Тест-система для обнаружения рнк вируса блютанга 14-го серотипа методом от-пцр в режиме реального времени


 


Владельцы патента RU 2499054:

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Тест-система для обнаружения РНК вируса блютанга 14-го серотипа путем проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени включает олигонуклеотидные праймеры и ДНК-зонд, комплементарные участкам вариабельного 2-го сегмента, имеющие следующий нуклеотидный состав (5'-3'): 14/2/qf GCT GTC GGG TAT AGG TAG GA; 14/2/z FAM - GTG AAC GTG GGG TCA TCT TCA С - BHQ1; 14/2/qr ACG TGT CCG ATG CTG СТА TC. Данная тест-система обладает повышенной специфичностью и чувствительностью при сокращении времени проведения работы по определению серотипа вируса блютанга. 2 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии, и может быть использовано в ветеринарной вирусологии для генодиагностики, а именно для идентификации вируса блютанга 14-го серотипа.

Блютанг - инфекционная, неконтагиозная вирусная болезнь широкого спектра домашних и диких жвачных, в настоящее время определенная МЭБ как значительная социально-экономическая проблема, создающая большие трудности для международной торговли животными и продуктами животноводства [1].

Заболевание вызывает вирус блютанга, который является одним из видов рода Orbivirus, семейства Reoviridae [2]. Геном вируса состоит из 10-ти сегментов дцРНК, упакованных в икосаэдрический нуклеокапсид, состоящий из семи структурных белков [3]. Внешний слой капсида представлен двумя белками VP2 и VP5, которые имеют высокую степень гетерологии аминокислотной последовательности, одинаково как между, так и внутри каждого серотипа [4]. Серотип вируса детерминирован VP2 белком, который имеет нейтрализующие эпитопы вируса [5].

В настоящее время известно о существовании 26-ти генетических вариантов вируса, 25 из которых в антигенном отношении представляют различные серотипы вируса. Данные молекулярной эпидемиологии говорят о высокой генетической гетерогенности его популяции, которая позволяет разделить вирусы на типы, топотипы, квазитипы. Уже известно более трехсот вариантов вируса, генетически отличающихся друг от друга.

С того момента как обнаружение ПЦР-продуктов стало основано на флюоресцентной интенсивности, это значительно увеличило производительность теста и снизило риск контаминации. В настоящее время широко применяются тесты, основанные на ОТ-ПЦР в режиме реального времени для обнаружения отдельных серотипов, что в случае вспышки заболевания позволяет быстро и в каждом конкретном случае дифференцировать серотип вируса [8; 9]. Все тест-системы были разработаны за рубежом, поэтому существенным недостатком служит их дороговизна и длительный срок поставки в нашу страну.

Целью настоящего изобретения является создание тест-системы для РНК обнаружения вируса блютанга 14-го серотипа в пробах биологического материала.

Поставленная цель достигается тем, что предлагаемая тест-система для обнаружения генома вируса блютанга 14-го серотипа путем проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени включает олигонуклеотидные праймеры и ДНК-зонд, комплементарные участкам вариабельного 2-го сегмента, имеющие следующий нуклеотидный состав (5'-3'-):

14/2/qf GCT GTC GGG TAT AGG TAG GA

14/2/z FAM - GTG AAC GTG GGG TCA TCT TCA С - BHQ1

14/2/qr ACG TGT CCG ATG CTG СТА TC

Техническим результатом изобретения является возможность определения серотипа вируса блютанга с помощью ПЦР с этапом обратной транскрипции в режиме реального времени, а также повышение специфичности и чувствительности, сокращение времени проведения работы по определению серотипа вируса блютанга в образцах исследуемого биологического материала.

Сущность изобретения состоит в том, что при помощи указанных серотипспецифических олигонуклеотидных праймеров и ДНК-зонда проводят ОТ-ПЦР в режиме реального времени, позволяющую выявить геном вируса блютанга 14-го серотипа. Использование данной методики позволяет повысить специфичность и чувствительность реакции.

