Способ получения поликлональной моноспецифической сыворотки против секреторного иммуноглобулина а человека - siga


 


Владельцы патента RU 2499605:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Изобретение относится к медицинской иммунологии, иммунохимии, а именно к способу получения поликлональной моноспецифической сыворотки против секреторного иммуноглобулина A (SIgA) человека, не содержащей в исходном состоянии примесных антител к лактоферрину. Поликлональная моноспецифическая сыворотка против SIgA не содержит примесных антител к лактоферрину, что достигается дополнительной очисткой антигена от примеси лактоферрина на конечном этапе выделения SIgA из женского молозива с помощью сорбента BrCN-активированная гепарин-сефароза. Сыворотка против SIgA может быть использована для качественного и количественного определения секреторного IgA с помощью иммуноэлектрофореза, радиальной иммунодиффузии и иммуноферментных тест-систем в секретах слизистых кишечного, респираторного, урогенитального трактов, в научно-исследовательской работе. 1 пр.

 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, иммунохимии, а, именно, к способу получения поликлональной моноспецифической сыворотки против секреторного иммуноглобулина A (SIgA) человека, не содержащей в исходном состоянии антител к лактоферрину.

Слизистые оболочки человека постоянно подвергаются воздействию разнообразных чужеродных веществ и болезнетворных микроорганизмов. Защиту слизистых осуществляет система местного иммунитета. Важную роль в системе местного иммунитета играет секреторный иммуноглобулин А (SIgA).

Секреторный IgA (молекулярная масса 380 кДа) отличается от сывороточного мономерного IgA (молекулярная масса 170 кДа) тем, что состоит из 2-х молекул IgA и так называемого секреторного компонента (SC) (молекулярная масса 90 кДа). Таким образом, «маркером» секреторного IgA является SC-компонент.

Для оценки местного иммунитета в секретах слизистых кишечного, респираторного, урогенитального трактов, в научно-исследовательской работе важное значение имеет качественное и количественное определение секреторного IgA (SIgA). Исследования проводятся с помощью методов иммуноэлектрофореза, радиальной иммунодиффузии, иммуноферментных тест-систем с использованием моноспецифической сыворотки против секреторного иммуноглобулина А (SIgA) человека. Такая сыворотка содержит специфические антитела к SC-компоненту, которые «работают» по SC-компоненту с молекулой SIgA, а также со свободным SC-компонентом и не взаимодействуют с сывороточным мономерным IgA.

Известные современные способы получения поликлональной моноспецифической антисыворотки против SIgA человека [1, 2, 3, 4] включают получение антигена, которым служит SIgA, выделенный из женского молозива; введение антигена животным (иммунизация); получение от продуцента сыворотки, в которой содержатся специфические антитела к антигенным детерминантам (наружным) SC-компонента; адсорбцию полученной антисыворотки.

Наиболее близким способом получения поликлональной моноспецифической сыворотки против SIgA человека является способ, описанный в фармакопейной статье «Сыворотка диагностическая моноспецифическая против секреторного иммуноглобулина А (SIgA) человека сухая» [3]. Согласно этому способу собираем женское молозиво через 2-3 дня после родов. После обезжиривания (центрифугирование 2 часа на холоду при 20000 об/мин) и удаления казеина (доведение рН 1М уксусной кислотой до 4,6, что вызывает выпадение казеина в осадок, центрифугирование) выделяем глобулиновую фракцию, содержащую SIgA, осаждением надосадка сульфатом аммония до 33% насыщения, полученный осадок растворяем и диализуем против 0,1М трис-НСl-буфера с рН 7,4, содержащего 0,15М NaCl. Эта фракция кроме целевого белка SIgA содержит примеси IgG, IgM, мономерный IgA, лактоферрин, альбумин и др. Выделяем SIgA из глобулиновой фракции гель-фильтрацией на сефадексе G-200 (разделение по молекулярному весу). Для последующей очистки первый пик, содержащий SIgA, концентрируем и подвергаем гель-фильтрации на сефарозе 6В.

