Способ приготовления препарата костной ткани и набор для его осуществления



Способ приготовления препарата костной ткани и набор для его осуществления
Способ приготовления препарата костной ткани и набор для его осуществления

 

G01N1/28 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание
A01N1/02 - Консервирование тел людей или животных, или растений или их частей; биоциды, например дезинфектанты, пестициды, гербициды (препараты для медицинских,стоматологических или гигиенических целей A61K; способы или устройства для дезинфекции или стерилизации вообще, или для дезодорации воздуха A61L); репелленты или аттрактанты (приманки A01M 31/06; лекарственные препараты A61K); регуляторы роста растений (соединения вообще C01,C07,C08; удобрения C05; вещества, улучшающие или стабилизирующие состояние почвы C09K 17/00)

Владельцы патента RU 2500104:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НЦРВХ" СО РАМН) (RU)

Изобретение относится к медицине, ветеринарии и биологии. Проводят фиксацию образца, декальцинацию, промывание водой, дегидратацию в спиртовых растворах и заливку в парафин. Фиксацию образца проводят в течение 24-х часов в молекулярном фиксаторе FineFix на спиртовой основе, содержащем FineFix и 96° спирт в соотношении 1:2,5. Декальцинацию осуществляют в течение 2-5 суток в 5-8% забуференном растворе муравьиной кислоты при ежедневной смене декальцинирующего раствора и контроле полноты декальцинации. Соотношение образец: декальцинирующий раствор составляет 1:20. После завершения декальцинации проводят промывку образца водой и до стадии дегидратации повторно помещают образец в спиртовой раствор молекулярного фиксатора FineFix на 6-12 часов. Набор для приготовления препарата костной ткани содержит молекулярный фиксатор FineFix на спиртовой основе, концентрированный раствор декальцинатора, изготовленный из расчета 40 г лимоннокислого натрия, 100 мл 90%-ного раствора муравьиной кислоты, 300 мл дистиллированной воды и рабочие растворы для контроля полноты декальцинации, содержащие насыщенный раствор оксалата аммония и 25%-ный водный раствор аммиака. Изобретение позволяет получать высококачественные препараты, пригодные для последующего гистологического и иммуногистологического исследования при отсутствии использования высокотоксичных компонентов. 2 н.п. ф-лы, 2 ил.

 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, ветеринарии и биологии.

Гистологическое исследование костной ткани является обязательным компонентом диагностики многих заболеваний и состояний и применяется как в клинических, так и в экспериментальных исследованиях. При этом качество препарата играет решающую роль в постановке диагноза и в установлении тканевых взаимоотношений.

Известен способ приготовления препарата кости, включающий распил кости и его шлифование (Микроскопическая техника / под ред. Саркисов Д.С., Петров Ю.Л. - М.: Медицина, 1996. - С.456).

К недостаткам данного способа следует отнести то, что получаемые препараты малопригодны для гистологических исследований, так как в толстых срезах плохо различима структура костной ткани, а при шлифовании также разрушаются клеточные элементы.

Также известен способ приготовления фрагментов костной ткани к исследованию, включающий фиксацию в забуференном 10%-ном растворе нейтрального формалина в течение 24-48 часов, промывку в воде в течение 24-48 часов, декальцинацию в 5-7.5%-ном растворе азотной кислоты до полной декальцинации, последующую обработку препарата костной ткани в 5%-ном растворе сульфата натрия или лития в течение 1 суток, промывку в воде в течение 24-48 часов, обезвоживание в спиртах и заливку в парафин (Микроскопическая техника / под ред. Саркисов Д.С., Петров Ю.Л. - М.: Медицина, 1996. - С.454, 457, 467).

Однако данный способ не позволяет добиться хорошей сохранности клеточных структур, особенно в окружающих мягких тканях (мышце, надкостнице, костном мозге), значительно ухудшает качество стандартных гистологичских окрасок, а также не позволяет проводить последующие иммуногистохимические и иммунофлюоресцентные исследования из-за повреждения вторичной структуры белковых эпитопов.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ подготовки костных образцов к морфологической диагностике, включающий фиксацию образца, его декальцинацию, промывание водой, дегидратацию в спиртовых растворах с возрастающей концентрацией и заливку в парафин (Медведева Н.Н., Николаев В.Г. и др. Способ подготовки костных образцов к морфологической диагностике. Пат. RU 2241994, МПК7 G01N 33/48, G01N 1/28, Заявка: 2003129253/15, 30.09.2003, Опубликовано: 10.12.2004).

Известный способ осуществляют следующим образом. После фиксации костных образцов в растворе формалина осуществляют их декальцинацию в течение 7-8 суток в 5%-ном растворе азотной кислоты на основе 5%-ого раствора формалина, после чего костные образцы в течение 2 часов промывают проточной водопроводной водой и на 12 часов погружают в 5%-ный раствор серно-кислого лития, затем в течение 20-30 минут снова промывают проточной водой и подвергают дегидратации в спиртах возрастающих концентраций.