В основе используемого способа - ПЦР в режиме реального времени, применение серотипспецифической системы олигонуклеотидов и технологии гибридизационных зондов TaqMan. Для детекции использовали зонд, несущий флуорофор и тушитель, комплементарный части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента. Выбор и анализ серотипспецифических праймеров и зондов (табл.1) проводили при помощи пакета прикладных программ «Bio Edit 7.0.8», «Oligo 6.0» на основании анализа нуклеотидных последовательностей 2-го сегмента референтных штаммов и изолятов 26 (1-26) серотипов вируса, опубликованных в GenBank. В качестве источника флуоресценции на 5' конце зонда применяли краситель FAM, а для тушения флуоресценции на 3' конце BHQ1.

Таблица 1
Серотипспецифические праймеры и ДНК-зонд для выявления генома вируса блютанга 14-го серотипа
ПЦР-
мишень
праймер/ДНК-зонд нуклеотидная последовательность 5'-3' локализация (RSArrrr/14 ,AJ585135)
2 сегмент 14/2/qf gCT gTC ggg TAT Agg TAg gA 854-873
14/2/z FAM - gTg AAC gTg ggg TCA TCT TCA С - BHQ1 967-988
14/2/qr ACg TgT CCg ATg CTg СТА TC 1037-1056

Пример конкретного выполнения

Обнаружение РНК вируса блютанга 14-го серотипа в образцах биологического материала (кровь от инфицированных блютангом животных, культуральный материал вируса, лиофилизированный культуральный материал вируса из музея штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, а также в образцах интактных культур клеток, кровь от интактных животных и культуральный материал гетерологичных вирусов).

Из представленных образцов с использованием реагента Тризол (Invitrogen) и согласно инструкции производителя были выделены нуклеиновые кислоты. Далее препараты нуклеиновых кислот использовали в реакции: 8 мкл образца добавляли к реакционной смеси для денатурации. В пробирку с денатурированной РНК добавляли смесь для реакции обратной транскрипции. Препараты полученных комплементарных ДНК в количестве 10 мкл использовали для постановки собственно ПЦР в режиме реального времени (результаты представлены в таблице 2).

Проведение реакции обратной транскрипции

В подготовленные пробирки вносят по 7 мкл смеси для денатурации, сверху наслаивают 40 мкл минерального масла. Под масло вносят 8 мкл препарата РНК. Реакцию денатурации проводят при температуре 95°С в течение 5 минут. Далее необходимо заморозить смесь после денатурации, поместив пробирки в штатив с хладагентом.

Готовят смесь для обратной транскрипции, для этого на одну пробу в отдельной пробирке смешивают 9,5 мкл смеси для обратной транскрипции и 0,2 мкл (40 ед) MMLV-ревертазы, смесь перемешивают. В пробирки после денатурации вносят по 9,7 мкл смеси для обратной транскрипции. Обратную транскрипцию проводят при температуре 42°С в течение 30 минут. После окончания реакции препарат кДНК используют для постановки ПЦР.

Проведение ПЦР в режиме реального времени

В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на необходимое количество образцов, для этого на одну пробу добавляют 8 мкл смеси для ПЦР, 7 мкл смеси праймеров и 0,2 мкл (1 ед) Taq-полимеразы. Смесь перемешивают, избегая образования пены, и раскапывают по 15 мкл в пробирки объемом 0,2 см, на поверхность смеси вносят воск в объеме 15 мкл.

В подготовленные для ПЦР пробирки на воск вносят по 10 мкл кДНК.

Профиль реакции:

1. Удержание температуры 95°С - 3 мин

2. Циклирование 95°С - 10 с

60°С - 20 с

72°С - 15 с

Цикл повторить 5 раз

3. Циклирование с детекцией 2

95°С - 10 с

60°С - 20 с - Детекция

72°С - 15 с

Цикл повторить 40 раз

Флуоресценцию измеряют по каналу Green при температуре 60°С.