При этом способе очищенный 1% раствор SIgA в иммуноэлектрофорезе (ИЭФ) дает одну линию преципитации с антисывороткой ко всем белкам нормальной сыворотки крови человека и одну линию преципитации с антисывороткой ко всем белкам молозива человека.

Иммунизация коз таким антигеном проводится по стандартной схеме: 2, 4, 6, 8 мг/мл SIgA в забуференном физрастворе + равный объем полного адъюванта Фрейнда (при первой иммунизации) или неполного адъюванта Фрейнда (при последующих иммунизациях) вводят экспериментальным животным (козам) 1 раз в неделю в течение 3-4 недель [6]. Забор крови проводят через 7-10 дней после последней иммунизации.

При контроле полученной сыворотки против секреторного IgA в иммуноэлектрофорезе с нормальной сывороткой человека и с цельным молозивом человека обнаруживаются кроме специфических антител к SC-компоненту также антитела к другим антигенным детерминантам молекулы IgA (α-цепям, легким цепям) и ряд примесных антител: к лактоферрину, к IgG, IgM, альбумину. Специфических антител к SC-компоненту образуется значительно меньше, т.к. он имеет всего 2 антигенные детерминанты в силу своей маленькой молекулярной массы. К лактоферрину образуется значительное количество антител, т.к. он в силу своих физико-химических свойств «липнет» к антигену.

Для придания сыворотке моноспецифичности освобождаемся от примесных антител (к IgA, IgG, IgM, альбумину) путем адсорбции [7] исходной сыворотки сорбентами из биологических жидкостей, которые не содержат SIgA и SC-компонент. Такими биологическими жидкостями для сорбентов являются: нормальная сыворотка человека, сыворотки больных IgA-миеломой с полимером IgA, препараты иммуноглобулинов и лактоферрин. Адсорбция нормальной сывороткой человека и миеломной IgA-сывороткой обязательна для любых способов получения моноспецифической сыворотки против SIgA при иммунизации цельной молекулой SIgA.

Для приготовления сорбента из лактоферрина выделяем его из надосадка глобулиновой фракции, полученной при осаждении сульфатом аммония до 33% насыщения. Этот надосадок осаждаем сульфатом аммония до 80% насыщения, таким образом получая фракцию лактоферрина в осадке, который растворяем в 0,01М фосфатном буфере рН 8,0, диализуем против этого же буфера, выделяем иммунохимически чистый лактоферрин с помощью градиентной ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. который в виде 1% препарат не содержит примесей, при контроле в иммуноэлектрофорезе с антисывороткой ко всем белкам молозива человека дает одну линию преципитации.

Из полученного препарата лактоферрина готовим сорбент и с его помощью проводим адсорбцию сыворотки против секреторного IgA. Адсорбция сыворотки против SIgA включает в себя несколько стадий:

приготовление сорбента (с помощью глутарового альдегида) из очищенного лактоферрина, подбор соотношения сорбента и сыворотки против SIgA - пробная адсорбция, основная адсорбция, контроль чистоты полученной сыворотки. Адсорбция сыворотки против SIgA лактоферрином приводит к снижению титра специфических антител к SIgA. При значительной потере специфической активности проводим концентрацию препарата.

Таким образом, этот способ получения сыворотки против SIgA дорогой, трудоемкий, т.к. включает в себя получение дополнительного белка лактоферрина. который требуется для получения сорбента для дополнительной адсорбции сыворотки против SIgA лактоферрином.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа получения поликлональной моноспецифической сыворотки против SIgA человека, не содержащей в исходном состоянии примесных антител к лактоферрину, более простым и технологически пригодным способом. Особенностью получения сыворотки против SIgA при иммунизации цельной молекулой SIgA является то, что целевых антител, т.е. специфических антител к SC-компоненту, образуется значительно меньше, чем антител к другим антигенным детериминантам молекулы IgA и примесных антител (к α-цепям IgA, к лактоферрину, к IgG, к легким цепям и др.). В связи с этим дополнительная адсорбция является весьма нежелательной, т.к. приводит к снижению титра целевых антител. В конечном итоге требуется концентрирование полученной сыворотки для удовлетворения требованиям фармакопейной статьи.

