проявляют устойчивость к ампициллину (до 100 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды pBMPRIA-CBD, и к канамицину (до 25 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды pREP4. Указанный технический результат достигается также тем, что рекомбинантный белок BMPRIA-CBD, включающий в себя аминокислотную последовательность, определяющую его способность связывался с целлюлозосодержащим сорбентом, обеспечивает возможность его иммобилизации на сорбенте прямо из лизата, получаемого после разрушения и центрифугирования бактериальных клеток-продуцентов, и не требует проведения предварительной очистки.

Также упомянутый технический результат достигается с помощью анализа полученных фракций белка ВМР-2 методом электрофореза в неденатурирующих условиях, что позволяет оценить соотношение и количество разных олигомерных форм белка (мономеров, димеров, тетрамеров и др. в анализируемом образце.

Изобретение проиллюстрировано графическими материалами, на которых изображены: на фиг.1 - схема плазмиды pBMPRIA-CBD, на фиг.2 - электрофореграмма анализа собранной фракции белка BMP-2 методом электрофореза в неденатурирующих условиях по Лэммли (где 1 - препарат рекомбинантного белка BMP-2, до очистки; 2 - рекомбинантный белок BMPRIA-CBD, мол. масса 33,4 кДа; 3 - сорбированный белок BMP-2 (мол. масса 33,4 кДа) в комплексе с BMPRIA-CBD (мол. масса 33,4 кДа) и целлюлозосодержащим сорбентом; 4 - препарат белка BMP-2 (димер) после элюирования с сорбента, мол. масса 36 кДа; 5 - маркер молекулярной массы, 15 кДа, 23 кДа, 32 кДа, 45 кДа, 56 кДа.); последовательность нуклеотидов плазмиды pBMPRIA-CBD последовательность №1, последовательность аминокислот сигнального пептида L-asparaginase (AsnB) E.coli - последовательность №2, последовательность аминокислот эктодомена рецептора костного морфогенетического белка IA (BMPRIA) - последовательность №3, последовательность аминокислот глицин-серинового спейсера - последовательность №4, последовательность аминокислот целлюлозосвязывающего домена CBD - последовательность №5.

Все стандартные генно-инженерные и микробиологические манипуляции, а также амплификацию и секвенирование ДНК проводили по известным методикам (Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж., Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984; Под ред. Гловера Д., Клонирование ДНК. Методы. Пер. с англ. М., Мир, 1988; Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Sharf S.J., Higuchi R., Horn G.T., Mullis K.B., Erlich Н.А. Science. 1988, Vol.239, №4839, P.487-491; Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1977, Vol.74, P.5463-5467).

Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.

Пример 1. Подготовка сорбента с иммобилизованным белком BMPRIA-CBD.

а) Получение рекомбинантной плазмиды pBMPRIA-CBD. Фрагмент гена, кодирующий эктодомен рецептора BMPR-IA, получали синтетически. Для этого участок нуклеотидной последовательности гена BMPRIA, кодирующий эктодомен рецептора BMPRIA, разбивали на 8 олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды спланированы таким образом, что при гибридизации они образуют двухцепочечный фрагмент ДНК, содержащий липкие концы, соответствующие сайтам гидролиза рестриктаз NcoI (CCATGG) и BglII (AGATCT). При синтезе олигонуклеотиды были фосфорилированы по 5'-концу.

Для получения двухцепочечного фрагмента ДНК смесь олигонуклетидов в эквимолярном количестве (по 20 пкМ) прогревали при 95°C (10 мин) и в течение 4 часов охлаждали до 25°C.

Затем плазмидный вектор ptt10, содержащий участок, кодирующий глицин-сериновый спейсер - целлюлозосвязывающий домен CBD, гидролизовали эндонуклеазами рестрикции NcoII и BamHI при 37°C в буфере, содержащем 66 мМ Трис-ацетата (pH 7,9 при 37°C), 20 мМ ацетата магния, 132 мМ ацетата калия и 0,2 мг/мл BSA в течение 1,5 ч.