Учет и интерпретация результатов амплификации

Результаты интерпретируют на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне пороговой линией (Threshold), что соответствует наличию/отсутствию значения Q в соответствующей графе в таблице результатов. Результаты идентификации вируса блютанга 14-го серотипа методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием разработанной серотипспецифической системы олигонуклеотидов представлены в таблице 2.

Таблица 2
Результаты идентификации вируса блютанга 14-го серотипа методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием разработанной серотипспецифической системы олигонуклеотидов
№№ проб Характеристика биоматериала Результат
ОТ-ПЦР
в режиме
реального
времени
1 культуральный вирус блютанга 1 серотип, RSArrrr/01 (A J5 8 5122) референтный штамм -
2 культуральный вирус блютанга 2 серотип, RSArrrr/02 (AJ585123) референтный штамм -
3 культуральный вирус блютанга 3 серотип, RSArrrr/03 (AJ585124) референтный штамм -
4 культуральный вирус блютанга 4 серотип, RSArrrr/04 (AJ585125) референтный штамм -
5 культуральный вирус блютанга 5 серотип, RSArrrr/05 (AJ585126) референтный штамм -
6 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 6 серотип, RSArrrr/06 (AJ585127) референтный штамм -
7 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 7 серотип, RSArrrr/07 (AJ585128) референтный штамм -
8 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 8 серотип, RSArrrr/08 (AJ585129) референтный штамм -
9 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 9 серотип, RSArrrr/09 (AJ585130) референтный штамм -
10 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 10 серотип, RSArrrr/10 (AJ585131) референтный штамм -
11 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 11 серотип, RSArrrr/11 (AJ585132) референтный штамм -
12 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 12 серотип, RSArrrr/12 (AJ585133) референтный штамм -
13 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 13 серотип, RSArrrr/13 (AJ585134) референтный штамм -
14 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 14 серотип, RSArrrr/14 (AJ585135) референтный штамм +
15 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 15 серотип, RSArrrr/15 (AJ5 85136) референтный штамм -
16 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 16 серотип, RSArrrr/16 (AJ5 8 513 7) референтный штамм -
17 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 17 серотип, RSArrrr/17 (AJ5 85138) референтный штамм -
18 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 18 серотип, RSArrrr/18 (AJ585139) референтный штамм -
19 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 19 серотип, RSArrrr/19 (AJ585140) референтный штамм -
20 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 20 серотип, RSArrrr/20 (A J5 8 5141) референтный штамм -
21 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 21 серотип, RSArrrr/21 (AJ585142) референтный штамм -
22 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 22 серотип, RSArrrr/22 (AJ585143) референтный штамм -
23 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 23 серотип, RSArrrr/23 (AJ585144) референтный штамм -
24 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 24 серотип, RSArrrr/24 (AJ585145) референтный штамм -
25 культуральный вирус блютанга 26 серотип, KUW2010/02 (НМ590642) -
26 кровь ягненка, экспериментально инфицированного вирусом блютанга 14-го серотипа, 90-е сутки после заражения +
27 кровь крупного рогатого скота, инфицированного вирусом блютанга 14-го серотипа +
28 интактная культура клеток Vero -
29 интактная культура клеток ВНК-21 -
30 кровь от интактного животного (корова) -
31 кровь от интактного животного (овца) -
32 культуральный вирус ЭГБО, штамм «Нью-Джерси», 1 серотип -

Таким образом, разработана тест-система, позволяющая с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием системы обнаруживать вирус блютанга 14-го серотипа.

Основными преимуществами заявляемого изобретения являются:

высокая специфичность и чувствительность тест-системы для идентификации вируса блютанга 14-го серотипа с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени, благодаря избирательному выявлению уникальной нуклеотидной последовательности 2-го сегмента генома вируса блютанга 14-го серотипа;

- быстрота проведения анализа благодаря исключению ряда процедур, необходимых для регистрации продуктов амплификации в классической ПЦР;

- простота выполнения методики, исключающая необходимость привлечения высококвалифицированного персонала;

- относительная дешевизна метода благодаря использованию ОТ-ПЦР в режиме реального времени для идентификации серотипа.