Поставленная задача достигается путем разработки способа, который предусматривает дополнительную очистку антигена SIgA от примеси лактоферрина путем адсорбции его BrCN-активированной гепарин-сефарозой. Лактоферрин в силу своих физико-химических свойств связывается с гепарином, что позволяет использовать BrCN-активированную гепарин-сефарозу для удаления лактоферрина [5] при очистке антигена SIgA. Иммунизация животных таким антигеном приводит к получению исходной антисыворотки без примесных антител к лактоферрину.

Заявленный способ изобретения осуществляется на следующем примере.

Собираем женское молозиво через 2-3 дня после родов. После обезжиривания (центрифугирование 2 часа на холоду при 20000 об/мин) и удаления казеина (доведение рН 1М уксусной кислотой до 4,6, что вызывает выпадение казеина в осадок, центрифугирование) выделяем глобулиновую фракцию, содержащую SIgA, осаждением надосадка сульфатом аммония до 33% насыщения, полученный осадок растворяем и диализу ем против 0,1М трис-НСl-буфера с рН 7,4, содержащего 0,15М NaCl. Эта фракция кроме целевого белка SIgA содержит примеси IgG, IgM, мономерный IgA, лактоферрин, альбумин и др. Выделяем SIgA из глобулиновой фракции гель-фильтрацией на сефадексе G-200 (разделение по молекулярному весу). Для последующей очистки первый пик, содержащий SIgA, концентрируем и подвергаем гель-фильтрации на сефарозе 6 В. На этом этапе очищенный антиген дополнительно подвергаем сорбции бач-методом на BrCN-активированной гепарин-сефарозе в 0,1М боратном буфере, рН 8,0 с 0,5 М NaCl в соотношении не менее 10 мг антигена/5 мл на 1 мл сорбента в течение 1 часа при комнатной температуре. Элюцию проводим тем же буфером, получая SIgA без примеси лактоферрина.

Очищенный 1% раствор SIgA в иммуноэлектрофорезе (ИЭФ) дает одну линию преципитации с антисывороткой ко всем белкам нормальной сыворотки крови человека и одну линию преципитации с антисывороткой ко всем белкам молозива человека.

Иммунизация коз таким антигеном проводится по стандартной схеме: 2, 4, 6, 8 мг/мл SIgA в забуференном физрастворе + равный объем полного адъюванта Фрейнда (при первой иммунизации) или неполного адъюванта Фрейнда (при последующих иммунизациях) вводят экспериментальным животным (козам) 1 раз в неделю в течение 3-4 недель [6]. Забор крови проводят через 7-10 дней после последней иммунизации.

При контроле полученной сыворотки против секреторного IgA в иммуноэлектрофорезе с нормальной сывороткой человека и с цельным молозивом человека обнаруживаются кроме специфических антител к SC-компоненту также антитела к другим антигенным детерминантам молекулы IgA (α-цепям, легким цепям) и ряд примесных антител: к IgG, IgM, альбумину, но не обнаруживаются антитела к лактоферрину.

Для придания сыворотке моноспецифичности освобождаемся от примесных антител (к IgA, IgG, IgM, альбумину) путем адсорбции [7] исходной сыворотки сорбентами из нормальной сыворотки человека, сыворотки больных IgA-миеломой с полимером IgA, препаратов иммуноглобулинов. Адсорбция нормальной сывороткой человека и миеломной IgA-сывороткой обязательна для любых способов получения моноспецифической сыворотки против SIgA при иммунизации цельной молекулой SIgA. Адсорбции антител к лактоферрину не требуется.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка более простого и технологичного способа, позволяющего очистить антиген от примеси лактоферрина на конечном этапе выделения SIgA из женского молозива с помощью сорбента BrCN-активированная гепарин-сефароза; при иммунизации животных очищенным от лактоферрина антигеном получить исходную антисыворотку, не содержащую антител к лактоферрину, вследствие чего не проводить операции по получению лактоферрина и операции по адсорбции антисыворотки лактоферрином; повысить качество антисыворотки, сохранив ее специфическую активность благодаря снятию стадии адсорбции антисыворотки лактоферрином.