Полученную смесь, содержащую двухцепочечные фрагменты гена эктодомена рецептора BMPRIA размером 255 п.н., объединяли с фрагментом плазмиды ptt10 (4153 п.н.), гидролизованной эндонуклеазами рестрикции NcoI и BamHI. Лигирование проводили с помощью ДНК-лигазы фага Т4 в буфере, содержащем 40 мМ Трис-HCl (pH 7,8 при 25°C), 10 мМ хлористого магния, 10 мМ ДТТ и 5 мМ АТФ. Лигированную смесь ДНК использовали для трансформации клеток E.coli M15 [pREP4] методом электропорации. Трансформированные клетки отбирали на агаризованной среде LB с антибиотиками канамицином (25 мкг/мл) и ампициллином (100 мкг/мл). Из отобранных рекомбинантных клонов выделяли плазмидную ДНК pBMPRIA-CBD методом щелочного лизиса. Отобранные клоны секвенировали и подтвердили наличие вставки, кодирующей эктодомен рецептора BMPRIA человека.

б) Выращивание клеток штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pBMPRIA-CBD].

Для получения штамма E.coli - продуцента рекомбинантного белка BMPRIA-CBD, клетки штамма E.coli M15 [pREP4] (Nals, Strs, rifs, lac-, ara-, gal-, mtl-, F-, recA+, uvr+) трансформировали плазмидой pBMPRIA-CBD. Трансформированные клетки выращивали в 500 мл среды LB при 37°C до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 600 нм.

в) Индукция синтеза белка BMPRIA-CBD.

По достижении культурой оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 600 нм, индуцировали синтез рекомбинантного белка BMPRIA-CBD путем добавления в среду 150 мкл 0,1 М раствора изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида. Затем культуру выращивали в течение 4 часов.

г) Разрушение клеток и получение супернатанта, содержащего белок BMPRIA-CBD.

Биомассу клеток (1,5 г) суспендировали в 50 мл буфера, содержащего 1% тритона X-100, 100 мМ NaCl, 25 мМ трис-HCl, pH 8,0. Добавляли лизоцим до концентрации 10 мкг/мл, инкубировали в течение 15-30 мин и разрушали клетки ультразвуком (амплитуда 45%, 1,5 мин дважды с перерывом в 10 мин). Лизат осветляли центрифугированием при 13000 g в течение 30 мин. Супернатант содержал растворимый рекомбинантный белок BMPRIA-CBD.

д) Иммобилизация белка BMPRIA-CBD и отмывание целлюлозосодержащего сорбента со связавшимся белком.

Полученный супернатант, содержащий белок BMPRIA-CBD, инкубировали с 20 мл 50% суспензии целлюлозосодержащего сорбента (perloza MT 200, Iontosorb, Чехия) в течение 4-18 часов. Затем сорбент тщательно и многократно отмывали от несвязавшегося белка раствором, содержащим 1% тритона Х-100, 100 мМ NaCl, 25 мМ трис-HCl, pH 8,0, путем суспендирования сорбента в буфере и последующего центрифугирования. Полученный сорбент содержал в качестве аффинного лиганда иммобилизованный BMPRIA-CBD (приблизительно 1 мг белка на 1 мл сорбента) (фиг.2, дорожка 2).

Пример 2. Заполнение хроматографической колонки подготовленным сорбентом.

В колонку вносили 5 мл сорбента с BMPRIA-CBD и для уравновешивания пропускали через нее десятикратный объем буферного раствора, содержащего 100 мМ NaCl, 25 мМ трис-HCl, pH 8,0.

Пример 3. Сорбция димерной формы рекомбинантного BMP-2.

Раствор рекомбинантного белка BMP-2, содержащий мономерные, димерные и другие олигомерные формы белка (фиг.2, дорожка 1), пропускали через подготовленную колонку со скоростью 1 мл в минуту. Димерная форма ВМР-2 связывалась с иммобилизованным на сорбенте белком BMPRIA-CBD (фиг.2, дорожка 3).

Пример 4. Элюирование димерной формы сорбированного белка BMP-2.

Колонку со связавшимся белком BMP-2 промывали пятикратным объемом буфера, содержащего 100 мМ NaCl, 25 мМ трис-HCl, pH 8,0. Элюирование связавшейся димерной формы белка BMP-2 проводили с помощью пропускания через колонку 20 мл буферного раствора, содержащего 1,5 М NaCl в 25 мМ трис-HCl, pH 8,0, со скоростью 1 мл в минуту (фиг.2, дорожка 4).