Источники информации

1. Clinical aspects linked with the emergence of bluetongue in cattle in northern Europe:

results of a two month longitudinal study/ C.Saegerman, A.Mauroy, H.Guyot// Renc. Rech. Ruminants.-2007.-Vol.l4.-P.215.

2. The dsRNA viruses/ P.P.C. Mertens// Virus Res. - 2004. -Vol.101. - P.3-13.

3. Bluetongue virus assembly and morphogenesis/ P. Roy, R. Noad// Curr Top Microbiol Immunol. - 2006. - Vol.309. - P.87-116.

4. Analysis and phylogenetic comparisons of full-length VP2 genes of the 24 bluetongue virus serotypes / S. Maan, N.S. Maan, A.R. Samuel, S. Rao, H. Attoui, P.P.C. Mertens// J Gen Virol. - 2007. - Vol.88. - P. 621-630.

5. Assignment of the genome segments of Bluetongue Virus Type-1 to the proteins which they encode/ P. P. C. Mertens, F. Brown, D. V. Sangar// Virology. - 1984. - Vol.135. -P.207-217.

6. Bluetongue virus detection by two real-time RT-qPCRs targeting two differ-ent genomic segments/ J. F. Toussaint, C. Sailleau, E. Breard, S. Zientara, K. De Clercq// J. Virol. Methods. - 2007. -Vol.140. -P. 115-123.

7. Development and initial evaluation of a real-time RT-PCR assay to detect bluetongue virus genome segment I/ A.E. Shaw, P. Monaghan, H.O. Alpar, S. Anthony, K.E. Darpel, C.A. Batten, A. Guercio, G. Alimena, M. Vitale, K. Bankowska, S. Carpenter, H. Jones, C.A.L. Oura, D.P. King, H. Elliott, P.S. Mellor, P.P.C. Mertens// Journal ofVirological Methods. - 2007. -Vol.145. -P. 115-126.

8. Emergence of Bluetongue Serotypes in Europe, Part 1 description and Validation of Four Real-Time RT-PCR Assays for the Serotyping of Bluetongue Viruses BTV-1, BTV-6, BTV-8 and BTV-11/ F. Vandenbussche, I. De Leeuw, E. Vandemeulebroucke and K. De Clercq// Transbound Emerg Dis. - 2009. - Vol,56(9-10). - P.346-54.

9. Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCR Assays Specifically Detecting Bluetongue Virus Serotypes 1, 6, and 8/ В. Hoffmann, M. Eschbaumer, and M. Beer// Journal of Clinical Microbiology. - 2009. - Vol.47. - P. 2992-2994.

Тест-система для обнаружения РНК вируса блютанга 14-го серотипа путем проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени, включающая олигонуклеотидные праймеры и ДНК-зонд, комплементарные участкам вариабельного 2-го сегмента, имеющие следующий нуклеотидный состав (5'-3'):
14/2/qf GCT GTC GGG TAT AGG TAG GA
14/2/z FAM - GTG AAC GTG GGG TCA TCT TCA С - BHQ1
14/2/qr ACG TGT CCG ATG CTG СТА TC



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к способу скрининга веществ, способных влиять на процесс старения клетки путем использования нуклеосомных матриц. Способ включает в себя сборку нуклеосом из донорного хроматина с использованием очищенных препаратов гистонов Н2А, Н2В, Н3, Н4 натурального происхождения на ДНК-матрицах, где ДНК несет определенные мутации, ассоциированные с различными заболеваниями или со старением, активацию элонгации, внесение различных тестируемых агентов, способных стабилизировать или дестабилизировать компоненты матрицы, проведение транскрипции, оценку продуктов транскрипции.
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ мультиплексного ПЦР-анализа и набор для его осуществления. Способ включает использование неблокированных прямых и обратных праймеров и гомологичных им блокированных прямых и обратных праймеров.