К недостаткам известного способа следует отнести длительность процедуры декальцинации, использование в качестве фиксатора формалина, а в качестве декальцинатора - раствора азотной кислоты, что не позволяет в последующем проводить иммуногистохимическое и иммунофлюоресцентное исследования образцов вследствие значительных повреждений окружающих тканей и клеточных структур при проведении декальцинации.

Задачей заявляемого изобретения является разработка способа приготовления препарата костной ткани, пригодного для гистологического и иммуноморфологического исследования, и набора для его осуществления.

Техническим результатом предлагаемого способа является обеспечение сохранности гистологических структур кости и окружающих тканей, а также снижение трудоемкости и токсического воздействия при изготовлении препарата.

Технический результат достигается тем, что способ приготовления препарата костной ткани включает фиксацию образца, его декальцинацию, промывание водой, дегидратацию в спиртовых растворах и заливку в парафин.

Отличие заявляемого способа заключается в том, что фиксацию образца костной ткани проводят в течение 24-х часов в молекулярном фиксаторе, в состав которого не входят альдегиды, например, растровом FineFix на спиртовой основе, содержащем FineFix и 96° спирт в соотношении 1:2,5.

FineFix - бесформалиновый фиксатор, включающий в себя следующие компоненты: вода, 1,2-пропанедиол, поливиниловый спирт и от 0.05 до 2.00 wt.-% мономерного карбогидрата, содержащего не менее 3 атомов углерода и второе средство для сохранения этанола (патент ЕР 145 5174 B1 Fixative, Номер заявки EP20030005010, Дата публикации: 15 декабря 2004, Дата приоритета: 5 марта 2003. Другие номера патента: US 20050074422. Автор: Francesco Visinoni, Заявитель - Milestone S.r.L).

Отличительным приемом заявляемого способа является и то, что декальцинацию осуществляют в течение 2-5 суток в 5-8% забуференном растворе муравьиной кислоты при ежедневной смене декальцинирующего раствора и контроле полноты декальцинации, при этом соотношение образец:декальцинирующий раствор составляет 1:20.

К отличиям предлагаемого способа также относится прием повторного помещения образца костной ткани в спиртовой раствор молекулярного фиксатора на 6-12 часов, который осуществляют после завершения декальцинации и промывки образца водой.

Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию изобретения «новизна».

Отличительные приемы заявляемого способа обеспечивают сохранность гистологических структур кости и окружающих тканей, сохранность антигенных эпитопов, а также позволяют снизить трудоемкость и сократить сроки изготовления препарата. Так, сроки декальцинации компактной кости мелких лабораторных животных (мышей, крыс) составляют 2-4 суток, кроликов - 4-5 суток, фрагментов костной ткани человека - 4-5 суток. При этом исключается токсическое воздействие формалина на исследователя.

Заявляемый способ обеспечивает достижение усматриваемого заявителем технического результата, а именно - обеспечение сохранности гистологических структур кости и окружающих тканей, снижение трудоемкости и сокращение сроков изготовления препаратов.

Следовательно, заявляемый способ позволяет получить препараты высокого качества, пригодных как для рутинного гистологического исследования, так и для проведения иммуногистологических исследований. Кроме этого исключается применение высокотоксичного формалина.

Изложенное позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию «изобретательский уровень».

Способ, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в медицине, ветеринарии и биологии. Возможность его осуществления подтверждена описанными в заявке приемами и средствами.

Вышеизложенное дает основание считать, что заявляемое техническое решение соответствует критерию изобретения «промышленная применимость».

Осуществление заявляемого способа поясняется примером конкретного выполнения. Приведенный ниже пример служит для иллюстрации, но не ограничивает данное изобретение.

Образцы костной ткани фиксируют спиртовым раствором молекулярного фиксатора FineFix (280 мл FineFix+720 мл 96° спирта) в течение 24 часов. Затем без отмывки образцы помещают в индивидуальные хорошо закрывающиеся емкости в 5%-ный забуференный раствор муравьиной кислоты. Концентрированный раствор декальцинатора, так называемый матричный раствор, готовят из расчета 40 г лимоннокислого натрия, 100 мл 90% раствора муравьиной кислоты, 300 мл дистиллированной воды; перед употреблением раствор доводят дистиллированной водой до получения 5-8% раствора муравьиной кислоты. Для каждого образца соотношение образец:декальцинирующий раствор составляет 1:20.