Литература

1. Герман Г.П., Чернохвостова Е.В., Гольдерман С.Я. Изучение секреторного иммуноглобулина А человека. ЖМЭИ. 1975. №10, с.102-106.

2. Захарова Н.А., Гаврилова Е.М., Шаханина К.Л., Панурина Р.Л. Выделение секреторного IgA и лактоферрина из человеческого молозива и получение к ним моноспецифических антисывороток. ЖМЭИ. 1977. №7, с.116-120.

3. Иммунологические методы. Под редакцией Г. Фримеля. Изд-во «Медицина», Москва. 1987, с.401-403.

4. ФС 42-296 ВС-89 Фармакопейная статья «Сыворотка диагностическая моноспецифическая против секреторного иммуноглобулина A (SIgA) человека сухая».

5. Mary Boesman-Finkelstein and Richard A. Finkelstein. Sequential purification of lactoferrin, lyzozyme and secretory immunoglobulin A from human milk. FEBS Letters. 1982. V.144, N 1, p.1-5.

6. Иммунологические методы. Под редакцией Г.Фримеля. Изд-во «Медицина», Москва. 1987, с.13-14.

7. Иммунологические методы. Под редакцией Г.Фримеля. Изд-во «Медицина», Москва. 1987, с.428-430.

Способ получения поликлональной моноспецифической сыворотки против секреторного иммуноглобулина А человека - SIgA, включающий выделение антигена из женского молозива путем освобождения его от жира, казеина, получение глобулиновой фракции осаждением сульфатом аммония до 33% насыщения, очистку SIgA гельфильтрацией, иммунизацию животных полученным антигеном SIgA, очистку лактоферрина из надосадка глобулиновой фракции осаждением сульфатом аммония до 80% насыщения, ионообменную хроматографию полученного осадка, приготовление из лактоферрина сорбента, проведение адсорбции антисыворотки от антител к примесям и антител к лактоферрину, отличающийся тем, что очищенный антиген для иммунизации животных SIgA дополнительно подвергается очистке путем сорбции на BrCN-активированной гепарин-сефарозе для удаления примеси лактоферрина.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к медицине и касается композиции для индукции иммунной системы, содержащей синтетические наноносители, обладающие по меньшей мере одной поверхностью с иммунными свойствами, образованной множеством молекул, которые обеспечивают высокую авидность и низкую аффиность связывания с антигенпрезентирующими клетками (АРС), и фармацевтически приемлемый наполнитель; способа индукции иммунной системы, включающего введение указанной композиции индивидууму.

Группа изобретений относится к области медицины и фармацевтики и касается стабильной изотонической действующей композиции, содержащей протеин в количестве по крайней мере 50 мг/мл и растворитель, который разбавляет композицию, полученную из лиофилизированной смеси протеина и лиопротектора, где мольное соотношение лиопротектора и протеина в смеси составляет 100-600 моль лиопротектора на 1 моль протеина, причем концентрация протеина в разбавленной действующей композиции в 2-40 раз выше, чем концентрация протеина в смеси до лиофилизации.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к композициям и способам для доставки наноносителей к клеткам иммунной системы, способным стимулировать иммунный ответ в Т-клетках и/или в В-клетках.

Данное изобретение относится к медицине, биофармацевтики и может быть использовано для приготовления вакцин. Для этого иммуногенная композиция содержит: 1) антиген нейссериальный аутотранспортерный белок, представляющий собой NadA или Hsf; 2) антиген нейссериальный белок, участвующий в усвоении железа, представляющий собой Lipo28 или низкомолекулярный и высокомолекулярный TbpA и 3) препарат везикул наружной мембраны, включающий нейссериальный липополисахарид (LPS) иммунотипа L3; и где указанные антигены, в тех случаях, когда они присутствуют в везикуле наружной мембраны, позитивно отрегулированы рекомбинантным образом в указанной везикуле наружной мембраны.