Изобретение раскрывает дифференциацию штаммов возбудителя чумы основного подвида античного и средневекового биоваров. Определение проводят методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Изобретение относится к области медицины. Предложен набор для многопрофильного иммунологического анализа антител в препаратах крови.
Изобретение относится к области медицинской микробиологии, а именно к способу молекулярно-генетического типирования штаммов Bordetella pertussis. Способ включает выделение ДНК из штаммов B.pertussis, проведение полимеразной цепной реакции с одновременным введением специфических праймеров PF-PR для получения ампликонов фрагмента промотора коклюшного токсина ptxP, рестрикции полученных ампликонов эндонуклеазами KpnI и MluI и электрофорезу продуктов рестрикции в агарозном геле.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к реагенту для предотвращения по меньшей мере одного ошибочного старта в амплификации полимеразной цепной реакции (ПЦР), способу предотвращения по меньшей мере одного ошибочного старта в амплификации полимеразной цепной реакции (ПЦР-амплификация) и наборам, которые включают данный реагент.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и химии. Предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая флуоресцентный биосенсор для детекции пероксида водорода, а также соответствующая кассета экспрессии, клетка-продуцент биосенсора и выделенный флуоресцентный биосенсор.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие геномы двух новых штаммов свиного цирковируса типа 2В.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу оценки степени пролиферации лимфоцитов с помощью маркерных генов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР РВ).

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к способу анализа онкологических заболеваний молочной железы, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения терапевтического агента для лечения клещевого энцефалита людей. Способ включает получение аптамеров, которые способны образовывать комплекс с третичной структурой поверхностного белка вируса. Используют фрагмент поверхностного белка Е вируса клещевого энцефалита, с 50 по 250 аминокислоту от N-конца белка, ген которого амплифицируют и клонируют в плазмидном векторе. Клонированный рекомбинантный белок экспрессируют. Полученный белок очищают и иммобилизуют на планшете. Из первоначального пула вырожденных олигонуклеотидов состава 5'-CTCCTCTGACTGTAACCACG-(N40)-GGCTTCTGGCTACCTATGC-3', где N - любой из нуклеотидов (G, A, T, C), взятых в эквивалентном количестве при синтезе 40-звенных олигонуклеотидов, содержащих на 5'- конце флуоресцентный краситель FAM с помощью 15 циклов экспоненциального обогащения, SELEX, проводят отбор специфично связывающихся с вирусным белком аптамеров. На каждом этапе сорбции проводят денатурацию 25 рМ одноцепочечного олигонуклеотида. Наносят денатурированный пул аптамеров в лунку с иммобилизованным белком, инкубируют и отмывают от несвязавшихся олигонуклеотидов. Связанные с белком аптамеры снимают с поверхности буфером с низкой ионной силой и высоким pH. Пул аптамеров, после каждого этапа сорбции, амплифицируют. Полученные ампликоны двуцепочечной библиотеки аптамеров очищают и проводят реакцию ассиметричной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Продукт очищают с помощью сорбции с получением целевого продукта в виде аптамеров. Предложенное изобретение позволяет получить аптамеры, которые используют для предотвращения заболевания клещевым энцефалитом. 4 з.п. ф-лы, 1 пр.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генной инженерии. Предложен способ выявления воспалительного заболевания кишечника млекопитающего посредством детекции повышенной экспрессии генов LY6 в желудочно-кишечных тканях или клетках по сравнению с контролем. Изобретение может быть использовано в медицине для диагностики воспалительных заболеваний кишечника. 3 н. и 52 з.п. ф-лы, 36 ил., 9 табл.