Пример 5. Анализ собранных фракций методом электрофореза в неденатурирующих условиях по Лэммли.

Для анализа собранных фракций рекомбинантного белка BMP-2 в димерной форме применяли метод электрофореза в ПААГ в неденатурирующих условиях. Разделение белков проводили в 12% полиакриламидном геле в стандартной системе буферов (электродный буфер: 25 мМ Трис-HCl, 192 мМ глицина, 0,1% додецилсульфата натрия, pH 8,3; буфер для геля: 375 мМ Трис-HCl, pH 8,8). Образцы вносили в лунки концентрирующего геля (4% акриламида и 3% N,N-метиленбисакриламида, 0,125 М трис-HCl, pH 6,8) в лизирующем буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl, pH 6,8, 10% глицерина, 0,01% бромфенолового синего. Электрофоретическое разделение проводили при токе 20 мА до достижения бромфеноловым синим нижней границы разделяющего геля. Белковые зоны окрашивали красителем Кумасси R 250, растворенным в смеси вода/спирт/уксусная кислота в соотношении 5:3:1, а затем неокрашенные зоны отмывали раствором, содержащим 10% ледяной уксусной кислоты и 10% изопропанола (фиг.2).

Пример 6. Определение биологической активности препарата рекомбинантного белка ВМР-2 в форме димера. Проверку биологической активности препаратов рекомбинантных белков BMP-2 и ВМР-7 осуществляли в системе in vitro в культурах клеток линий С2С12 и С3Н10Т1/2 [Шарапова Н.Е., Котнова А.П., Галушкина З.М., Лаврова Н.В., Полетаева Н.Н., Тухватулин А.Э., Семихин А.С., Громов А.В., Соболева Л.А., Ершова А.С., Зайцев В.В., Сергиенко О.В., Лунин В.Г., Карягина А.С. Получение рекомбинантного костного морфогенетического белка 2 человека в клетках Escherichia coli и тестирование его биологической активности in vitro и in vivo. Молекулярная биология. 2010, №6. С.1036-1044].

Клетки мышей линий С2С12 и С3Н10Т1/2 засевали в концентрации 104 клеток на лунку в 48-луночном планшете и культивировали с использованием среды DMEMF12 (Biofluids, США), содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Gibco, США), при 37°C во влажной камере в атмосфере 5% СО2 в течение 24 часов. Затем клетки в течение трех суток инкубировали в 400 мл среды DMEMF12, содержащей 0,5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота и рекомбинантный белок BMP-2 (1, 10, 100 мкг). Отмывали клетки фосфатно-солевым буферным раствором и разрушали их с помощью добавления 0,1% раствора Тритон-Х-100 в фосфатно-солевом буферном растворе и трехкратной процедуры замораживания-оттаивания для разрушения клеточных мембран. Активность щелочной фосфатазы определяли по общепринятой методике с использованием р-нитрофенилфосфата в качестве субстрата. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорд. В качестве положительного контроля использовали коммерческий препарат белка BMP-2 человека (BioVision Research Products), в качестве отрицательного - буферный раствор.

Удельная активность препаратов рекомбинантного белка BMP-2 составила 105 ед. акт. щелочной фосфатазы на 1 мг белка.

1. Рекомбинантная плазмида pBMPRIA-CBD с последовательностью SEQ ID NO: 1 размером 4408 п.н., обеспечивающая экспрессию рекомбинантного белка BMPRIA-CBD, состоящего из сигнала L-аспарагиназы E.coli, эктодомена рецептора BMPRIA человека, спейсера из остатков глицина и серина и целлюлозосвязывающего домена CBD, и состоящая из следующих структурных элементов:
искусственный бактериальный оперон химерных белков, включающий: промоторную область раннего промотора бактериофага Т5 (7-87 п.н.), обеспечивающую эффективную транскрипцию контролируемой мРНК; рекомбинантный ген, обеспечивающий экспрессию целевого химерного белка (сигнал L-аспарагиназы - рецептор BMPRIA - спейсер - целлюлозосвязывающий домен CBD) (117-1124 п.н.); нетранслируемую область терминации транскрипции бактериального оперона, обеспечивающую эффективное окончание транскрипции (1164-1258 п.н.);
бактериальный оперон bla (3343-4203 п.н. комплементарной цепи), кодирующий белок бета-лактамазу, являющуюся селективным маркером для отбора клонов-трансформантов E.coli методом селекции на ампициллине;
бактериальный участок инициации репликации типа ColEl, обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах E.coli (1630 п.н.).