Ежедневно оценивают полноту декальцинации кальций-оксалатным методом (3 мл использованной декальцинирующей жидкости, довести рН до 7.0 концентрированным (25%) раствором аммиака, затем добавить 5 мл насыщенного раствора оксалата аммония, хорошо взболтать, оставить на 30 мин, если жидкость останется прозрачной - декальцинация завершена). При наличии кальция в использованном декальцинирующем растворе образцы помещают в свежую порцию декальцинатора.

После завершения декальцинации проводят промывку образцов водой в течение 5 минут и повторно помещают в спиртовой раствор FineFix на 12 часов.

Затем проводят дегидратацию в спиртах с возрастающей концентрацией, начиная с 70° раствора и заканчивая 100° спиртом. Заливку в парафин осуществляют по общепринятой методике (Микроскопическая техника / под ред. Саркисов Д.С., Петров Ю.Л. - М.: Медицина, 1996. - С.467).

Предлагаемым способом изготовлено 162 блока образцов костной ткани. Получены высококачественные гистологические препараты как при применении рутинных методов окрашивания (окрашивание гематоксилин-эозином), так и при применении иммуноморфологических методов окрашивания.

При приготовлении препарата костной ткани используют набор, содержащий молекулярный фиксатор FineFix на спиртовой основе, содержащий FineFix и 96° спирт в соотношении 1:2,5, концентрированный раствор декальцинацинатора и рабочие растворы для контроля полноты декальцинации: 25% раствор аммиака и насыщенный раствор оксалата аммония.

Сущность предлагаемого способа поясняется фигурами - гистологическими препаратами костной ткани, полученными по предлагаемому способу.

Так, на фиг.1 показан гистологический препарат кости, окрашенный гематоксилин-эозином. Показана сохранность структур кости и окружающих тканей: А - мышцы, В - надкостница, С - кость, D - костный мозг, Е - хрящ, увеличение 40х.

На фиг.2 показано окрашивание клеток костного мозга в декальцинированной кости иммуногистохимическим методом на карбоангидразу. Использованы первичные антитела СА2, Epitomics® каталожный №5204-1. Продемонстрировано хорошее качество окрашивания. F - ярко окрашенные остеокласты, D - кость, увеличение 400х.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить препараты костной ткани, пригодные как для гистологического, так и для иммуноморфологического исследования. При этом костные и окружающие ткани сохраняют свою структуру, сохраняются антигенные эпитопы, отсутствует использование высокотоксичных компонентов.

1. Способ приготовления препарата костной ткани, включающий фиксацию образца, декальцинацию, промывание водой, дегидратацию в спиртовых растворах и заливку в парафин, отличающийся тем, что фиксацию образца проводят в течение 24 ч в молекулярном фиксаторе FineFix на спиртовой основе, содержащем FineFix и 96%-ный спирт в соотношении 1:2,5, декальцинацию осуществляют в течение 2-5 суток в 5-8% забуференном растворе муравьиной кислоты при ежедневной смене декальцинирующего раствора и контроле полноты декальцинации, при этом соотношение образец:декальцинирующий раствор составляет 1:20, после завершения декальцинации проводят промывку образца водой и до стадии дегидратации повторно помещают образец в спиртовой раствор молекулярного фиксатора FineFix на 6-12 ч.

2. Набор для приготовления препарата костной ткани, характеризующийся тем, что он содержит молекулярный фиксатор FineFix на спиртовой основе, концентрированный раствор декальцинатора, изготовленный из расчета 40 г лимоннокислого натрия, 100 мл 90%-ного раствора муравьиной кислоты, 300 мл дистиллированной воды и рабочие растворы для контроля полноты декальцинации: насыщенный раствор оксалата аммония и 25%-ный водный раствор аммиака.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицины и биологии и может быть использовано при изготовлении гистологических препаратов в лабораторных условиях. Состав для заключения гистологических препаратов включает синтетическую смолу, растворитель и вспомогательный компонент.

Изобретение относится к сварке, в частности к способам создания напряженного состояния в металлических образцах преимущественно из углеродистых и низколегированных сталей, и может быть использовано для тарировки и проверки существующих методов и оборудования для определения напряженного состояния в металлических конструкциях.
Изобретение относится к получению и подготовке образцов для исследования и может быть использовано при гистологических исследованиях биологических образцов тканей, взятых у человека или животных при хирургических вмешательствах или при аутопсии.

Изобретение относится к области металловедения, а именно к способу контроля структурного состояния закаленных низкоуглеродистых сталей. Способ заключается в том, что предварительно готовят образец прямоугольной формы, выполняют косой срез на образце под углом 15-25° от нижнего основания к верхнему, принимая за основание длину образца.

Изобретение относится к области стендовых испытаний авиационных газотурбинных двигателей и предназначено для отбора и точной комплексной оценки загрязненности проб воздуха (подаваемого в систему кондиционирования кабины пилота воздушного судна), отбираемого из компрессора газотурбинного авиационного двигателя (ГТД) при его стендовых испытаниях, и дальнейшего газохроматографического анализа проб на содержание вредных примесей.