Изобретение относится к области медицины, в частности к применению молекулярных маркеров ВПЧ ВКР и их качественных и количественных характеристик для прогнозирования течения гиперпролиферативных заболеваний ШМ. Способ осуществляется поэтапно: 1) из соскобов из цервикального канала и биоптатов ШМ выделяют ДНК ВПЧ; 2) определяют генотип вируса; 3) отбирают пациенток с ВПЧ16-позитивной CIN; 4) методом ПНР в реальном времени определяют число копий ДНК вируса и степень интеграции ее в хозяйский геном (физический статус); 5) устанавливают пороговый уровень вирусной нагрузки с учетом физического статуса вируса (6,5 lg копий ДНК ВПЧ 16 на клетку); 6) классифицируют пациенток в зависимости от установленного порогового уровня вирусной нагрузки и физического статуса вируса (эписомальная или интегрированная форма); 7) выявляют пациенток с неблагоприятным прогнозом, имеющих высокую вирусную нагрузку (>6.5 lg копий ДНК на клетку) при эписомальной форме вируса или низкую нагрузку (<6.5 lg копий ДНК на клетку) при интегрированной форме вируса. Способ позволяет провести раннее прогнозирование неблагоприятного течения цервикальных интраэпителиальных неоплазий и возможного перехода их в рак ШМ. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 4 пр.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано для выявления генетического материала (РНК) коронавируса человека, ассоциированного с тяжелым острым респираторным синдромом (ТОРС). Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного ДНК-зонда для идентификации коронавируса человека, ассоциированного с тяжелым острым респираторным синдромом, содержит пару внутренних и один внешний олигонуклеотиды, обладающие активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также флуоресцентно-меченный ДНК-зонд, имеющие следующую структуру: внешний обратный праймер NR: 5`-CTTTTGGCAATGTTGTK(G/T)CCTT-3`; внутренние прямой (F) и обратный (R) праймеры 5`→3` F: 5`-AAAATGTCTGATAATGGACCCC-3` и R: 5`-ACCACCACGAR(A/G)CTCGTCG-3`; флуоресцентно-меченный ДНК-зонд Z: 5`-TY(C/T)CACCAAATGTAATGCGGGG-3`. Набор праймеров и зонд позволяют идентифицировать коронавирус человека, ассоциированный с ТОРС, а также коронавирусы, подобные ТОРС-коронавирусу человека, выделенные от пальмовых циветт, енотовых собак и плодоядных летучих мышей методом ПЦР в реальном времени с получением более продолжительного амплифицированного фрагмента NP-гена коронавируса (513 п.н.). 2 ил., 5 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии. Раскрыты способы, композиции и наборы для диагностики остеоартрита у животных семейства кошачьих. Способы по изобретению включают детектирование дифференциальной экспрессии, по меньшей мере, одного маркера в образце из организма, предпочтительно в образце крови, где биомаркер дифференциально экспрессируется при остеоартрите. 6 н. и 17 з.п. ф-лы, 4 ил., 7 табл., 3 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ выявления мутации c.-53-2A>G в гене SLC26A5, сопровождающийся развитием несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты. Способ включает выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции. Проводят полимеразную цепную реакцию с возможностью проведения анализа флуоресценции по конечной точке. Амплифицируют одновременно два участка гена SLC26A5 в смеси двух пар последовательностей олигонуклеотидов с флуоресцентной меткой: CACCACAAAGAAGAGATG, TCAGCATGATCCATAGTAC, FAM-agtgtCacTagGggaaaa-BHQ-1, VIC-agtgtCacCagGggaaaa-BHQ-2, фланкирующих область с возможным содержанием мутации c.-53-2A>G в гене SLC26A5. Предложенное изобретение позволяет получить точный, объективный клинический диагноз наследственной аутосомно-рецессивной потери слуха. 1 ил., 2 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Предложены способ, композиция и применение полярного апротонного растворителя с циклической основной структурой для гибридизации последовательностей нуклеиновых кислот. Изобретение может быть использовано в гибридизационных анализах. 3 н. и 16 з.п. ф-лы, 25 табл., 2 ил., 22 пр.