2. Рекомбинантный штамм Escherichia coli M15 [pREP4, pBMPRIA-CBD], полученный трансформацией штамма Escherichia coli M15/pREP4 плазмидой по п.1, продуцент рекомбинантного белка BMPRIA-CBD, состоящего из сигнала L-аспарагиназы AspB E.coli, эктодомена рецептора BMPRIA человека, спейсера из остатков глицина и серина и целлюлозосвязывающего домена CBD.

3. Рекомбинантный белок BMPRIA-CBD для выделения рекомбинантного белка ВМР-2 в димерной форме из раствора, состоящий из сигнального пептида из L-аспарагиназы AspB E.coli с последовательностью SEQ ID NO: 2, эктодомена рецептора BMPRIA человека с последовательностью SEQ ID NO: 3, спейсера из остатков глицина и серина с последовательностью SEQ ID NO: 4 и целлюлозосвязывающего домена CBD с последовательностью SEQ ID NO: 5, который одновременно обладает способностью BMPRIA связываться со своим лигандом BMP-2 в форме димера, а также способностью CBD взаимодействовать с целлюлозосодержащим сорбентом.

4. Способ выделения рекомбинантного белка BMP-2 в димерной форме из раствора, включающий следующие стадии:
подготовку сорбента с иммобилизованным белком BMPRIA-CBD, включающую: получение рекомбинантной плазмиды pBMPRIA-CBD, выращивание клеток штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pBMPRIA-CBD], индукция синтеза белка BMPRIA-CBD, разрушение клеток и получение супернатанта, содержащего белок BMPRIA-CBD, иммобилизация белка BMPRIA-CBD и отмывание целлюлозосодержащего сорбента со связавшимся белком;
заполнение хроматографической колонки подготовленным сорбентом и раствором рекомбинантного белка BMP-2;
сорбцию димерной формы рекомбинантного белка BMP-2;
элюирование димерной формы сорбированного белка BMP-2;
анализ собранной фракции методом электрофореза в неденатурирующих условиях.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой рекомбинантную плазмиду BMPRIB-CBD, штамм E.coli, трансформированный данной плазмидой. Изобретение относится также к рекомбинантному белку BMPRIB-CBD, с использованием которого получают белок BMP-7.

Настоящее изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Предложены варианты антитела или его фрагмента, специфичных в отношении β-амилоидного белка.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к бис-Met-гистонам, и может быть использовано в медицине. Молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, состоящий из двух остатков метионина в качестве первого и второго N-концевых аминокислотных остатков, соединенных через пептидную связь со зрелым эукариотическим гистоном.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается химерного белка, нуклеиновой кислоты, кодирующей такой белок, кассеты экспрессии и эукариотической клетки-хозяина.

Изобретение относится к области генной инженерии и может быть использовано в биотехнологических процессах в качестве средства для объединения фрагментов ДНК и получения сложных ДНК-конструкций.

Группа изобретений относится к области белковой инженерии, молекулярной биологии растений и борьбы с вредителями и касается гибридного инсектицидного белка и его применений.

Плазмида для экспрессии в клетках бактерии рода escherichia неактивного предшественника мутеина [c112s] легкой цепи энтерокиназы человека, бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент предшественника рекомбинантного мутеина [c112s] легкой цепи энтерокиназы человека, предшественник рекомбинантного мутеина [c112s] легкой цепи энтерокиназы человека, способ получения рекомбинантного мутеина [c112s] легкой цепи энтерокиназы человека, рекомбинантный мутеин [c112s] легкой цепи энтерокиназы человека // 2495934
Изобретение относится к биотехнологии и предоставляет способ получения рекомбинантного мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, трансформированной экспрессионной плазмидой, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий неактивный предшественник мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека, включающий последовательность, кодирующую отщепляемый N-концевой пептид, включающий гексагистидиновый кластер и последовательность узнавания энтерокиназы, и слитую с ним в рамке последовательность, кодирующую предшественник мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека с неотщепляемым С-концевым гексагистидиновым кластером под контролем промотора, функционирующего в бактериальной клетке.