Группа изобретений относится к композициям, включающим Tr1-клетки и мезенхимальные стволовые клетки, представляющие собой специфические клетки для антигена, в норме толерантного у здорового субъекта, где указанный антиген представляет собой аллерген, собственный антиген, пищевой антиген или антиген микроорганизмов, и способам лечения аутоиммунного заболевания, аллергического заболевания или воспалительного заболевания.

Изобретение относится к области иммунологии и касается увеличения иммуногенности вакцин путем совместного введения синтетического гликолипида, обозначенного PBS-57, вместе с вакциной.

Изобретение относится к соединению формулы (1) или (1'): где: Z представляет собой реактивный карбоксильный эфир, выбранный из группы, состоящей из N-сукцинимидила, N-сульфосукцинимидила, N-фталимидила, N-сульфофталимидила, 2-нитрофенила, 4-нитрофенила, 2,4-динитрофенила, 3-сульфо-4-нитрофенила, 3-карбокси-4-нитрофенила и сложного эфира трифторфенила, или галоацетамида; D представляет собой майтанзиноид; Х представляет собой алифатическую структурную единицу; Y представляет собой алифатическую структурную единицу, присоединенную к майтанзиноиду через тиоэфирную связь; где указанная алифатическая структурная единица, представленная Х или Y, является простой или разветвленной алкильной группой, имеющей 1-20 атомов углерода в цепи, циклической алкильной группой, имеющей 3-10 атомов углерода, простой или разветвленной алкенильной группой, имеющей 2-15 атомов углерода в цепи, или простой или разветвленной алкинильной группой, имеющей 2-15 атома углерода в цепи; 1 представляет собой 0 или 1; p представляет собой 0 или 1; и n представляет собой целое число от 1 до 2000.

Изобретение относится к области ветеринарии и касается способа получения антигена из сетарий. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к средствам, ингибирующим ангиогенез, и может быть использовано в медицине. .

Группа изобретений относится к композициям, наборам, способам профилактики и терапии рака с использованием рекомбинантных вирусов MVA (модифицированный вирус коровьей оспы Анкара), кодирующих антигены, ассоциированные с опухолью: PSA (простато-специфический антиген) и РАР (простатическая кислая фосфатаза). Данные рекомбинантные вирусы MVA способны индуцировать В- и Т-клеточные ответы. Заявленные рекомбинантые модифицированные вирусы эффективны в профилактике и терапии рака. Также рекомбинантные вирусы MVA можно применять в комбинации с таксаном. 5 н. и 18 з.п. ф-лы, 27 ил., 6 пр.

Группа изобретений относится к области биотехнологии и иммунологии. Предложен способ получения вакцины с применением обратимого латекса. На первой стадии получают адъювантную композицию путем диспергирования в водном физиологически приемлемом растворе обратимого латекса или полимерного порошка, полученного распылением указанного обратимого латекса. На второй стадии смешивают полученную адъювантную композицию с антигенсодержащей средой, предназначенной для получения вакцинной композиции. Адъювант на основе обратимого латекса отличается высокой безопасностью и обладает высоким адъювантным эффектом как на уровне гуморального ответа, так и на уровне клеточного ответа. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.

Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к терапии, и касается лечения вирусных инфекций. Для этого вводят комплексное лекарственное средство, включающее активированные-потенцированные антитела к гамма- интерферону человека, к CD4 рецептору и к гистамину. Введение такого комплексного средства обеспечивает лечение различных вирусных заболеваний, таких как острые респираторные вирусные инфекции, герпесвирусные инфекции, острые кишечные инфекции вирусной этиологии и др., за счет воздействия на различные звенья иммунной системы. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 5 пр., 2 ил., 8 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к апоптотическим факторам, и может быть использовано в медицине. Получают композицию, включающую ингибитор TNF-подавляющей активности Core 1 митохондриального дыхательного комплекса III в опухолевой клетке на основе нуклеиновой кислоты; член суперсемейства фактора некроза опухоли (TNF) и носитель. Изобретение позволяет повысить чувствительность опухолевой клетки к апоптотической активности члена суперсемейства фактора некроза опухоли. 3 н. и 13 з.п. ф-лы, 5 ил., 9 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана модифицированная липидами двухцепочечная РНК, включающая антисмысловую нить, нуклеотидная последовательность которой комплементарна целевой последовательности в целевом гене, и смысловую нить, нуклеотидная последовательность которой комплементарна антисмысловой нити. К первому нуклеотиду на 5′-конце смысловой нити напрямую или через линкер присоединен двухцепочечный липид. РНК обладает высокой устойчивостью к действию нуклеазы и эффективно поглощается клеткой, а также производит превосходный эффект РНК-интерференции. 4 н. и 11 з.п. ф-лы, 14 ил., 3 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии. Предложен способ получения вектора экспрессии, кодирующего адаптированную рекомбиназу. Указанная адаптированная рекомбиназа рекомбинирует асимметричные участки-мишени в LTR провирусной ДНК ретровируса, встроенного в геном клетки-хозяина, и пригодна в качестве средства для вырезания провируса из генома клетки-хозяина. Настоящее изобретение дополнительно относится к способу оптимизации лечения ретровирусной инфекции у индивида in vitro и к использованию адаптированных рекомбиназ для получения фармацевтических композиций для снижения вирусной нагрузки у индивида, инфицированного ретровирусом. 11 н. и 10 з.п. ф-лы, 11 ил., 1 табл., 4 пр.
Изобретение относится к области ветеринарии и медицины. Предложен способ лечения гриппа птиц A/H5N1 с помощью высокополимерной дрожжевой РНК. В качестве лекарственного средства используют мылкую амфифильную одноцепочечную высокополимерную РНК Saccharomyces cerevisiae, извлекаемую из сухих пекарских дрожжей с помощью оттитрованной щелочью олеиновой кислоты, или с помощью додецилсульфата натрия путем обработки выделенной РНК олеиновой кислотой. Изобретение обеспечивает высокоэффективное противогриппозное средство, содержащее природный индуктор интерферона. 1 пр.

Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к терапии, и касается лечения бактериальных инфекций. Для этого вводят комплексное лекарственное средство, содержащее активированную-потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека (ИФН-γ), активированную-потенцированную форму антител к CD4 рецептору и активированную-потенцированную форму антител к гистамину. Это обеспечивает эффективное лечение бактериальных инфекций за счет потенцирования антибактериального действия активированных-потенцированных антител к гамма-интерферону. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 1 пр., 1 табл.
Изобретение относится к области ветеринарной протозоологии и касается способа получения антигена для серологической диагностики анаплазмоза мелкого рогатого скота. Предложенный способ включает введение спленэктомированному животному заражающей дозы 14·1010 или 16·107 анаплазм/животное, на 15 или 22-24 соответственно день, проведение обескровливания, центрифугирование крови 2-3 раза при 6000 об/мин в течение часа с физиологическим раствором pH 6,8-7,2, получение осадка анаплазм с форменными элементами крови, проведение 2-3 разовой отмывки физиологическим раствором, разрушение эритроцитов путем 2-3 кратного замораживания и оттаивания, концентрирование 2-3 раза центрифугированием при тех же условиях и выделение антигена с титром 1:32-1:64. Способ позволяет получить чувствительный, высокоактивный и специфичный анаплазменный антиген и найдет применение в ветеринарных лабораториях, занимающихся диагностикой инфекционных и протозойных болезней. 4 табл., 4 пр.

Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к терапии и неврологии, и касается лечения кинетозов. Для этого вводят фармацевтическую композицию, содержащую активированную-потенцированную форму антител к мозгоспецифическому белку S-100 и активированную-потенцированную форму антител к эндотелиальной NO-синтазе. Это обеспечивает эффективное лечение кинеотозов за счет синергетического действия компонентов композиции. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 16 табл., 4 пр.
Наверх