Пробоотборник относится к устройству для взятия проб в жидком и текучем состоянии, а именно к пробоотборникам для полуавтоматического отбора проб по всей высоте резервуара с нефтепродуктами.
Изобретение относится к области медицины, а именно к патоморфологической диагностике. Для прогнозирования пятилетней выживаемости пациенток с инвазивным раком молочной железы определяют индекс дисперсии тканевых структур, как разность между максимальным и минимальным значениями числа раковых структур и/или долей паренхиматозного или стромального компонента при микроскопии на малом увеличении (100x) деленную на количество полей зрения, в которых просчитывались эти значения.

Изобретение относится к нефтяной промышленности и может найти применение при отборе проб жидкости из трубопровода. Устройство включает пробозаборную трубку, смонтированную в трубопроводе перпендикулярно движению потока и имеющую входное отверстие щелевидной формы со стороны движения потока.

Изобретение относится к контрольно-измерительной технике, а именно к переработке сыпучих материалов, в том числе содержащих наноструктурированные компоненты, и может быть применено в химической, строительной, пищевой, фармацевтической, радиоэлектронной и других отраслях промышленности.

Изобретение относится к сельскохозяйственному производству, а именно к устройству для отбора проб силоса. Пробоотборник содержит зонд с заостренной режущей кромкой в нижней части, фланец с фаской в верхней, к которому соосно прикреплена штанга меньшего диаметра с мерной шкалой, и извлекатель пробы.

Изобретение относится к офтальмологии. Раствор для хранения роговицы содержит смесь биологических сред M199 и DMEM, хондроитина сульфат, L-аланил-L-глутамин, 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту (HEPES), пируват натрия, β-гидроксибутират натрия, гентамицина сульфат, амфотерицин В, 2,3,5,7,8-пентагидрокси-6-этилнафталиндион-1,4 (эхинохром А) и гидроксиэтилкрахмал при следующем соотношении компонентов, мас.%: среда M199 0,64; среда DMEM 0,447; гидроксиэтилкрахмал 5-10; хондроитина сульфат 2,5; эхинохром А 0,001-0,01; L-аланил-L-глутамин 0,05425; буфер HEPES 0,5958; пируват натрия 0,0055; β-гидроксибутират натрия 0,151; гентамицина сульфат 0,01; амфотерицин В 0,0000250; дистиллированная вода до 100.

Изобретение относится к области криобиологии, клеточной биологии, морской биотехнологии и гидробиологии. Проводят обработку клеток морских микроводорослей криопротекторной смесью, содержащей проникающий и непроникающий криопротекторы и питательную среду.
Изобретение относится к медицине. Проводят получение донорской крови, смешивание с гемоконсервантом глюцир в соотношении 4:1, разделение донорской крови на плазму и эритроцитную массу с последующим хранением эритроцитной массы в течение 30 суток при t=+4°С.
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу получения минерализованного костного матрикса. Способ получения минерализованного костного матрикса, включающий механическую очистку губчатой кости от хрящевой ткани, перфорацию кости спицей, далее кость последовательно обрабатывают раствором натрия хлорида и твина-100, раствором перекиси водорода, смесью хлороформ-этанол, перемешивают, объем всех используемых растворов составляет не менее 5 объемов губчатой кости, далее обрабатывают спирт-эфирной смесью, перемешивают, все перемешивания проводят на магнитной мешалке, далее центрифугируют и проветривают на воздухе, затем костные фрагменты замораживают, лиофильно высушивают и стерилизуют, при определенных условиях.
Изобретение относится к области медицины, а именно инфектологии и патологической анатомии, и может быть использовано для диагностики телэнцефального глиоза (ТГ) у детей с врожденными инфекциями.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. .

Изобретение относится к сельскому хозяйству. .
Изобретение относится к медицине. .

Единица дозирования в форме прессованной таблетки для замедленного высвобождения средства против насекомых содержит испаряющееся средство против насекомых и инертную твердую основу. Твердая основа содержит двухкомпонентную систему, включающую материал для придания объема и материал, обеспечивающий пористость. Материал для придания объема выбран из группы наполнителей прямого прессования. Материал, обеспечивающий пористость, является карбонатом или бикарбонатом. Устройство подачи средства против насекомых содержит емкость для средства против насекомых. Для получения единицы дозирования ингредиенты смешивают и таблетируют при температуре выше температуры плавления средства против насекомых. Дозатор средства против насекомых содержит единицу дозирования в качестве единственного источника средства против насекомых. Состав находится в форме таблетки, помещенной рядом с нагревателем. Устройство содержит вилку, которая обеспечивает электрическое соединение с нагревателем, и колпак для таблетки, содержащий кожух и крышку. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 пр.
Наверх