Плазмида для экспрессии в клетках бактерии рода escherichia предшественника рекомбинантного фрагмента тканевого активатора плазминогена (тап) человека (ретеплазы), бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент предшественника рекомбинантного фрагмента тап человека (ретеплазы) или [-1]метионил-фрагмент тап человека (ретеплазы), предшественник рекомбинантного фрагмента тап человека (ретеплазы), способ получения предшественника рекомбинантного фрагмента тап человека (ретеплазы) // 2495933
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения предшественника рекомбинантного фрагмента тканевого активатора плазминогена (ТАП) человека (ретеплазы) с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, трансформированной экспрессионной плазмидой, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий предшественник рекомбинантного фрагмента тканевого активатора плазминогена (ТАП) человека (ретеплазы), включающий последовательность, кодирующую отщепляемый N-концевой пептид, включающий декагистидиновый кластер и слитую в рамке последовательность узнавания энтерокиназы, или фрагмент ДНК, кодирующий [-1]метионил-фрагмента ТАП человека (ретеплазы), под контролем промотора, функционирующего в указанной бактериальной клетке.

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии. Представлена протеаза, обладающая усовершенствованной молокосвертывающей активностью, содержащая аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 80% идентичую SEQ ID NO: 3, где указанная протеаза имеет, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из: (а) замены глутамина, соответствующего глутамину в положении 265 в SEQ ID NO:3, на кислую аминокислоту; и (b) замены глутамина, соответствующего глутамину в положении 266 в SEQ ID NO:3, на кислую аминокислоту.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к рекомбинантной нуклеиновой кислоте, экспрессирующей один или несколько представляющих интерес полипептидов, вектору экспрессии и бактерии, которые содержат данную рекомбинантную нуклеиновую кислоту, и их применению, а также к фармацевтической композиции для доставки одного или нескольких представляющих интерес полипептидов человеку или животному.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело, специфично связывающее сегмент M1' IgE и которое индуцирует апоптоз в экспрессирующих IgE В-клетках, и его антигенсвязывающий фрагмент. Также рассмотрены композиции и способы лечения опосредуемого IgE нарушения, изделие, способ специфического устранения продуцирующих IgE В-клеток, способы профилактики и снижения индуцируемой аллергеном продукции IgE, а также выделенная нуклеиновая кислота, вектор экспрессии, клетка-хозяин и способ получения антитела по изобретению с их использованием. Настоящее изобретение может найти дальнейшее применение в терапии заболеваний, ассоциированных с IgE. 17 н. и 29 з.п. ф-лы, 19 ил., 5 табл., 13 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения рекомбинантного фактора свертываемости крови IX человека (hFIX). Рекомбинантная плазмидная ДНК рАК380, содержащая ген белка rhFIX, MAR - область прикрепления к ядерному матриксу гена лизоцима птиц, усилитель транскрипции вируса CMV, внутренний сайт инициации трансляции IRES вируса энцефаломиокардита, ген DHFR мыши, сигнал полиаденилирования вируса SV40, ген аминогликозид-3'-фосфотрансферазы для устойчивости к генетицину (Neo), кассету для экспрессии в клетках бактерий гена β-лактамазы для устойчивости к ампицилину, используется для получения рекомбинантного фактора hFIX в клетках линии Cricetulus griseus CHO 1E6. Путем трансформации линии клеток С.griseus CHO DHFR - рекомбинантной плазмидной ДНК рАК380 получают линию клеток С.griseus CHO 1E6, продуцирующую рекомбинантный hFIX со стабильно высоким выходом на уровне 50 мг/л/24 ч. После культивирования клеток-продуцентов выделяют hFIX путем псевдоаффинной хроматографии на Q-Сефарозе с элюцией 10 мМ CaCl2, затем на Heparin-Сефарозе FF с элюцией 600 мМ NaCl и хроматографии на гидроксиапатите типа I с элюцией 600 мМ К3РО3 и хроматографии на Source 30Q с элюцией 600 мМ ацетатом аммония. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 5 ил., 7 пр., 3 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения тканевого активатора плазминогена человека. Рекомбинантной плазмидной ДНК рВК415, кодирующей полипептид с последовательностью тканевого активатора плазминогена человека, включающей также MAR - область прикрепления к ядерному матриксу гена лизоцима птиц, усилитель транскрипции вируса CMV, внутренний сайт инициации трансляции IRES вируса энцефаломиокардита, ген DHFR мыши, сигнал полиаденилирования вируса SV40, ген аминогликозид-3'-фосфотрансферазы, обеспечивающей устойчивость к генетицину (Neo) и кассету для экспрессии в клетках бактерий гена β-лактамазы, обеспечивающей устойчивость к ампицилину, трансформируют клетки линии Cricetulus griseus CHO DHFR(-) с получением линии клеток Cricetulus griseus CHO 1F8, продуцирующей рекомбинантный белок тканевого активатора плазминогена со стабильно высоким выходом на уровне до 190 мг/л. Культивирование клеток-продуцентов проводят в перфузионных условиях в присутствии смеси, состоящей из добавки CHO Bioreactor supplement и бутирата натрия или диметилсульфоксида, с последующим выделением целевого продукта. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 табл., 8 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII человека с делецией В-домена (hFVIII-BDD). Рекомбинантной плазмидной ДНК ДНК рАР227, кодирующей полипептид с последовательностью hFVIII-BDD, включающей также MAR - область прикрепления к ядерному матриксу гена лизоцима птиц, усилитель транскрипции вируса CMV, внутренний сайт инициации трансляции IRES вируса энцефаломиокардита, ген DHFR мыши, сигнал полиаденилирования вируса SV40, ген аминогликозид-3'-фосфотрансферазы, обеспечивающей устойчивость к генетицину (Neo), кассету для экспрессии в клетках бактерий гена β-лактамазы, обеспечивающей устойчивость к ампицилину, трансформируют клетки линии Cricetulus griseus CHO DHFR (-) с получением линии клеток Cricetulus griseus CHO 2H5, продуцирующей рекомбинантный hFVIII-BDD со стабильно высоким выходом на уровне около 20 МЕ/мл/24 ч. Культивирование клеток-продуцентов проводят в среде DME/F12, содержащей 2-4% фетальной бычьей сыворотки, 1% диметилсульфоксида и 50 МЕ/л инсулина. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 5 ил., 9 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к пептиду со способностью связываться со скурфином и ингибировать биологическую активность скурфина, который выбран из пептида, состоящего из аминокислотной последовательности Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X, где Х отсутствует или Х присутствует и представляет собой X14 или X14-X15, где X14 и X15 независимо друг от друга обозначают аминокислоту, варианта указанного пептида и его фармацевтически приемлемой соли. Также раскрыты слитый белок и фармацевтическая композиция, предусматривающая использование указанного пептида и слитого белка, а также их применение для ее получения и лечения патологии, требующей транзиентной регуляции или ингибирования иммуносупрессорной активности регуляторных Т-лимфоцитов, такой как неопластическое заболевание или инфекционное заболевание. Кроме того, изобретение относится к способу получения указанного пептида и слитого белка, в том числе к нуклеиновой кислоте, кодирующей белок или пептид, ДНК-конструкции, экспрессирующему вектору и клетке хозяина. Изобретение позволяет эффективно лечить инфекционные и неопластические заболевания, требующие транзиентной регуляции или ингибирования иммуносупрессорной активности регуляторных Т-лимфоцитов. 11 н. и 15 з.п. ф-лы, 10 ил., 5 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к эукариотическому вектору для экспрессии целевого рекомбинантного продукта в клетке млекопитающего и его применению, к клетке млекопитающего для продуцирования целевого рекомбинантного продукта и способу ее получения, способу отбора клетки млекопитающего и способу получения целевого рекомбинантного продукта. Вектор включает первый полинуклеотид, кодирующий функциональный связанный с мембраной фолатный рецептор в качестве селективного маркера, и второй полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, который рекомбинантно экспрессируется. Целевой продукт представляет собой фармацевтически активный, терапевтически активный или диагностический полипептид. Функциональный связанный с мембраной фолатный рецептор и целевой продукт экспрессируются с указанного вектора экспрессии. Система отбора основана на введении гена экзогенного функционального связанного с мембраной фолатного рецептора в клетку млекопитающего. Предложенное изобретение позволяет эффективно проводить селекцию трансформированных клеток и получать с высоким выходом целевой продукт. 6 н. и 20 з.п. ф-лы, 3 табл., 2 пр.