Изобретение относится к способу получения новых соединений-диад (I) с двумя разными, не сопряженными друг с другом, хромофорными фрагментами, содержащими азогруппы и остатки ферроцена, и их использованию для тушения флуоресценции флуорофоров. где Fc - ферроценил; R1 - Н или Fc; R2 - H или орто- или пара-гидрокси-; R3 - орто- или мета-, или пара-нитро-, или орто- или мета-, или пара-нитрофенилазо-, или пара-N,N-диметиламино-, или пара-карбокси-; L - группа пара-карбамоилвинилиденацетофенона или пара-карбоксамидовинилиденацетофенона, или пара-N-(2-карбамоилэтил)-карбоксамидовинилиденацетофенона, или пара-(4-[метиламино]бутокси)-винилиденацетофенона, или N,N-ди[4{1-(пара-винилиденацетофениламино)-метил-1,2,3-триазолил}бутил]аминогруппа. Способ получения (I) включает альдольно-кротоновую конденсацию ферроценальдегида с пара-замещенным ацетофеноном и взаимодействие полученного ферроценилиденацетофенона (2) с азосоединением, или введение в (2) реакционноспособных групп и азосочетание с диазосолью. Соединения-диады (I) имеют высокие коэффициенты молярной экстинкции, широкий спектр поглощения и электроактивность. Описан также способ тушения флуоресценции флуорофоров в двуцепочечных структурах нуклеиновых кислот с использованием (I). Показана эффективность (I) для тушения флуорофоров в растворе и в составе нуклеиновых кислот в широком спектральном диапазоне, что позволяет использовать (I) для мечения биологических макромолекул и создания олигонуклеотидных гибридизационных зондов для молекулярных методов диагностики. 2 н.п. ф-лы, 8 ил., 2 табл., 8 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу и диагностическому набору для диагностики коклюша и определения авирулентных мутантов возбудителя коклюша. Способ предусматривает осуществление полимеразной цепной реакции в режиме реального времени и регистрацию продуктов амплификации с помощью гибридизации с флюоресцентными специфическими ДНК-зондами. Осуществляют полимеразную цепную реакцию с использованием ПЦР реакционной смеси, которая включает две пары праймеров, подходящих для амплификации фрагментов последовательностей IS481 и IS 1002, пару праймеров для амплификации последовательности, сформированной в результате инсерции IS481 и IS 1002 в cctagg сайт оперона bvgAS В.pertussis, два флуоресцентных зонда, специфичных к последовательностям IS481, IS 1002 и последовательностям, сформированным в результате инсерции IS481 и IS 1002 в cctagg сайт оперона bvgAS B.pertussis. Определяют количество бактериальных геномов в образце по наличию последовательностей IS481 и IS 1002 в хромосоме бактерий B.pertussis и определяют количество авирулентных мутантов возбудителя по наличию инсерции IS481 или IS 1002 в cctagg сайте оперона bvgAS B.pertussis. Диагностический набор содержит ПЦР-реакционную смесь, включающую две пары праймеров, подходящих для амплификации фрагментов последовательностей IS481 и IS 1002, пару праймеров для амплификации последовательности, сформированной в результате инсерции IS481 и IS 1002 в cctagg сайт оперона bvgAS, два флуоресцентных зонда, специфичных к последовательностям IS481, IS 1002 и последовательностям, сформированным в результате инсерции IS481 и IS 1002 в cctagg сайт оперона bvg. Предложенное изобретение позволяет диагностировать коклюш и определять авирулентные мутанты возбудителя коклюша. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области лабораторной диагностики, медицинской вирусологии, молекулярной биологии и эпидемиологии. Изобретение предназначено для выявления и идентификации в клинических образцах и элюатах, полученных в результате концентрирования из воды, одиннадцати групп кишечных вирусов (энтеровирусов (ЭВ), полиовирусов (ПВ), ротавирусов А и С (РВА и РВС соответственно), аденовирусов (АДВ), норовирусов (НВ), саповирусов (СВ), вирусов гепатита А и Е (ВГА и ВГЕ соответственно), астровирусов (АВ), ортореовирусов (ОРВ) в присутствии внутреннего положительного контроля (ВПК) посредством мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени. Данный подход позволяет усовершенствовать технику ПЦР-анализа для диагностики острых кишечных инфекций (ОКИ) и может найти применение в эпидемиологических службах для мониторинга эпидемиологической обстановки и быстрой расшифровки вспышек ОКИ. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 4 табл., 6 пр.
Наверх