Плазмида для экспрессии в клетках бактерии, принадлежащей к роду escherichia, неактивного предшественника днказы i человека или ее мутеинов, бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент неактивного предшественника рекомбинантной днказы i человека или ее мутеина, предшественник рекомбинантной днказы i человека или ее мутеина, способ получения рекомбинантной днказы i человека или ее мутеина, способ получения конъюгатов полиэтиленгликоля и рекомбинантного мутеина днказы i человека, ферментативно активный конъюгат мутеина рекомбинантной днказы i человека // 2502803
Группа изобретений относится к биотехнологии и представляет собой способ получения рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, а также их конъюгатов с полиэтиленгликолем, с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, трансформированной экспрессионной плазмидой, содержащей промотор, функционирующий в бактериальной клетке, фрагмент ДНК, кодирующий гексагистидиновый кластер, фрагмент, кодирующий последовательность узнавания энтерокиназы, слитую в рамке с ДНКазой I человека или ее функционально активным мутеином, содержащим замены аспарагина на цистеин, участок терминации транскрипции, фрагмент вектора рЕТ28а(+), содержащий участок инициации репликации бактериофага fl, последовательность, кодирующую аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, область начала репликации плазмиды pBR322, ген РНК-организующего белка Rop, последовательность, кодирующую репрессор лактозного оперона. Предложенное изобретение позволяет получать рекомбинантную ДНКазу I человека или ее мутеин с высоким выходом. 6 н. и 12 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 12 пр.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено гуманизированное антитело к человеческому интегрину альфа-9 (α9), полученное из антитела Y9A2 мыши и обладающее улучшенной активностью и термостабильностью. Также рассмотрен полинуклеотид, вектор экспрессии, клетка-хозяин и способ продуцирования гуманизированного антитела по изобретению с их использованием, а также терапевтическое лекарственное средство от ревматоидного артрита, способ профилактики или лечения ревматоидного артрита и применения гуманизированного антитела по изобретению при изготовлении фармацевтического препарата для профилактики или лечения ревматоидного артрита. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в терапии ассоциированных с интегрином α9 заболеваний человека. 8 н. и 6 з.п. ф-лы, 6 ил., 6 табл., 11 пр.

Изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело, которое специфически связывает гепаринсвязывающий EGF-подобный фактор роста (HB-EGF), и его антигенсвязывающий фрагмент. Рассмотрены молекула нуклеиновой кислоты, экспрессирующий вектор, клетка-хозяин и способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, а также применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента для получения фармацевтической композиции для диагностики, предупреждения или лечения гиперпролиферативного заболевания, способы и наборы для диагностики и для предупреждения или лечения состояния, ассоциированного с экспрессией HB-EGF. Настоящее изобретение может найти дальнейшее применение в терапии заболеваний, опосредованных или связанных с экспрессией HB-EGF. 12 н. и 22 з.п. ф-лы, 43 ил., 28 пр., 12 табл.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к рекомбинантным димерам слитого белка, предназначенным для ингибирования или подавления иммунного ответа у млекопитающего, которые связывают человеческий CD80 или человеческий CD86 или внеклеточный домен любого из них, и имеет большую способность подавлять иммунный ответ, чем димер слитого белка LEA29Y-Ig. Раскрыты нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные димеры, экспрессирующие векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, а также рекомбинаные клетки-хозяева, содержащие указанные нуклеиновые кислоты и/или указанные векторы. Раскрыты фармацевтические композиции для инибирования или подавления иммунного ответа у млекопитающего, включающие вышеуказанные димеры слитого белка, а также применение указанных димеров для изготовления лекарственных средств для ингибирования или подавления иммунного ответа у млекопитающего, лечения заболевания или расстройства иммунной системы или лечения отторжения трансплантата органа или ткани у млекопитающего. Также раскрыты способы получения вышеуказанных димеров слитого белка. Изобретение позволяет эффективно ингибировать или подавлять иммунный ответ у млекопитающего. 14 н. и 5 з.п. ф-лы, 15 ил., 11 табл., 12 пр.
Наверх